參附益心方對(duì)缺氧原代心肌細(xì)胞活性氧和能量代謝的影響

李彬 王新陸 謝世陽(yáng) 高原 王幼平 崔琳 王永霞 朱明軍

摘 要 目的：觀察參附益心方對(duì)缺氧原代心肌細(xì)胞活性氧（ROS）和能量代謝的影響。方法：新生SD大鼠原代心肌細(xì)胞經(jīng)分離、培養(yǎng)、鑒定后，隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（輔酶Q10，0.1 mmol/L）和參附益心方低、高劑量組（0.25、0.5 mg/mL）。除正常組外，其余各組細(xì)胞均于5%O2、5%CO2、90%N2條件下培養(yǎng)6 h以復(fù)制缺氧損傷模型。缺氧6 h后，采用ROS探針和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)各組細(xì)胞及其線粒體中ROS的含量，采用熒光素酶發(fā)光法和Western blotting法分別檢測(cè)各組細(xì)胞中腺苷三磷酸（ATP）的含量以及肌酸激酶（CK）蛋白的表達(dá)水平，并使用透射電子顯微鏡觀察各組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果：與正常組比較，模型組缺氧原代心肌細(xì)胞及其線粒體中ROS的表達(dá)均明顯增加，其ROS含量均顯著升高，ATP的含量以及CK蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）；細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體腫脹，線粒體嵴溶解甚至消失，損傷明顯。與模型組比較，各給藥組缺氧原代心肌細(xì)胞及其線粒體中ROS的表達(dá)均有所減少，陽(yáng)性對(duì)照組和參附益心方高劑量組缺氧原代心肌細(xì)胞中ROS的含量以及各給藥組缺氧原代心肌細(xì)胞線粒體中ROS的含量均顯著降低，陽(yáng)性對(duì)照組和參附益心方高劑量組缺氧原代心肌細(xì)胞中ATP的含量以及各給藥組缺氧原代心肌細(xì)胞中CK蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）；陽(yáng)性對(duì)照組和參附益心方高劑量組缺氧原代心肌細(xì)胞損傷明顯減輕。

結(jié)論：參附益心方對(duì)缺氧原代心肌細(xì)胞具有一定的改善作用，可下調(diào)細(xì)胞及線粒體中ROS的表達(dá)，并可改善其能量代謝。

關(guān)鍵詞 參附益心方；缺氧損傷； 原代心肌細(xì)胞；活性氧；能量代謝

Effects of Shenfu Yixin Decoction on Reactive Oxygen Species and Energy Metabolism of Primary Hypoxic Cardiomyocytes

LI Bin1，2，WANG Xinlu2，XIE Shiyang3，GAO Yuan3，WANG Youping3，CUI Lin3，WANG Yongxia2，ZHU Mingjun2（1. Graduate Division， the First Affiliated Hospital of Henan University of TCM， Zhengzhou 450099， China； 2. Center of Cardiology， the First Affiliated Hospital of Henan University of TCM， Zhengzhou 450099， China； 3. Central Laboratory， the First Affiliated Hospital of Henan University of TCM， Zhengzhou 450099， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To observe the effects of Shenfu yixin decoction on reactive oxygen species （ROS） and energy metabolism in primary hypoxic cardiomyocytes. METHODS： After isolation， culture and identification， primary cardiomyocytes of neonatal SD rats were randomly divided into normal group， model group， positive control group （coenzyme Q10， 0.1 mmol/L） and Shenfu yixin decoction low-dose and high-dose groups （0.25， 0.5 mg/mL）. Except for normal group， other groups were cultured with 5%O2， 5%CO2 and 90%N2 for 6 h to induce hypoxic injury model. After 6 hours of hypoxia， ROS contents in cardiomyocytes and mitochondria of each group were detected by ROS probe and flow cytometry. Luciferase luminescence and Western blotting were used to detect ATP content and CK protein expression of each group. Transmission electron microscope was used to observe ultrastructure of cardiomyocytes in each group. RESULTS： Compared with normal group， the expression of ROS in primary hypoxic cardiomyocytes and mitochondria as well as the content of ROS were increased significantly， while the content of ATP and expression levels of CK protein were decreased significantly （P<0.05）； there were swelling of endoplasmic reticulum and mitochondria， dissolution or even disappearance of mitochondrial ridge， obvious cardiomyocytes injury. Compared with model group， the expression of ROS in primary hypoxic cardiomyocytes and mitochondria of administration groups， the contents of ROS in primary hypoxic cardiomyocytes of positive control group and Shenfu yixin decoction high-dose group as well as the content of ROS in primary hypoxic cardiomyocytes mitochondria of administration groups were all decreased significantly， while ATP contents in primary hypoxic cardiomyocytes of positive control group and Shenfu yixin decoction high-dose group as well as expression levels of CK protein in primary hypoxic cardiomyocytes of administration groups were all increased significantly （P<0.05）. The primary hypoxic cardiomyocytes injury was relieved significantly in positive control group and Shenfu yixin decoction high-dose group. CONCLUSIONS： Shenfu yixin decoction can improve primary hypoxic cardiomyocytes， down-regulate the expression of ROS in cardiomyocytes and mitochondria and also improve its energy metabolism.

KEYWORDS Shenfu yixin decoction； Hypoxic injury； Primary cardiomyocytes； Reactive oxygen species； Energy metabolism

慢性心力衰竭（CHF）因其發(fā)病率和病死率均較高，已成為21世紀(jì)最重要的心血管疾病。2011-2014年流行病學(xué)調(diào)查顯示，美國(guó)20歲以上心力衰竭患者增長(zhǎng)到650萬(wàn)；預(yù)計(jì)到2030年，美國(guó)18歲以上心力衰竭患者將增加46%，達(dá)到800萬(wàn)[1]。我國(guó)成年人心力衰竭患病率為0.9%，即有450萬(wàn)成年心力衰竭患者[2]。有研究表明，心肌能量代謝失衡在心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[3]。其中，線粒體是細(xì)胞內(nèi)最重要的能量代謝場(chǎng)所，并直接參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡等過(guò)程[4]。細(xì)胞中活性氧（ROS）等自由基主要由線粒體產(chǎn)生，高濃度的ROS會(huì)觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成氧化損傷，導(dǎo)致線粒體功能的喪失，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡[5-6]。

參附益心方是我校孫建芝教授辨治CHF的經(jīng)驗(yàn)方。前期基礎(chǔ)研究證實(shí)，該方可改善CHF模型大鼠心功能，降低其血清心房鈉尿肽（ANP）、B型腦鈉肽（BNP）和心肌血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）水平，抑制心肌纖維化，具有延緩或改善心肌重塑的作用[7-10]，但該方對(duì)ROS和能量代謝的影響尚未明確。為此，本研究利用缺氧條件建立原代心肌細(xì)胞損傷模型，觀察參附益心方對(duì)其ROS和能量代謝的影響，以期為參附益心方治療CHF提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

RCO-3000TVBB型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)REVCO公司）；CK40型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；JEM- 1400型透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）；DMI3006型倒置熒光顯微鏡、EM UC7型全自動(dòng)超薄切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；Airtech型生物超凈工作臺(tái)（江蘇蘇凈集團(tuán)）；MK3型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；ChemiDoc XRS+型化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；TDL-50B型低速臺(tái)式大容量離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；JA203型電子分析天平（上海?？惦娮觾x器廠）。

1.2 藥品與試劑

參附益心方浸膏（山東步長(zhǎng)制藥有限公司，批號(hào)：131101，規(guī)格：1 g約相當(dāng)于生藥總量9.5 g）；輔酶Q10片[陽(yáng)性對(duì)照，衛(wèi)材（中國(guó)）藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H10930021，規(guī)格：10 mg]；心肌細(xì)胞消化液、DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）、ROS探針[2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）]試劑盒、水溶性封片劑、CCK-8試劑、十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TBST）溶液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為T(mén)1320、12100、P1020、CA1410、S2150、CA1210、S8010、T1085）；胎牛血清（FBS，以色列Biological Industries公司，批號(hào)：04-001-1A）；胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：27250018）；溴脫氧尿核苷（Brdu）、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)分別為B9285、D9542）；兔心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）多克隆抗體、SABC-FITC雙標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)分別為BM1765、SA1064）；0.4%臺(tái)盼藍(lán)染料（華美生物工程有限公司，批號(hào)：C0040）；腺苷三磷酸（ATP）檢測(cè)試劑盒（瑞士Roche公司，批號(hào)：11699695001）；兔肌酸激酶（CK）多克隆抗體、兔甘油醛-3-硫酸脫氫（GAPDH）單克隆抗體（內(nèi)參）（美國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為ab108388、ab181602）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：SA00001-1）；MitoSOX試劑盒、YOYO-1染料（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)分別為M36008、Y3601）；RIPA細(xì)胞裂解液（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：OC183166）；ECL發(fā)光液（美國(guó)Millipore公司，批號(hào)：WBKLS0100）；其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)新生SD大鼠，出生1～3 d，雌雄不限，體質(zhì)量約5～6 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（豫）2015-0005]。

2 方法

2.1 藥物貯備液的制備

2.1.1 參附益心方貯備液 稱(chēng)取參附益心方浸膏0.25 g，加至DMEM高糖培養(yǎng)基10 mL中，混勻，經(jīng)0.2 μm濾器濾過(guò)后，得質(zhì)量濃度為25 mg/mL（以浸膏質(zhì)量計(jì)，下同）的參附益心方貯備液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.1.2 輔酶Q10貯備液 稱(chēng)取輔酶Q10片50 mg，碾碎，加至DMEM高糖培養(yǎng)基5.8 mL中，混勻，經(jīng)0.2 μm濾器濾過(guò)后，得濃度為10 mmol/L的輔酶Q10貯備液，備用。

2.2 原代心肌細(xì)胞的提取

取新生大鼠，于無(wú)菌條件下開(kāi)胸，取其心尖部，經(jīng)4 ℃ PBS清洗3次后，將其剪成大小約1 mm3的組織塊，加入心肌細(xì)胞消化液適量，輕輕吹打后，移至玻璃瓶中，于37 ℃水浴鍋中消化6 min，重復(fù)消化7～8次：第1次消化自然沉淀后棄去上清液；后幾次消化自然沉淀后均留取上清液，直至組織塊變?yōu)榘咨该鳌Ａ羧〉纳锨逡褐屑尤氲攘亢?0%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，輕輕吹打，以1 000 r/min離心10 min，棄去上清液，加入含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基1 mL，制成原代心肌細(xì)胞懸液，經(jīng)200目篩濾過(guò)以除去未充分消化的組織塊。

2.3 原代心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

取“2.2”項(xiàng)下原代心肌細(xì)胞懸液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中差速貼壁90 min后，吸取細(xì)胞懸液，以1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基適量，輕輕吹打。經(jīng)0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色后，于倒置顯微鏡下觀察（死細(xì)胞染色后呈藍(lán)色），計(jì)算活細(xì)胞比率，并以此為參考調(diào)整細(xì)胞濃度至4×105個(gè)/mL，接種于培養(yǎng)板中，加入Brdu適量（終濃度為0.1 mmol/L）以抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖。按上述條件培養(yǎng)48 h后，棄去上清液，細(xì)胞用不含F(xiàn)BS的DMEM高糖培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)24 h。

2.4 原代心肌細(xì)胞的鑒定

取“2.3”項(xiàng)下原代心肌細(xì)胞適量，棄去培養(yǎng)基，于4%多聚甲醛溶液中固定10～20 min，加入cTnⅠ抗體（1 ∶ 50），于4 ℃孵育過(guò)夜，隨后加入SABC-FITC雙標(biāo)記IgG抗體（1 ∶ 100），于常溫下避光孵育2 h；加入DAPI染料適量，避光染色5 min，以水溶性封片劑封孔，于倒置熒光顯微鏡下觀察、拍照（DAPI染料可將所有細(xì)胞核染成藍(lán)色，cTnⅠ則可將心肌細(xì)胞胞漿染成綠色）。取6個(gè)視野拍照，采用Image J 5.0軟件統(tǒng)計(jì)心肌細(xì)胞數(shù)（n1，即cTnⅠ染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)）及細(xì)胞總數(shù)（N1），計(jì)算心肌細(xì)胞比例（心肌細(xì)胞比例=n1/N1×100%）。當(dāng)心肌細(xì)胞比例超過(guò)85%，表明原代心肌細(xì)胞純度達(dá)到試驗(yàn)要求，可進(jìn)行后續(xù)研究。

2.5 分組、給藥與造模

取“2.3”項(xiàng)下純度達(dá)到試驗(yàn)要求的原代心肌細(xì)胞適量，隨機(jī)分為5組，即正常組、模型組（即缺氧組）、陽(yáng)性對(duì)照組（輔酶Q10，0.1 mmol/L，劑量根據(jù)本課題組前期CCK-8試驗(yàn)結(jié)果確定）和參附益心方低、高劑量組（0.25、0.5 mg/mL，劑量根據(jù)本課題組前期CCK-8試驗(yàn)結(jié)果確定）。對(duì)照組和模型組加入含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基2 mL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基2 mL，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。除正常組外其余各組細(xì)胞均于5%O2、5%CO2、90%N2條件下培養(yǎng)6 h（缺氧時(shí)間根據(jù)本課題組前期YOYO-1染色試驗(yàn)結(jié)果確定），造成缺氧損傷。正常組細(xì)胞不予任何處理，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6 h。

2.6 缺氧原代心肌細(xì)胞中ROS含量檢測(cè)

按“2.3”“2.4”項(xiàng)下方法分離、培養(yǎng)、鑒定原代心肌細(xì)胞后，再按“2.5”項(xiàng)下方法分組、給藥、造模。缺氧6 h后，吸棄各孔上清液，于室溫下以不含F(xiàn)BS的DMEM高糖培養(yǎng)基清洗2～3次，每次1 min，加入經(jīng)不含F(xiàn)BS的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋的ROS探針適量（終濃度為10 μmol/L），于37 ℃、5%CO2條件下避光孵育30 min，于室溫下以不含F(xiàn)BS的DMEM高糖培養(yǎng)基清洗2～3次，每次1 min。使用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，使用酶標(biāo)儀（激發(fā)波長(zhǎng)：488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：525 nm）檢測(cè)各孔的熒光強(qiáng)度，以此表示細(xì)胞中ROS的含量。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 缺氧原代心肌細(xì)胞線粒體中ROS含量檢測(cè)

按“2.3”“2.4”項(xiàng)下方法分離、培養(yǎng)、鑒定原代心肌細(xì)胞后，再按“2.5”項(xiàng)下方法分組、給藥、造模。缺氧6 h后，吸棄各孔上清液，于室溫下以PBS清洗2～3次，每次1 min，用不含EDTA的胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，加入MitoSOX試劑適量（終濃度為5 μmol/L），于37 ℃、5%CO2條件下避光孵育30 min，于室溫下以PBS清洗2次，每次1 min，以1 000 r/min離心5 min，細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)基調(diào)整密度至5×106個(gè)/mL，采用流式細(xì)胞儀（激發(fā)波長(zhǎng)：488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：525 nm）檢測(cè)各孔的熒光強(qiáng)度比率，以此表示細(xì)胞線粒體中ROS的含量。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 缺氧原代心肌細(xì)胞中ATP含量檢測(cè)

按“2.3”“2.4”項(xiàng)下方法分離、培養(yǎng)、鑒定原代心肌細(xì)胞后，再按“2.5”項(xiàng)下方法分組、給藥、造模。缺氧6 h后，吸棄各孔上清液，于室溫下以PBS清洗2～3次，每次1 min，采用熒光素酶發(fā)光法以酶標(biāo)儀檢測(cè)缺氧原代心肌細(xì)胞中ATP的含量。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.9 缺氧原代心肌細(xì)胞中CK蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

按“2.3”“2.4”項(xiàng)下方法分離、培養(yǎng)、鑒定原代心肌細(xì)胞后，再按“2.5”項(xiàng)下方法分組、給藥、造模。缺氧6 h后，采用Western blotting法檢測(cè)缺氧原代心肌細(xì)胞中CK蛋白的表達(dá)情況[11]。細(xì)胞經(jīng)RIPA細(xì)胞裂解液裂解后，于4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，收集上清液（即細(xì)胞總蛋白），采用Brandford法測(cè)定蛋白濃度后，煮沸變性，隨后加入適量5×SDS上樣緩沖液，置于-20 ℃冰箱保存，備用。每組取蛋白50 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，電泳結(jié)束后采用半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入相應(yīng)一抗[CK（1 ∶ 1 500）、內(nèi)參（1 ∶ 3 000）]，于4 ℃孵育過(guò)夜；TBST溶液洗膜，加入HRP標(biāo)記二抗（1 ∶ 3 000），于37 ℃恒溫?fù)u床孵育1 h，TBST溶液洗膜。以ECL發(fā)光液顯色后，置于化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)上成像，采用Image J 5.0軟件分析蛋白條帶灰度值，以相應(yīng)蛋白與內(nèi)參的灰度值之比表示該蛋白的表達(dá)水平。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.10 缺氧原代心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

按“2.3”“2.4”項(xiàng)下方法分離、培養(yǎng)、鑒定原代心肌細(xì)胞后，鑒于“2.6”～“2.9”項(xiàng)下結(jié)果，將細(xì)胞按“2.5”項(xiàng)下方法隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、參附益心方高劑量組，然后給藥、造模。缺氧6 h后，吸棄各孔上清液，于室溫下以PBS清洗2～3次，用2.5%戊二醛溶液固定4 h；PBS清洗，用1%鋨酸溶液處理2 h；PBS清洗，分別用50%、70%、80%、95%、100%的乙醇梯度脫水，再以丙酮、環(huán)氧樹(shù)脂812處理，半薄切片定位、超薄切片（厚度約70 nm），經(jīng)飽和醋酸雙氧鈾溶液染色、水洗、烘干后，于透射電子顯微鏡下觀察缺氧心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并拍照。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析或非配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 原代心肌細(xì)胞的鑒定

原代心肌細(xì)胞呈星形或梭形，相互接觸交織成網(wǎng)，有聚集生長(zhǎng)趨勢(shì)，并逐漸形成細(xì)胞簇或單層細(xì)胞。同時(shí)，細(xì)胞呈現(xiàn)同步搏動(dòng)，搏動(dòng)頻率、節(jié)律、強(qiáng)度穩(wěn)定，頻率約70～130次/min，詳見(jiàn)圖1。

3.2 參附益心方對(duì)缺氧原代心肌細(xì)胞中ROS含量的影響

與正常組比較，模型組缺氧原代心肌細(xì)胞中ROS的表達(dá)明顯增加，其ROS的含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，各給藥組缺氧原代心肌細(xì)胞中ROS的表達(dá)均有不同程度的減少，其中陽(yáng)性對(duì)照組和參附益心方高劑量組缺氧原代心肌細(xì)胞中ROS的含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳見(jiàn)圖2、表1。

3.3 參附益心方對(duì)缺氧原代心肌細(xì)胞線粒體中ROS含量的影響

與正常組比較，模型組缺氧原代心肌細(xì)胞線粒體中ROS的含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，各給藥組缺氧原代心肌細(xì)胞線粒體中ROS的含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳見(jiàn)圖3、表1。

3.4 參附益心方對(duì)缺氧原代心肌細(xì)胞中ATP含量的影響

與正常組比較，模型組缺氧原代心肌細(xì)胞中ATP的含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和參附益心方高劑量組缺氧原代心肌細(xì)胞中ATP的含量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳見(jiàn)表2。

3.5 參附益心方對(duì)缺氧原代心肌細(xì)胞中CK蛋白表達(dá)水平的影響

與正常組比較，模型組缺氧原代心肌細(xì)胞中CK蛋白的表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，各給藥組缺氧原代心肌細(xì)胞中CK蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳見(jiàn)圖4、表2。

3.6 參附益心方對(duì)缺氧原代心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

正常組原代心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞膜、線粒體胞膜完整，線粒體嵴豐富，嵴膜完整、清晰；模型組缺氧原代心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體腫脹，邊界模糊不清，線粒體嵴溶解甚至消失；陽(yáng)性對(duì)照組和參附益心方高劑量組缺氧原代心肌細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞膜表面微絨毛樣突起減少，細(xì)胞膜完整，線粒體嵴豐富，嵴膜完整，部分細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體腫脹，細(xì)胞膜完整，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，損傷較模型組明顯減輕，詳見(jiàn)圖5。

4 討論

心力衰竭是由多種病因?qū)е碌囊环N復(fù)雜的臨床綜合征，是各種心臟疾病的終末階段[12]。目前西醫(yī)常規(guī)治療CHF的靶點(diǎn)較為單一，藥物不良反應(yīng)較多；非藥物治療方法因多種因素（如適應(yīng)證、治療成本）的限制，效果也有限。而中醫(yī)治療CHF具有整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，多途徑、多靶點(diǎn)等優(yōu)勢(shì)，可用于CHF的規(guī)范化治療[13]。

中醫(yī)認(rèn)為，CHF的病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛為氣虛、陽(yáng)虛（或陰虛），標(biāo)實(shí)為血瘀、痰飲、水停，標(biāo)本俱病，虛實(shí)夾雜，其中醫(yī)證候主要為氣虛陽(yáng)虛、血瘀水停。參附益心方是河南中醫(yī)藥大學(xué)名老中醫(yī)辨治CHF的經(jīng)驗(yàn)方，具有益氣溫陽(yáng)、活血利水之功效。該方由人參、附子、桂枝、丹參、赤芍、益母草等藥材組成，其中人參益氣為君藥；附子、桂枝溫腎陽(yáng)、通心脈為臣藥；丹參、赤芍、益母草活血化瘀利水，澤瀉、車(chē)前子、豬苓、大腹皮化濕利水，葶藶子瀉肺逐飲，砂仁、大棗健脾利濕、溫補(bǔ)中焦，共為佐使之藥；諸藥共奏益氣溫陽(yáng)、活血利水之功[14]。本課題組前期研究證實(shí)，參附益心方可改善CHF模型大鼠心功能[7-10]，但其在心肌ROS和能量代謝方面的作用尚不明確。輔酶Q10可顯著改善線粒體功能，具有較強(qiáng)的抗氧化作用[15]，且亦有大量研究證實(shí)其療效[16-18]，現(xiàn)已被廣泛用于CHF的治療中。因此，本研究選用輔酶Q10作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，初步考察了參附益心方對(duì)缺氧原代心肌細(xì)胞ROS和能量代謝的影響。

已有證據(jù)表明，心臟能量代謝障礙是心肌細(xì)胞損傷的始動(dòng)環(huán)節(jié)，是引起和促進(jìn)心功能障礙發(fā)生、發(fā)展的重要因素[19]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，生物體內(nèi)90%以上的ATP都是由線粒體產(chǎn)生。該細(xì)胞器是自由基產(chǎn)生的重要場(chǎng)所，可通過(guò)氧化磷酸化反應(yīng)為細(xì)胞生命活動(dòng)提供能量，在凋亡過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的調(diào)控作用[20]。ROS屬于自由基，含有氧原子并具有極強(qiáng)的氧化能力，是細(xì)胞內(nèi)重要的氧化還原信號(hào)分子[21]。ROS生成的主要部位及其作用的主要靶點(diǎn)均位于線粒體內(nèi)，其可通過(guò)改變線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）的開(kāi)放與關(guān)閉而影響線粒體膜電位和細(xì)胞色素C的釋放，從而激活天冬氨酸特異性胱天蛋白酶等凋亡調(diào)控蛋白和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子，最終引發(fā)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡；此外，ROS還可通過(guò)激活各種死亡受體，介導(dǎo)外源性細(xì)胞凋亡[22]。ATP是細(xì)胞內(nèi)主要的高能磷酸載體，可直接為細(xì)胞供應(yīng)能量，若細(xì)胞內(nèi)ATP缺失將可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡[23]。CK作為細(xì)胞主要的能量?jī)?chǔ)備載體，當(dāng)ATP需求增加時(shí)，可快速催化磷酸肌酸與腺苷二磷酸（ADP）反應(yīng)，進(jìn)而生成ATP和肌酸，以滿足細(xì)胞的能量需求；而衰竭心臟經(jīng)CK途徑形成的能量?jī)?chǔ)備（即ATP生成量）則有所降低[24]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組缺氧原代心肌細(xì)胞及其線粒體中ROS的表達(dá)均明顯增加，其含量均顯著升高，而細(xì)胞ATP含量及CK蛋白的表達(dá)量均顯著降低，超顯微結(jié)構(gòu)亦提示心肌細(xì)胞損傷明顯。經(jīng)藥物處理后，各給藥組缺氧原代心肌細(xì)胞及其線粒體中ROS的表達(dá)均有不同程度的減少，陽(yáng)性對(duì)照組和參附益心方高劑量組缺氧原代心肌細(xì)胞中ROS的含量以及各給藥組線粒體中ROS的含量均較模型組顯著降低，陽(yáng)性對(duì)照組和參附益心方高劑量組缺氧原代心肌細(xì)胞中ATP的含量以及各給藥組缺氧原代心肌細(xì)胞中CK蛋白的表達(dá)水平均較模型組顯著升高，超顯微結(jié)構(gòu)亦提示陽(yáng)性對(duì)照組和參附益心方高劑量組細(xì)胞損傷有所減輕。這提示參附益心方可一定程度地下調(diào)缺氧原代心肌細(xì)胞及其線粒體中ROS的表達(dá)，上調(diào)缺氧原代心肌細(xì)胞中ATP含量和CK蛋白表達(dá)，減輕細(xì)胞損傷，與益氣、溫陽(yáng)類(lèi)中藥相關(guān)研究[25-26]的結(jié)論相符。

綜上所述，參附益心方對(duì)缺氧心肌細(xì)胞具有一定的改善作用，可下調(diào)細(xì)胞及線粒體中ROS的含量，并改善其能量代謝。但本研究?jī)H初步探討了該方對(duì)缺氧原代心肌細(xì)胞ROS和能量代謝的影響，其具體抗CHF的作用機(jī)制尚有待后續(xù)研究深入挖掘。

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（收稿日期：2018-06-10 修回日期：2019-01-11）

（編輯：張?jiān)拢?/p>