右歸丸治療功能性便秘大鼠胃腸動力學和神經(jīng)遞質(zhì)、水通道蛋白3的影響

朱波 楊艷 蘇仁意

摘要 目的：觀察右歸丸對功能性便秘大鼠胃腸動力的影響，同時探討其腸神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺（5-HT）、一氧化氮（NO）、腸內(nèi)P物質(zhì)（SP）、血管活性腸肽（VIP）以及結(jié)腸組織水通道蛋白3（AQP3）濃度的變化。方法：選取60只功能性便秘模型大鼠并將其隨機分為空白組、模型組以及干預(yù)組，每組20只。其中模型組及干預(yù)組大鼠接受復(fù)方地芬諾酯混懸液灌胃制備功能性便秘模型，隨后對干預(yù)組大鼠進行右歸丸懸濁液灌胃，共給藥20 d。用活性炭進行灌胃計算各組胃排空率、小腸推進率;酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）檢測各組大鼠外周血腸神經(jīng)遞質(zhì)SP、NO、5-HT、VIP水平變化;免疫蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）法觀察各組結(jié)腸組織AQP3表達變化。結(jié)果：模型組及干預(yù)組大鼠造模開始后逐漸出現(xiàn)精神萎靡、喜臥、食欲減退、糞便量少、便質(zhì)干硬等癥狀，甚至部分大鼠出現(xiàn)小便減少。經(jīng)過干預(yù)后大鼠上述癥狀逐漸改善，甚至出現(xiàn)部分大鼠癥狀消失。模型組及干預(yù)組大鼠的胃排空率及小腸推進率明顯減弱，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中干預(yù)組大鼠的胃排空率及小腸推進率明顯較模型組快，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型組及干預(yù)組大鼠血清SP、VIP水平降低，NO及5-HT升高，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中干預(yù)組優(yōu)于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。4）模型組及干預(yù)組大鼠結(jié)腸組織AQP3表達明顯升高，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中干預(yù)組大鼠較模型組水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論：功能性便秘的發(fā)生可能與腸神經(jīng)遞質(zhì)及水通道蛋白的異常有關(guān)，右歸丸治療功能性便秘可能通過調(diào)節(jié)SP、NO、5-HT、VIP及AQP3水平實現(xiàn)。

關(guān)鍵詞 功能性便秘;大鼠模型;胃排空率;小腸推進率;5-羥色胺;一氧化氮;腸內(nèi)P物質(zhì);血管活性腸肽;水通道蛋白3

Abstract Objective：To observe the effects of Yougui Pills on gastrointestinal motility in rats with functional constipation，and to explore the concentration changes of intestinal neurotransmitters SP，NO，5-HT and VIP，as well as aquaporin 3（AQP3）in colon tissue.Methods：A total of 60 rats with functional constipation were randomly divided into blank group，model group and intervention group，with 20 rats in each group.The rats in the model group and the intervention group were given compound diphenoxylate suspension by gavage to prepare functional constipation models，and then the rats in the intervention group were given Yougui Pills suspension by gavage for 20 days.Gastric emptying rate and small intestinal propulsion rate in each group were calculated by gavage with activated carbon，levels of intestinal neurotransmitters SP，NO，5-HT and VIP in peripheral blood of rats were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），and expression of AQP3 in colon tissue of rats in each group was observed by Western blotting.Results：1）After the modeling，rats in the model group and the intervention group began to develop symptoms of listlessness，liking to lie down，loss of appetite，less fecal volume，dry stool，and even less urine in some rats.After the intervention，the above symptoms of rats were gradually improved，and symptoms of some rats disappeared. 2）The gastric emptying rate and small intestinal propulsion rate of the model group and the intervention group were significantly lower than those of the blank group，with statistically significant difference（P<0.05）.The gastric emptying rate and small intestinal propulsion rate of the intervention group were significantly faster than those of the model group，with statistically significant difference（P<0.05）. 3）In the model group and the intervention group，the levels of serum SP and VIP were decreased and the levels of NO and 5-HT were increased，compared with those in the blank group，with statistically significant difference（P<0.05），and those in the intervention group were superior to those in the model group，with statistically significant difference（P<0.05）. 4）The expression of AQP3 in colon tissue of the model group and the intervention group was significantly higher than that of the blank group，with statistically significant difference（P<0.05），and the level of AQP3 in the intervention group was lower than that of the model group，with statistically significant difference（P<0.05）.Conclusion：The occurrence of functional constipation may be related to abnormal intestinal neurotransmitter and aquaporin.Yougui Pills may be used to treat functional constipation by regulating the levels of SP，NO，5-HT，VIP and AQP3.

Key Words Functional constipation; Rat model; Gastric emptying rate; Small intestinal propulsion rate; SP; NO; 5-HT; VIP; AQP3

中圖分類號：R289.4;R574 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.07.011

功能性便秘是以排便次數(shù)、便量減少，便質(zhì)干結(jié)或排便費力為表現(xiàn)的臨床征候群，是消化道常見的疾病之一[1]。現(xiàn)代研究顯示腸神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)是導(dǎo)致功能性便秘的主要病理變化。5-羥色胺（5-HT）、一氧化氮（NO）、腸內(nèi)P物質(zhì)（SP）、血管活性腸肽（VIP）是調(diào)節(jié)腸道功能的重要神經(jīng)遞質(zhì)，可發(fā)揮興奮或抑制作用對腸道運動進行調(diào)節(jié)[2-3];此外，腸道水液代謝紊亂亦是導(dǎo)致功能性便秘的核心原因，AQPs是水分子生物膜的重要蛋白，其中AQP3是AQPs重要成員，對機體各部分的水分吸收、液體分泌及細胞內(nèi)外的水平衡功能有重要調(diào)節(jié)作用[4-5]。因此SP、NO、5-HT、VIP以及AQP3的水平改變對功能性便秘有重要監(jiān)測功能。

功能性便秘屬于中醫(yī)“便秘”的范疇，有虛實之分。臨床亦虛癥為多見，好發(fā)于中老年人，腎氣虧虛致大腸失于溫煦，推動無力導(dǎo)致傳導(dǎo)失司而出現(xiàn)此病，因此臨床治療多以溫補腎陽為則[6-7]。右歸丸出自《景岳全書》，基于“陰中求陽”的理論所創(chuàng)，具有溫補腎陽，填精益髓之功效，主治腎陽不足引起的諸癥，臨床亦有其有效治療功能性便秘的報道[8]，但對其作用機制有待進一步探討。本研究擬從腸神經(jīng)遞質(zhì)及水通道蛋白變化與腎陽虛之間的關(guān)系著手，以動物模型為載體，探討右歸丸的科學內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取健康雄性SD大鼠60只。所有大鼠均由中國上海SLAC實驗動物有限責任公司提供（合格證號：SCXK（瀘）2007—0005），于實驗動物中心適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后體質(zhì)量達（300±20）g進行實驗研究。食物和水在整個實驗過程中均由實驗動物自由索取。實驗經(jīng)成都中醫(yī)藥大學動物管理制度和使用委員會批準而進行，實驗過程中動物的處理均嚴格按照國際道德準則和國家健康指南關(guān)于維護和使用實驗動物先關(guān)條例進行。

1.1.2 藥物 右歸丸（濃縮丸，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，國藥準字Z11021040）。右歸丸混懸液制備：將右歸丸完全溶解于雙蒸水中，參照成人的體質(zhì)量及劑量，根據(jù)《藥理實驗方法學》中換算動物劑量折算方法將右歸丸配置成含藥0.243 g/mL的混懸液[2]，備用。

1.1.3 試劑與儀器 大鼠SP Elisa試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，產(chǎn)品編號FA021572），大鼠NO ELISA試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，產(chǎn)品編號FA02106B），大鼠5-HT ELISA試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，產(chǎn)品編號YM-S2070），大鼠VIP ELISA試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，產(chǎn)品編號YM-S2810），AQP3抗體（Abcan公司，產(chǎn)品編號ab150561）。

高速冷凍離心機，轉(zhuǎn)膜儀，凝膠成像系統(tǒng)，聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴增儀（美國），切片機（美國），酶標儀（美國Thermo labsystem公司），脫色搖床（美國Thermo labsystem公司）及PL 203型電子天平（瑞士METTLER TOLEDO）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 選取60只大鼠并隨機分為空白組、模型組及干預(yù)組，每組20只。

參照文獻[9]中的造模方法，具體如下：將動物禁食12 h，以10 mL/kg比例對模型組及干預(yù)組大鼠進行復(fù)方地芬諾酯混懸液灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃4周。當大鼠出現(xiàn)食欲減退、精神萎靡、大便干結(jié)、大便粒形時提示造模成功。

1.2.2 給藥方法 干預(yù)組：大鼠接受功能性便秘模型制備后予右歸丸混懸液灌胃給藥干預(yù)，連續(xù)灌胃20 d，1次/d，每次2 mL/200 g。

模型組：大鼠接受功能性便秘模型制備后接受右歸丸組同體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃20 d?？瞻捉M：不接受造模制備，接受右歸丸組同體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃20 d。

1.2.3 檢測指標與方法 大鼠一般癥狀：造模結(jié)束后每隔4天常規(guī)記錄大鼠體質(zhì)量、排便情況以及抓取激惹反應(yīng)。

胃排空率、小腸推進率：將各組大鼠禁食12 h，每組隨機抓取3只大鼠，按照0.1 mL/10 mg的比例計算活性炭劑量，將計算好的活性炭進行灌胃，隨后處死大鼠取胃稱重。將胃置于冰山后從胃大彎處剪開胃體，用生理鹽水沖洗胃內(nèi)容物后再次稱重，計算胃排空率。再剪取腸管測量小腸總長度，從幽門至活性炭前沿的距離視為腸管內(nèi)推進距離，計算小腸推進率。

SP、NO、5-HT、VIP水平：將各組大鼠禁食12 h，每組隨機抓取3只大鼠，按照0.3 mL/kg的比例腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，進行腹主動脈采血，迅速離心后取上清液，OPD顯色后采用492 nm波長，TMB反應(yīng)產(chǎn)物檢測需要450 nm波長。檢測時一定要首先進行空白孔系統(tǒng)調(diào)零。用測定標本孔的吸收值與一組陰性標本測定孔平均值的比值（P/N）表示。

結(jié)腸組織水通道蛋白3（AQP3）測定：將各組大鼠禁食12 h，每組隨機抓取3只大鼠，按照0.3 mL/kg的比例腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，冰上快速取出結(jié)腸，取收集的結(jié)腸組織200 mg，加入1 mL 1%PMSF的蛋白裂解液中，冰里勻漿靜置30 min。4 ℃、12 000 r/min條件下，離心5 min。提取上清液，BCA法測蛋白濃度，將樣本放入-80 ℃冰箱中備用。將各標本的上樣量加入蛋白凝膠中進行電泳，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）中，使用TBST液在搖床上進行洗滌3次，洗10 min/次，室溫下封閉2 h，隨后進行一抗孵育過夜，再次用TBST液洗滌3次，洗10 min/次。隨后將膜置于稀釋過生物辣根過氧化酶HRP標記的二抗中，室溫條件下孵育2 h，加入ECL發(fā)光劑顯影，測定各條帶的吸光度，分別與內(nèi)參條帶的灰度值比較，各條帶/內(nèi)參的灰度值作為樣本蛋白表達的相對表達量，并統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SAS 9.4統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用方差分析，非正態(tài)分布比較采用非參數(shù)檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況變化 模型組及干預(yù)組大鼠造模開始后逐漸出現(xiàn)精神萎靡、喜臥、食欲減退、糞便量少、便質(zhì)干硬等癥狀，甚至部分大鼠出現(xiàn)小便減少。經(jīng)過干預(yù)后大鼠上述癥狀逐漸改善，甚至出現(xiàn)部分大鼠癥狀消失。

2.2 各組胃排空率及小腸推進率比較 模型組及干預(yù)組大鼠的胃排空率及小腸推進率明顯減弱，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中干預(yù)組大鼠的胃排空率及小腸推進率明顯較模型組快，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.3 各組SP、NO、5-HT、VIP水平變化 模型組及干預(yù)組大鼠血清SP、VIP水平降低，NO及5-HT升高，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中干預(yù)組優(yōu)于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.4 各組AQP3蛋白表達變化 模型組及干預(yù)組大鼠結(jié)腸組織AQP3表達明顯升高，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中干預(yù)組大鼠較模型組水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1、表3。

3 討論

功能性便秘屬于中醫(yī)學“便秘”“脾約”“腸結(jié)”等范疇，與肝脾腎關(guān)系密切。腎氣虧虛津液生化乏源[10-11]，正如《景岳全書·秘結(jié)》中描述：“秘結(jié)證，凡屬老人、虛人、陰臟人及產(chǎn)后、病后、多汗后，或小水過多，或亡血失血大吐大下之后，多有病為燥結(jié)者，蓋此非氣血之虧，即津液之耗。凡此之類，皆須詳察虛實，不可輕用芒硝、大黃、巴豆、牽牛、芫花、大戟等藥，及承氣、神芎等劑。雖今日暫得痛快，而重虛其虛，以致根本日竭，則明日之結(jié)，必將更甚，愈無可用之藥矣”。由此溫腎助陽是功能性便秘的主要手段[12-13]。右歸丸有溫補腎陽，填精止遺的功效，主治腎陽不足諸證。中藥復(fù)方是中醫(yī)學發(fā)揮臨床療效的應(yīng)用形式，配伍中藥復(fù)方的靈魂，本方由熟地黃、附子（炮附片）、肉桂、山藥、山茱萸（酒炙）、菟絲子、鹿角膠、枸杞子、當歸、杜仲（鹽炒）組成，方中以附子、肉桂、鹿角膠為君藥，溫補腎陽，填精補髓。臣以熟地黃、枸杞子、山茱萸、山藥滋陰益腎，養(yǎng)肝補脾，陰中求陽。佐以菟絲子、杜仲補益肝腎，強筋壯骨;當歸補血養(yǎng)肝，諸藥配合，共奏溫補腎陽，填精補髓之功。現(xiàn)代藥理研究顯示，山茱萸提取物可以升高提高腎陽虛大鼠睪酮（T）含量，通過對下丘腦-垂體-性腺軸的影響達到治療腎陽虛的目的;杜仲提取物可以糾正腎陽虛和脾腎兩虛型大鼠外周血T3、甲狀腺素（T4）水平;當歸提取物能夠降低氫化可的松造成“陽虛”小鼠的淋巴細胞凋亡率，提高其機體免疫力，負反饋于HPA軸，改善其病理變化[14-18]。本研究對復(fù)方地芬諾酯混懸液灌胃制備功能性便秘模型，結(jié)果顯示，加用右歸丸組大鼠不論是在排便狀況，還是改善胃排空率及小腸推進率方面均有明顯改善，這進一步佐證右歸丸對功能性便秘有理想療效。

在對作用機制的探究中我們對腸神經(jīng)遞質(zhì)進行檢測，腸神經(jīng)系統(tǒng)是獨立調(diào)節(jié)腸道功能的系統(tǒng)，其中SP、NO、5-HT、VIP是重要的腸神經(jīng)遞質(zhì)，SP可通過抑制胃腸道腺體分泌黏液而發(fā)揮刺激腸道運動的作用;NO可直接松弛腸道平滑肌，對腸黏膜的血運及腺體分泌功能進行直接調(diào)節(jié)，從而影響腸道排便功能;5-HT水平上調(diào)可促進腸道蠕動加快，改善腸壁的血液循環(huán)，臨床及動物研究均顯示5-HT水平與腸道動力及感覺異常有正相關(guān)[19-20]。VIP是機體質(zhì)量要肽能神經(jīng)遞質(zhì)，可直接作用于腸道平滑肌致其松弛，同時還有舒張血管的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，加用右歸丸后大鼠血清SP、VIP水平上調(diào)，NO及5-HT水平降低，這提示右歸丸改善大鼠便秘癥狀可能與介導(dǎo)上述神經(jīng)遞質(zhì)水平變化有關(guān)。此外，我們還對3組大鼠的AQP3水平進行檢測，結(jié)果顯示右歸丸可明顯上調(diào)大鼠結(jié)腸組織AQP3的表達。AQP3廣泛分布于腎臟及結(jié)腸，AQP3在結(jié)腸中可促使水液的吸收，同時可增強機體對尿素和甘油的轉(zhuǎn)運，有研究顯示AQP3的表達下降可減緩水分子從腸腔進入血管，增加了腸腔內(nèi)水分子的含量，改善了腸腔內(nèi)分泌環(huán)境，改善便秘癥狀[21-22]。本研究顯示，功能性便秘模型大鼠結(jié)腸組織的AQP3水平有所提升，經(jīng)過右歸丸干預(yù)后AQP3水平下降，這提示右歸丸有效治療功能性便秘與下調(diào)AQP3水平有關(guān)。

功能性便秘的發(fā)生可能與腸神經(jīng)遞質(zhì)及水通道蛋白的異常有關(guān)，右歸丸治療功能性便秘可能通過調(diào)節(jié)SP、NO、5-HT、VIP及AQP3水平實現(xiàn)，這也進一步證實了中醫(yī)藥作用確實存在多靶點的特性。

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（2018-10-29收稿 責任編輯：楊覺雄）