水稻條斑病菌內(nèi)源質(zhì)粒分析

曾晨 李康佳 尹朝群 牛祥娜 趙嘉城 朱平川 姜偉 何勇強(qiáng)

摘要：【目的】明確水稻條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola， 簡稱Xoc）內(nèi)源質(zhì)粒分布狀況、類型及其含有的主要功能基因，為下一步開展該菌與質(zhì)粒相關(guān)的毒力進(jìn)化研究、抗逆機(jī)制分析及穿梭載體構(gòu)建打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎脭?shù)據(jù)庫檢索法和質(zhì)粒分離鑒定法，調(diào)查水稻條斑病菌內(nèi)源質(zhì)粒的分布狀況;以GenBank數(shù)據(jù)庫中Xoc菌株基因組序列為研究對(duì)象，開展質(zhì)粒信息檢索，并對(duì)已發(fā)表的Xoc內(nèi)源質(zhì)粒序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析;以Xoc中國菌株菌種庫為研究對(duì)象，采用堿裂解法提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒酶切帶型分析和主要功能基因鑒定?！窘Y(jié)果】GenBank全基因組數(shù)據(jù)庫中Xoc菌株內(nèi)源質(zhì)粒檢出率為11.76%，系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明這些質(zhì)粒屬于不同的進(jìn)化分支。在257株Xoc中國菌株中，有29株菌株含有質(zhì)粒，質(zhì)粒檢出率為11.28%，帶有內(nèi)源質(zhì)粒的菌株均來自于華南稻區(qū)，且大部分來自廣西。通過質(zhì)粒酶切圖譜比較，確認(rèn)新發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒屬于9種新型Xoc內(nèi)源質(zhì)粒。按照已知Xoc內(nèi)源質(zhì)粒pXOCgx01上主要功能基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增結(jié)果表明新鑒定的Xoc質(zhì)粒含有重金屬抗性和DNA轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，但在菌株間存在明顯的多樣性?！窘Y(jié)論】部分Xoc菌株中含有一定數(shù)量的內(nèi)源質(zhì)粒，質(zhì)粒類型和所含功能基因等具有一定的多樣性，攜帶內(nèi)源質(zhì)粒的Xoc菌株有明顯地域性。

關(guān)鍵詞： 水稻條斑病菌;內(nèi)源質(zhì)粒;調(diào)查;酶切圖譜;抗逆基因

中圖分類號(hào)： S435.111.49? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）08-1718-10

Analysis of indigenous plasmids in Xanthomonas oryzae

pv. oryzicola

ZENG Chen， LI Kang-jia， YIN Chao-qun， NIU Xiang-na， ZHAO Jia-cheng，

ZHU Ping-chuan， JIANG Wei， HE Yong-qiang*

（State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources/College of Life Science and Technology， Guangxi University， Nanning? 530004， China）

Abstract：【Objective】The aim was to fully understand the distribution， types and biological function of the indigenous plasmids of Xanthomonas oryzae pv. oryzicola（Xoc）， and lay the foundation for the future study of virulence evolution analysis， mechanism of resistance and construction of shuttle vector. 【Method】The distribution of endogenous plasmids in Xoc strains was investigated by database mining and plasmid isolation. With Xoc strain genome sequence in GenBank as the research target， plasmids information searching was conducted， and phylogenetic analysis on published Xoc indigenous plasmids sequence was also carried out. With Xoc Chinese strains database as the research target， the plasmids were extracted by alkaline lysis， plasmidrestriction endonuclease pattern was analyzed and main functional genes were identified. 【Result】The detection rate of Xoc strainindigenous plasmids in GenBank whole genome database was 11.76%. The phylogenetic analysis indicated that these plasmids were clustered into different phylogenetic branches. Among the 257 Xoc Chinese strains， 29 contained plasmids with a detection rate of 11.28%. The strains containing indigenous plasmid all came from southern China， and most of them were from Guangxi. Nine novel indigenous plasmids of Xoc were confirmed by restriction endonuclease pattern. The primers were designed based on main functional gene sequence of the known? indigenous plasmid pXOCgx01. The PCR amplification analysis indicated that the novel plasmids contained heavy metal tolerance and DNA transposition related genes， but there was diversity among the strains. 【Conclusion】Partial Xoc strains contain indigenous plasmids， with diversities in plasmid types， functional genes（DNA transposition and heavy metal resistance）， and the Xoc strains with indigenous plasmids have obvious geographical origins.

Key words： Xanthomonas oryzae pv. oryzicola; indigenous plasmid; general survey; restriction pattern; resistance gene

0 引言

【研究意義】質(zhì)粒是獨(dú)立于染色體外可自主復(fù)制的遺傳物質(zhì)，多為環(huán)狀雙鏈DNA分子，是一些細(xì)菌基因組的組成部分（Thomas et al.，2017）。質(zhì)粒常攜帶有抗生素抗性、重金屬耐性及功能蛋白分泌系統(tǒng)等相關(guān)基因，可幫助宿主菌適應(yīng)生存環(huán)境，提高致病能力（Vivian et al.，2001;Sundin，2007）。質(zhì)粒也是基因水平轉(zhuǎn)移的主要載體，在細(xì)菌抗藥、抗逆，乃至毒力進(jìn)化中發(fā)揮重要作用（De Feyter and Gabriel，1991;Carattoli，2013;Suhartono et al.，2018）。水稻條斑病菌也稱水稻細(xì)菌性條斑病菌，學(xué)名為Xanthomonas oryzae pv. oryzicola，簡稱Xoc（Ni?o-Liu et al.，2006），漢譯為水稻黃單胞菌稻生致病變種或水稻黃單胞菌棲稻致病變種（肖永勝等，2011）。該菌引起的水稻細(xì)菌性條斑?。˙acterial leaf streak，BLS）廣泛發(fā)生在熱帶、亞熱帶稻作區(qū)，可導(dǎo)致水稻減產(chǎn)20%～60%（Ni?o-Liu et al.，2006）。近年來，該病在我國多個(gè)稻區(qū)發(fā)病較重，至今尚未發(fā)現(xiàn)水稻抗BLS的主效基因，也缺乏高效防治該病的方法（馬路等，2018）。明確病原菌的致病機(jī)理和環(huán)境適應(yīng)機(jī)理是發(fā)展高效、有針對(duì)性、環(huán)境友好的病害防治藥物和方法的基礎(chǔ)。最近，人們?cè)赬oc菌株中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源質(zhì)粒（Niu et al.，2015;Wilkins et al.，2015），研究表明，Xoc的內(nèi)源質(zhì)粒能提高受體菌的抗逆性（Niu et al.，2015）。因此，開展Xoc內(nèi)源質(zhì)粒的調(diào)查和分析，不僅有助于明確Xoc內(nèi)源質(zhì)粒分布狀況、質(zhì)粒類型，揭示內(nèi)源質(zhì)粒在病菌毒力、抗脅迫和環(huán)境適應(yīng)等方面的生物學(xué)功能，還能為闡明病原菌毒力因子進(jìn)化、轉(zhuǎn)移等方面的機(jī)理提供參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】前期本課題組從廣西賀州分離的一株Xoc菌株中分離鑒定出一個(gè)內(nèi)生質(zhì)粒pXOCgx01（Niu et al.，2015），該質(zhì)粒全長53206 bp，注釋64個(gè)編碼基因，包括3個(gè)重要的功能基因簇：（1）czcCBA基因簇（簡稱czc基因簇，包括czcA、czcB和czcC 3個(gè)基因），編碼鈷—鋅—鎘抗性蛋白（Cobalt-zinc-cadmium resistance protein），在金屬抗逆性方面發(fā)揮作用（Nies，1995;Niu et al.，2015）;（2）復(fù)合轉(zhuǎn)座系統(tǒng)tnpA-tnpS-tnpT cassette結(jié)構(gòu)，簡稱tnp基因簇，推測(cè)在毒力因子基因水平轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用（Ferreira et al.，2015）;（3）virB/virD4基因簇，簡稱vir基因簇，在DNA轉(zhuǎn)運(yùn)、vir毒力因子分泌等方面發(fā)揮作用（Voth et al.，2012）。將pXOCgx01導(dǎo)入不含質(zhì)粒的水稻白葉枯病菌（學(xué)名X. oryzae pv. oryzae，簡稱Xoo;譯為水稻黃單胞菌水稻致病變種）PXO99A菌株，能顯著提高該菌株對(duì)重金屬的抗性（Niu et al.，2015）。DNA限制修飾系統(tǒng)在不同物種，甚至是同一物種的不同個(gè)體間存在明顯差異，內(nèi)源質(zhì)粒的分布狀況非常復(fù)雜。已有研究表明，絕大多數(shù)水稻黃單胞菌排斥外源質(zhì)粒，被轉(zhuǎn)化率僅為6%左右（吳神怡等，2010）。迄今為止，已分離和鑒定了近百株水稻條斑病菌亞洲和非洲分離株（Gonzalez et al.，2007;Ji et al.，2014），一部分菌株如Xoc BLS256等已完成基因組測(cè)序（Bogdanove et al.，2011;Wilkins et al.，2015），但僅從兩個(gè)Xoc菌株中發(fā)現(xiàn)內(nèi)源質(zhì)粒，分別為pXOCgx01（Niu et al.，2015）和pXOC2286（Wilkins et al.，2015）。目前，人們對(duì)水稻條斑病菌內(nèi)源質(zhì)粒的存在狀況、種類、功能等缺乏了解?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】長期以來，本課題組持續(xù)開展黃單胞菌致病分子機(jī)理研究，建立了黃單胞菌菌種庫，從全國多個(gè)省份分離獲得數(shù)百株Xoc菌株。在Xoc的其他菌株是否存在有質(zhì)粒，如果存在質(zhì)粒，這些質(zhì)粒會(huì)有怎樣的基因組成、行使何種生物學(xué)功能，這些質(zhì)粒在與其他黃單胞菌中的質(zhì)粒可能會(huì)有怎樣的進(jìn)化關(guān)系，以及這些質(zhì)粒與Xoc核染色體間是否存在協(xié)同進(jìn)化關(guān)系等均有待進(jìn)一步探究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過大規(guī)模GenBank數(shù)據(jù)庫搜索與大規(guī)模質(zhì)粒提取分離鑒定相結(jié)合檢測(cè)Xoc內(nèi)源質(zhì)粒，并對(duì)獲得的Xoc內(nèi)源質(zhì)粒進(jìn)行酶切圖譜分析和功能基因PCR法檢測(cè)，以期對(duì)水稻條斑病菌內(nèi)源質(zhì)粒的分布狀況、質(zhì)粒類型和潛在的生物功能有一個(gè)全新的了解，為下一步開展該菌與質(zhì)粒相關(guān)的毒力進(jìn)化、逆境適應(yīng)機(jī)制等研究及穿梭載體構(gòu)建打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 菌株、質(zhì)粒和引物

1. 1. 1. 1 菌株來源和質(zhì)粒 為研究水稻條斑病菌的致病分子機(jī)理，廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院植物病原細(xì)菌功能基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室（本課題組屬于該實(shí)驗(yàn)室，以下簡稱本實(shí)驗(yàn)室）建立了水稻黃單胞菌菌種庫，本研究涉及的水稻條斑病菌中國菌株分別從來自于安徽、江蘇、浙江、福建、廣東、海南、云南和廣西等地的水稻病株中分離獲得，共257株菌株。其他菌株和質(zhì)粒信息見表1。

1. 1. 1. 2 生物試劑 限制性內(nèi)切酶購自Promega公司、Taq酶購自TaKaRa公司?；瘜W(xué)試劑為分析純級(jí)（AR）、培養(yǎng)基材料為生化實(shí)驗(yàn)級(jí)（BR）。PCR原料dNTP Mix購自索萊寶公司。用于DNA樣品凝膠電泳的染料Gel Red（膠紅）購自美國Biotium公司。

1. 1. 1. 3 PCR擴(kuò)增引物 采用Vector NTI 11.5軟件，按照pXOCgx01質(zhì)粒（Niu et al.，2015）中目標(biāo)基因的序列設(shè)計(jì)引物（表2），引物合成和DNA測(cè)序由深圳華大基因股份有限公司完成。

1. 1. 1. 4 質(zhì)粒提取試劑 Solution I配方：45.0 mL（50 mmol/L）20%（w/v）葡萄糖、2.0 mL（10 mmol/L）0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）、2.5 mL（25 mmol/L）1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）。用于細(xì)菌質(zhì)粒提取第一步，重懸菌體，高壓滅菌，4 ℃短期保存。Solution II配方：10.0 mL（0.2 mol/L）2 mol/L NaOH、10.0 mL（1%，w/v）10%（w/v）SDS。用于細(xì)菌質(zhì)粒提取第二步，裂解菌體，需現(xiàn)配現(xiàn)用。Solution III配方：60.0 mL的5 mol/L醋酸鉀、11.5 mL醋酸。用于細(xì)菌質(zhì)粒提取第三步，沉淀蛋白等雜質(zhì)，高壓滅菌，4 ℃短期保存（薩姆布魯克和拉塞爾，2002）。

1. 1. 1. 5 電泳緩沖液和上樣緩沖液 電泳緩沖液TBE（10×）配方： 5.5 g（5.5%，w/v）Boric acid（硼酸）、4.0 mL（20 mmol/L） 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）和2.5 mL（25 mmol/L）Tris堿（pH 8.0），可作為DNA樣品電泳緩沖液，制備瓊脂糖凝膠，或作為母液制備0.5×TBE。高壓滅菌，室溫保存（薩姆布魯克和拉塞爾，2002）。上樣緩沖液Loading Buffer（10×）配方：0.02 g （0.2%，w/v）二甲苯青FF、0.02 g（0.2%，w/v）溴酚藍(lán)、40.0 mL（200 mmol/L） 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）、1.0 mL（0.1%，w/v）10%（w/v）SDS和50.0 mL（50%）甘油，用于DNA樣品凝膠電泳，可于室溫保存（薩姆布魯克和拉塞爾，2002）。

1. 1. 2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1. 1. 2. 1 培養(yǎng)基 水稻條斑病菌各參試菌株均采用NB（Nutrient broth）培養(yǎng)基（配方：5.0 g/L高聚蛋白胨、3.0 g/L牛肉膏、1.0 g/L酵母提取物、10.0 g/L蔗糖、pH 7.0）進(jìn)行液體培養(yǎng)，采用NA（Nutrient agar）培養(yǎng)基進(jìn)行固體培養(yǎng)[在NB培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上加入1%（w/v）瓊脂粉]（Niu et al.，2015）。

1. 1. 2. 2 培養(yǎng)條件 水稻條斑病菌的最適培養(yǎng)溫度為28 ℃。固體培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基倒置于培養(yǎng)箱中，24～48 h后可出現(xiàn)菌落;液體培養(yǎng)時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)16～20 h。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 DNA操作

1. 2. 1. 1 堿裂解法提取質(zhì)粒 新鮮活化的Xoc菌株接種到含有10.0 mL NB培養(yǎng)基的30 mL通用培養(yǎng)瓶中，于28 ℃下200 r/min搖床培養(yǎng)16～20 h。收集1.5 mL菌液于1.5 mL EP管中，以12000 r/min離心1 min，棄去上清。加入200 μL保存在4 ℃冰箱的Solution I，充分混勻。加入400 μL新鮮配制的Solution II，輕柔混勻。立刻加入300 μL保存在4 ℃冰箱的Solution III，輕柔混勻，白色或淡黃色絮凝狀沉淀產(chǎn)生。1200 r/min離心10～15 min，至沉淀聚集成塊在EP管底部。吸取700～750 μL上清液移至另一新的1.5 mL離心管中，12000 r/min離心10 min。吸取500～600 μL上清液移至另一新的1.5 mL離心管中，加入2倍體積無水乙醇后混勻，于-20 ℃下靜置20 min以上。靜置后的混合液12000 r/min離心10 min使質(zhì)粒DNA析出，棄上清液。加入500 μL 75%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA，上下晃動(dòng)使乙醇溶液覆蓋整個(gè)EP管內(nèi)壁，12000 r/min離心3～5 min，棄上清液。用真空干燥器將質(zhì)粒DNA干燥3～5 min，或?qū)P管倒置在吸水紙上，自然干燥10～15 min。在干燥后的DNA中加入40～50 μL滅菌的去離子水，待充分溶解后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 1. 2 限制性酶切體系 分離純化質(zhì)粒DNA，用不同的限制性內(nèi)切酶（BamH I、EcoR I、Sma I、Kpn I和Pst I）分別進(jìn)行單酶切。以20.0 μL酶切體系為例，單酶切時(shí)各組分添加比例如下：2.0 μL 10×Buffer、0.2 μL乙酰化BSA（10 μg/μL）、1.0 μL質(zhì)粒DNA（1.0 μg/μL）、16.0 μL雙蒸水、0.8 μL內(nèi)切酶（10.0 U/μL）。各反應(yīng)組分均加入后用移液器吸打使充分混勻，短暫離心，在相應(yīng)的酶切溫度（推薦溫度）下反應(yīng)4 h。

1. 2. 1. 3 瓊脂糖凝膠電泳 根據(jù)DNA樣品的分子量，確定瓊脂糖凝膠的濃度與大小，本研究用1.0%瓊脂糖，0.5×TBE緩沖液。將DNA樣品和標(biāo)度DNA（Marker）分別與已混有Gel Red的10×上樣緩沖液混勻后，加入上樣孔。打開電泳儀，100 V電泳至上樣緩沖液移動(dòng)到凝膠的3/4處。停止電泳，取出凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)，拍照記錄結(jié)果，用于酶切圖譜分析。

1. 2. 1. 4 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系10.00 μL：50 ng/μL DNA模板0.25 μL，10 μmol/L正、反向引物各0.50 μL，10 mmol/L dNTP 0.25 μL，Taq Buffer 1.00 μL，稀釋Taq酶（1 U）1.00 μL，雙蒸水6.50 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s，退火溫度60 ℃（根據(jù)引物而定，見表2）下退火45 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸2 min。在BIOER PCR儀上完成相關(guān)基因的擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，取1.00 μL瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像、拍照記錄。

1. 2. 2 生物信息學(xué)分析 采用Local BLAST對(duì)相關(guān)水稻黃單胞菌質(zhì)粒序列進(jìn)行比對(duì)，通過MEGAX進(jìn)行全序列數(shù)據(jù)分析，采用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（陳銘，2018），并用Evolview進(jìn)行標(biāo)注，采用圓形分支圖進(jìn)行呈現(xiàn)（He et al.，2016）。已知序列的pXOCgx01和pXOC2286的電子酶切圖在Vector NTI所帶的Gel Analysis組件中完成。

2 結(jié)果與分析

2. 1 水稻條斑病菌內(nèi)源質(zhì)粒的序列信息和特征

為掌握現(xiàn)有Xoc內(nèi)源質(zhì)粒的分布狀況和序列信息，對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的已完成或正在開展的Xoc全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，結(jié)果（表3）顯示已完成Xoc全基因組測(cè)序的17株水稻條斑病菌中只有2株菌株含有內(nèi)源質(zhì)粒，其中，pXOCgx01來源于中國Xoc GX01菌株，pXOC2286來源于馬來西亞的Xoc CFBP2286菌株。數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果表明，Xoc內(nèi)源質(zhì)粒檢出率為11.76%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)43株水稻白葉枯病菌（同屬于水稻黃單胞菌）中也僅有2株菌株含有內(nèi)源質(zhì)粒（表3），Xoo內(nèi)源質(zhì)粒檢出率僅為4.65%。

質(zhì)粒序列信息分析結(jié)果（表3）顯示，水稻黃單胞菌4種質(zhì)粒的GC含量在60.19%～61.25%，低于水稻黃單胞菌染色體DNA的GC含量（63.00%～64.00%），但差異不明顯?；虮葘?duì)分析結(jié)果表明，pXOCgx01、pXOC2286和pXOO43的基因具有一定的同源性，序列中存在較長的共線性片段;pXOC2286和pXOO43均含有完整的oriV復(fù)制區(qū)和vir基因簇，但沒有czc基因簇和tnp基因簇;pXOOYN24質(zhì)粒與其他3種質(zhì)粒的基因構(gòu)成完全不同，不僅沒有oriV復(fù)制區(qū)，也沒有pXOCgx01質(zhì)粒攜帶的其他功能基因簇（Niu et al.，2015）。

系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果（圖1）表明，4株水稻黃單胞菌的內(nèi)源質(zhì)粒分屬于黃單胞菌內(nèi)源質(zhì)粒不同的進(jìn)化分支。水稻條斑病菌中的2種質(zhì)粒pXOCgx01和pXOC2286也存在較遠(yuǎn)的進(jìn)化距離。同一分支上的質(zhì)粒具有類似的序列特點(diǎn)及基因構(gòu)成等，但這些質(zhì)粒來源于不同種的黃單胞菌。這一結(jié)果提示黃單胞菌在屬水平上來看，接納的質(zhì)粒差異性很大，質(zhì)粒是否能在黃單胞菌中存在，與菌株本身的限制修飾系統(tǒng)及質(zhì)粒類型密切相關(guān)。從攜帶的基因來看，相當(dāng)一部分質(zhì)粒帶有vir基因簇（包括缺少部分基因的非完整vir基因簇）、tnp基因簇和tal基因簇，少部分質(zhì)粒帶有czc基因簇。

2. 2 水稻條斑病菌中國菌株中內(nèi)源質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

為掌握水稻條斑病菌中國菌株中內(nèi)源質(zhì)粒的分布情況，采用堿裂解法提取質(zhì)粒，再凝膠電泳，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離保存的257株Xoc菌株（其中79株來自安徽、75株來自廣西、58株來自海南、22株來自廣東、13株來自福建、8株來自浙江、1株來自江蘇、1株來自云南）進(jìn)行質(zhì)粒鑒定，凡是電泳后經(jīng)DNA染色有質(zhì)粒條帶的表示該菌株含有質(zhì)粒（見圖2中的質(zhì)粒代表），沒有質(zhì)粒條帶的確定為不含質(zhì)粒。結(jié)果（表4）表明，在257株水稻條斑病菌中國分離株中共檢測(cè)到29株含內(nèi)源質(zhì)粒，質(zhì)粒檢出率為11.28%;從分離菌株的地域來看，帶有內(nèi)源質(zhì)粒的菌株均來自于華南地區(qū)，且大部分來自廣西（質(zhì)粒檢出率為31.58%），其原因正在進(jìn)一步研究。

2. 3 水稻條斑病菌中國菌株內(nèi)源質(zhì)粒酶切帶型分析結(jié)果

分別采用BamH I、Kpn I、Pst I、EcoR I和Sma I等常用內(nèi)切酶對(duì)pXOCgx01及其他被分離的質(zhì)粒進(jìn)行酶切，電泳圖譜見圖3。通過合并因酶切帶型一致而被認(rèn)為是同種質(zhì)粒的樣品后，共得到9種不同類型的新內(nèi)源質(zhì)粒，分別根據(jù)菌株名命名為pXOCgx02、pXOCB116、pXOCB209、pXOCB216、pXOCB220、pXOCB409、pXOC709、pXOC820和pXOC905。從酶切帶型初步判斷pXOC209與pXOCgx01、pXOCgx02與pXOC905、pXOCB216與pXOC709較類似。pXOCB409的長度最短，而pXOCB220的長度可能最長。

比較pXOCgx01質(zhì)粒的酶切和電子酶切圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pXOCgx01測(cè)序組裝正確，說明電子酶切圖譜可用于DNA帶型比較。從電子酶切圖譜來看，pXOC2286與其他質(zhì)粒明顯不同。本研究結(jié)果表明，目前從水稻條斑病菌共發(fā)現(xiàn)11種類型的內(nèi)源質(zhì)粒，除pXOCgx01和pXOC2286外，其他9種質(zhì)粒屬于新型質(zhì)粒。

2. 4 水稻條斑病菌中國菌株內(nèi)源質(zhì)粒主要功能區(qū)段的PCR鑒定結(jié)果

基于pXOCgx01質(zhì)粒中含有的功能基因簇進(jìn)行序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示在已完成測(cè)序的幾個(gè)水稻黃單胞菌內(nèi)源質(zhì)粒中，這些基因簇的分布存在明顯的多樣性，值得對(duì)中國Xoc菌株內(nèi)源質(zhì)粒進(jìn)行相關(guān)基因簇鑒定。根據(jù)pXOCgx01中3個(gè)基因簇的保守基因設(shè)計(jì)3對(duì)引物（表2），分別以分離的內(nèi)源質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳結(jié)果（圖4）顯示，只有pXOCB209質(zhì)粒能擴(kuò)增出3條條帶;pXOCB116、pXOCB216和pXOCB220質(zhì)粒中能擴(kuò)增出tnp基因帶;pXOC905和pXOCgx02質(zhì)粒中能擴(kuò)增出vir基因帶;pXOC709中能擴(kuò)增出1條明顯小于預(yù)計(jì)產(chǎn)物的條帶;pXOCB409和pXOC820中未擴(kuò)增出任何條帶。PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果提示pXOCB209質(zhì)粒含有相應(yīng)的3個(gè)基因簇（表5），pXOCB116、pXOCB216和pXOCB220質(zhì)粒含有tnp基因簇，pXOC905和pXOCgx02質(zhì)粒含有vir基因簇，pXOC709中可能含有變異的czc基因，而pXOCB409和pXOC820可能不含相關(guān)的3個(gè)基因簇，詳細(xì)結(jié)果待完成序列測(cè)定。

本研究初步鑒定到9種新類型的Xoc內(nèi)源質(zhì)粒，加上已報(bào)道的2種質(zhì)粒，目前已從Xoc中發(fā)現(xiàn)11種內(nèi)源質(zhì)粒，這些質(zhì)粒在大小和攜帶的功能基因方面呈現(xiàn)出多樣性。酶切圖譜（圖3）與PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果關(guān)聯(lián)分析（圖4和表5）可初步將這些質(zhì)粒進(jìn)行分組：（1）Xoc B209菌株攜帶的pXOCB209質(zhì)粒，與pXOCgx01具有接近的酶切帶型和PCR產(chǎn)物。推測(cè)pXOCB209具有類似于pXOCgx01的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)和功能基因;（2）pXOCB116、pXOCB216和pXOCB220在酶切帶型和PCR產(chǎn)物條帶上也非常相似，均具有tnp基因簇;（3）pXOCgx02和pXOC905兩個(gè)質(zhì)粒均含有vir基因簇，與pXOC2286（馬來西亞）所帶功能基因相似（表3）;（4）pXOCB409和pXOC820均未擴(kuò)增出功能基因條帶;（5）pXOC709能擴(kuò)增出1條小于目標(biāo)基因的條帶，推測(cè)該同源基因內(nèi)部發(fā)生了缺失變異。

3 討論

質(zhì)粒作為染色體外的遺傳物質(zhì)，具有可移動(dòng)、易變異等特點(diǎn)，盡管質(zhì)粒較少參與細(xì)菌的基本代謝，但在宿主菌的環(huán)境適應(yīng)和毒力進(jìn)化方面發(fā)揮重要作用（Carroll and Wong，2018）。近年來，質(zhì)粒在人類和動(dòng)物超級(jí)病菌進(jìn)化、傳播等方面的作用機(jī)理研究已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一（Wang et al.，2018），而質(zhì)粒在植物病原細(xì)菌方面的研究工作相對(duì)較少（Niu et al.，2015;Gochez et al.，2018）。本研究分別采用數(shù)據(jù)庫檢索和質(zhì)粒提取兩種方式對(duì)Xoc不同地域分離菌株中的內(nèi)源質(zhì)粒進(jìn)行調(diào)查，兩種方式的質(zhì)粒檢出率分別為11.76%和11.28%。Xoc群體中含有內(nèi)源質(zhì)粒的菌株比例為11.52%，大致為1∶10的關(guān)系，推測(cè)質(zhì)粒對(duì)Xoc正常的致病機(jī)制或環(huán)境適應(yīng)具有一定貢獻(xiàn)，但不是主要因素。在黃單胞菌屬中，不同菌種帶有內(nèi)源質(zhì)粒的比例相差很大，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，幾乎所有的柑橘黃單胞菌（Xanthomonas citri）菌株均含有內(nèi)源質(zhì)粒，每個(gè)菌株含2～4個(gè)不同型質(zhì)粒，柑橘黃單胞菌在致病機(jī)制或環(huán)境適應(yīng)方面對(duì)內(nèi)源質(zhì)粒具有較大的依賴（Gochez et al.，2018）。從黃單胞菌質(zhì)粒攜帶的基因來看，vir基因、tnp基因和tal基因最常見，少部分質(zhì)粒帶有czc基因，這些基因在內(nèi)源質(zhì)粒中的差異是否會(huì)影響黃單胞菌的寄主特異性目前尚不清楚，值得進(jìn)一步關(guān)注。

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，Xoc中已發(fā)表的2種質(zhì)粒pXOCgx01和pXOC2286位于不同的進(jìn)化分支，表明質(zhì)粒間存在較大進(jìn)化差異，提示同類菌株可攜帶不同類型的質(zhì)粒。本研究也發(fā)現(xiàn)同一分支上的質(zhì)粒卻來源于不同種的黃單胞菌，提示黃單胞菌在屬水平上質(zhì)粒接納的菌株特異性不高，質(zhì)粒是否能在黃單胞菌中存在，與菌株個(gè)體本身的限制修飾系統(tǒng)及質(zhì)粒類型密切相關(guān)。

從GenBank數(shù)據(jù)庫基因組信息可看出，除了中國和馬來西亞2株Xoc菌株含有內(nèi)源質(zhì)粒外，世界其他稻區(qū)（非洲、印度、日韓和菲律賓等國家和地區(qū)）分離的Xoc菌株均未發(fā)現(xiàn)攜帶內(nèi)源質(zhì)粒。Xoc中國分離株的內(nèi)源質(zhì)粒提取結(jié)果也顯示出，帶有內(nèi)源質(zhì)粒的Xoc菌株分布具有明顯地域特征，均來源于華南稻區(qū)，尤其是廣西稻區(qū)，內(nèi)源質(zhì)粒檢出率高達(dá)31.58%。華東地區(qū)（4省）104株被檢菌株中均無內(nèi)源質(zhì)粒檢出。從被檢菌株的數(shù)量來看，質(zhì)粒分布的這種不均衡性似乎不是人為取樣偏差造成，有關(guān)廣西菌株中擁有內(nèi)源質(zhì)粒比例相對(duì)較高的原因有待進(jìn)一步探究。廣西是世界范圍內(nèi)野生稻資源最豐富的地區(qū)之一，全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide association study，GWAS）結(jié)果表明，廣西野生稻可能是栽培稻的最近祖先，也是主要的栽培稻馴化地區(qū)之一（Huang et al.，2012）;同時(shí)，廣西屬于多民族地區(qū)，水稻耕作方式各異，常規(guī)稻品種繁多，推測(cè)Xoc菌株面對(duì)多樣的水稻品種、復(fù)雜的地理環(huán)境等因素，在長期的進(jìn)化過程中，一方面自身在不斷變異，限制系統(tǒng)發(fā)生變化，降低了對(duì)質(zhì)粒的排斥作用;另一方面，通過接納質(zhì)粒獲得水平轉(zhuǎn)移來的基因，增強(qiáng)自身的生存能力。前期本課題組鑒定的Xoc第一例內(nèi)源質(zhì)粒pXOCgx01攜帶有完整的czcCBA基因簇，編碼鈷—鋅—鎘抗性蛋白，在金屬抗逆性方面發(fā)揮作用（Niu et al.，2015;Hülter et al.，2017）。該質(zhì)粒分離自廣西賀州市，該市是我國著名的有色金屬之鄉(xiāng)，多處農(nóng)田重金屬超標(biāo)（李忠義等，2009）。推測(cè)pXOCgx01攜帶有完整的czcCBA基因簇有利于宿主菌在高污染環(huán)境下生存。質(zhì)粒能提高宿主菌重金屬抗性的研究在多種細(xì)菌中已有報(bào)道（范麗平等，2010）。從質(zhì)粒酶切圖譜和PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果來看，來自于廣西梧州市藤縣的Xoc B209菌株攜帶的pXOCB209質(zhì)粒與pXOCgx01具有接近的酶切帶型和PCR產(chǎn)物，推測(cè)pXOCB209具有類似于pXOCgx01的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)和功能基因。這兩株菌株的分離地點(diǎn)原屬于同一行政區(qū)，不能排除是同一菌株隨種子等在該地區(qū)擴(kuò)散引起。質(zhì)粒在不同菌株間自主轉(zhuǎn)移的問題，也可能是同型質(zhì)粒出現(xiàn)在不同地域的原因之一（Yanagiya et al.，2018）。pXOCB116、pXOCB216和pXOCB220在酶切帶型和PCR產(chǎn)物條帶上也非常相似，均具有tnp基因簇，而且這些質(zhì)粒的宿主菌來自于廣西玉林和博白，兩地相鄰，也有可能是同一菌株擴(kuò)散的結(jié)果。pXOCgx02（廣西靈川）和pXOC905（廣東英德）兩個(gè)質(zhì)粒均含有vir基因簇，與pXOC2286（馬來西亞）所帶功能基因相似（Wilkins et al.，2015）。本研究結(jié)果還顯示，部分質(zhì)粒沒有擴(kuò)增出相應(yīng)基因的條帶，可能不含相關(guān)基因，也可能是由于引物問題造成的假陰性，尚有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

部分Xoc菌株中含有一定數(shù)量的內(nèi)源質(zhì)粒，質(zhì)粒類型、所含功能基因等具有一定的多樣性，主要包括vir毒力因子、DNA轉(zhuǎn)移及重金屬抗性基因等。攜帶內(nèi)源質(zhì)粒的Xoc菌株有明顯的地域性，主要集中在華南稻區(qū)，特別是廣西稻區(qū)。本研究中鑒定的一系列內(nèi)源質(zhì)粒將為構(gòu)建一系列穿梭質(zhì)粒載體提供材料，同時(shí)這些質(zhì)粒將在植物病害流行病學(xué)中跟蹤毒性菌株的流行路徑、菌體密度等方面發(fā)揮重要作用。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）