不同等級白牡丹茶游離氨基酸構成分析

陳思肜 趙峰 王淑燕 金珊 周鵬 危賽明 葉乃興

摘?要：【目的】通過對不同等級白牡丹茶游離氨基酸的分析，探究氨基酸種類與白牡丹茶品質等級的關系?！痉椒ā坎捎肁QC柱前衍生結合超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法 （UHPLC-MS/MS）測定游離氨基酸后，通過結合偏最小二乘法判別分析法 （Partial least squares discrimination analysis， PLS-DA）和聚類分析法，對9批次不同等級白牡丹茶的35種游離氨基酸進行分析?！窘Y果】白牡丹茶中除β-氨基丁酸、同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸5種氨基酸外，其余30種氨基酸均高于定量限。相關分析結果顯示，游離氨基酸與白牡丹品質等級間存在密切相關性;其中，γ-氨基丁酸、絲氨酸、脯氨酸、色氨酸、甘氨酸對于白牡丹茶滋味品質的影響最大;味覺分析結果顯示，γ-氨基丁酸對白牡丹茶滋味的收斂性有重要貢獻，而其余氨基酸主要通過交互作用對白牡丹茶滋味品質產(chǎn)生貢獻?！窘Y論】白牡丹茶的游離氨基酸構成與其品質等級間存在密切相關性，不同氨基酸組分通過交互作用對白牡丹茶的滋味等級形成產(chǎn)生整體性的貢獻作用。

關鍵詞：白茶;白牡丹;游離氨基酸組分;滋味;品質等級

中圖分類號：TS 272文獻標識碼：A文章編號：1008-0384（2019）08-965-09

Abstract：【Objective】 The amino acids in white peony teas of various quality grades were compared. 【Method】 Free amino acid compositions of 9 white peony tea specimens were determined using AQC pre-column derivatization combined with the ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UHPLC-MS/MS）. The analytical results on 35 amino acids were compared for the study by the partial least squares discrimination analysis （PLS-DA） and cluster analysis. 【Result】Aside from β-aminobutyric acid， homocysteine， cysteine， cystine， and tyrosine， the remaining 30 amino acids in the tea samples showed higher contents than the limit of quantitation. The correlation analysis on the data indicated a significant correlation between the amino acid composition and the quality of the teas. For instance， γ-aminobutyric acid， serine， proline， tryptophan， and glycine significantly affected the taste， while γ-aminobutyric acid was crucial on the astringency， of the brewed tea as shown in a taste test. The other amino acids appeared to interactively contribute to the sensory quality. 【Conclusion】 Either individually or interactively， free amino acids had a significant effect on the taste， therefore， the grading of the white peony teas.

Key words：white tea; white peony; free amino acid composition; taste; quality grade

0?引言

【研究意義】白茶是六大茶類之一，2016年全國白茶的總產(chǎn)量達到2.25萬t，產(chǎn)值約為22.5億元[1-2]。福建福鼎、政和、建陽、松溪是白茶的主要產(chǎn)地。白茶的游離氨基酸含量高于其他茶類，氨基酸不但對茶湯的鮮爽滋味有重要作用，其組成還與茶葉保健功效密切相關[3-4]。根據(jù)加工原料嫩度及品種的差異，傳統(tǒng)白茶主要分為白毫銀針、白牡丹、貢眉和壽眉等4個品類[5]，其中以白牡丹的產(chǎn)量最高?！厩叭搜芯窟M展】游離氨基酸含量和構成比例對茶葉品質有重要貢獻[6-7]。白茶中游離氨基酸總量顯著高于其他茶類;綠茶和紅茶的游離氨基酸總量間未見顯著差異;而烏龍茶和黑茶的游離氨基酸總量則相對較低[8]。不同茶類游離氨基酸的構成對其品質的影響也不盡相同，并由此形成了不同品類茶葉的風味差別[9]。例如：綠茶的等級與茶氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸含量密切相關[10-12];而紅茶的品質主要受絲氨酸、苯丙氨酸的影響[13];除茶氨酸外，烏龍茶中谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸和亮氨酸含量較高[14-15];黑茶中茶氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、蛋氨酸含量與原料老嫩程度密切相關[16];茶氨酸、甘氨酸、脯氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、丙氨酸對白茶鮮甜風味存在貢獻[17]。【本研究切入點】目前，多數(shù)對茶葉游離氨基酸組分的研究主要集中在不同茶類或種質資源上，并且僅局限于20種蛋白質氨基酸和茶氨酸，而對于含量相對較低的非蛋白質氨基酸關注較少，對于同一品類不同等級茶葉游離氨基酸組分開展的細致研究則更為鮮見?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過AQC柱前衍生結合超高效液相色譜-串聯(lián)質譜系統(tǒng) （UHPLC-MS/MS），對不同等級白牡丹茶中20種蛋白質氨基酸和15種非蛋白質氨基酸進行定量，并由此探究游離氨基酸構成與白牡丹茶品質等級間的相關性，為白牡丹茶滋味構成及品質評價提供基礎性參考。

1?材料與方法

1.1?試劑

色譜級甲醇、乙腈 （Sigma公司，美國）;AccQ·FluorTM氨基酸衍生試劑盒 （Waters公司，美國）;試劑級甲酸銨 （J&K Scientific公司，中國）。

氨基酸標準儲備液A（Sigma公司，美國）：含5 nmol·mL-1的丙氨酸 （44.5 mg·L-1）、L-2-氨基己二酸 （80.6 mg·L-1）、α-氨基丁酸 （51.6 mg·L-1）、β-氨基丁酸 （51.6 mg·L-1）、γ-氨基丁酸 （51.6 mg·L-1）、精氨酸 （87.1 mg·L-1）、天冬氨酸 （66.6 mg·L-1）、瓜氨酸 （87.6 mg·L-1）、羥脯氨酸 （65.6 mg·L-1）、胱氨酸 （120.2 mg·L-1）、谷氨酸 （73.6 mg·L-1）、甘氨酸 （37.5 mg·L-1）、組氨酸 （77.6 mg·L-1）、同型半胱氨酸 （134.2 mg·L-1）、羥賴氨酸 （81.1 mg·L-1）、異亮氨酸 （65.6 mg·L-1）、亮氨酸 （65.6 mg·L-1）、賴氨酸 （73.1 mg·L-1）、蛋氨酸 （74.6 mg·L-1）、1-甲基-L-組氨酸 （84.6 mg·L-1）、3-甲基-L-組氨酸 （84.6 mg·L-1）、鳥氨酸 （66.1 mg·L-1）、苯丙氨酸 （82.6 mg·L-1）、脯氨酸 （57.6 mg·L-1）、肌氨酸 （44.5 mg·L-1）、絲氨酸 （52.6 mg·L-1）、蘇氨酸 （59.6 mg·L-1）、色氨酸 （102.1 mg·L-1）、酪氨酸 （90.6 mg·L-1）、纈氨酸 （58.6 mg·L-1）。

氨基酸標準儲備液B（華培貿(mào)易公司和索萊寶科技有限公司，中國）：分別稱取豆葉氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、茶氨酸、谷氨酰胺，各20 mg，以0.02 mol·L-1鹽酸定容至10 mL，得濃度為2 000.0 mg·L-1的B標準儲備液。

氨基酸混合標準儲備液：分別移取2.00 mL氨基酸標準儲備液A和0.50 mL儲備液B，以0.02 mol·L-1鹽酸定容至10 mL。

1.2?供試樣品

產(chǎn)自2018年的特級 （A）、一級 （B）和二級 （C）白牡丹商品茶樣各3批次，茶樣原料為福鼎大毫茶，分別由福鼎寶鼎茶業(yè)有限公司 （A1， B1）、福鼎茶博論茶業(yè)有限公司 （A2，C1）、福鼎卓掌柜茶業(yè)有限公司（B2，C2）、福鼎沐云山茶業(yè)有限公司（A3，C3）、福鼎高山香白牡丹產(chǎn)業(yè)城有限公司（B3）提供。

1.3?氨基酸定量分析

參照ZhouPeng[18]的方法，以AQC試劑衍生后，以UPLC 1290 Infinity色譜串聯(lián)6490 Triple Quad質譜 （Agilent公司，美國）進行分析，各化合物的分子量、母離子、子離子如表1所示。具體過程如下：稱取粉碎茶樣0.20 g，加40 mL純水并渦旋混合 （上海芃奇科學儀器有限公司，中國），45 kHz室溫下超聲提?。ɡド绞谐晝x器有限公司，中國）30 min后，離心 （×10， 000 g， 4℃，5 min） （Eppendorf，德國）;取10 μL經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾的上清液與70 μL AccQ-Fluor硼酸鹽緩沖液 （pH=8.8）混合，加AccQ-Fluor試劑 （3 000 mg·L-1） 20 μL，渦旋后，置55℃烘箱中10 min，冷卻待用。

使用UPLC 1290 Infinity色譜串聯(lián)6490 Triple Quad質譜 （Agilent公司，美國）對35種氨基酸進行定量分析，質譜數(shù)據(jù)采集分析通過Mass Hunter （Version 5.0， Agilent公司，美國）完成。采用GB/T 8304-2013測定樣品水分含量，氨基酸的定量結果以干基計。

1.4?數(shù)據(jù)處理

通過PASW 20.0軟件 （SPSS Statistics，IBM公司，美國）對樣品氨基酸結果進行統(tǒng)計和單因素方法分析 （Oneway-ANOVA）。對氨基酸定量結果，進行標準化后，計算公式如下：標準化結果以Heml 1.0（Heatmap Illustrator， The CUCKOO Workgroup， 中國）繪制heatmap。采用Simca-P 11.5軟件 （Umetrics AB， Umea公司，瑞典）進行偏最小二乘法判別分析 （PLS-DA）。

1.5?氨基酸的味覺活性分析

味覺活性值 （Dose-over-threshold， DoT），是指某一滋味成分濃度與其滋味閾值的比值，當DoT大于1時，可認為其對相應的滋味屬性有極顯著的貢獻[19]。參照GB/T 23776-2018 茶葉感官審評方法，按茶水比 （3 g∶110 mL）換算對應的白牡丹樣品茶湯中各種氨基酸的濃度，計算公式如下：各氨基酸濃度（mg·L-1），而后通過文獻檢索獲得試驗目標氨基酸的對應呈味閾值，以參試樣品對應氨基酸的含量均值除以呈味閾值，計算得其DoT值。

2?結果與分析

2.1?不同等級白牡丹茶樣品的游離氨基酸定量結果

9批次不同等級白牡丹氨基酸的定量結果如表2所示，35種氨基酸中，除β-氨基丁酸、同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸5種外，其余氨基酸的含量均高于定量限。為了對上述數(shù)據(jù)進行更直觀的比較，將上述氨基酸定量結果進行標準化處理后繪制熱圖 （圖1），將含量均值高于0.1 mg·g-1 DW的定義為白牡丹茶的常量氨基酸 （以紅色方框表示，共包括18種），其余氨基酸定義為微量氨基酸 （以藍色方框表示，共12種）。

由圖1可以直觀地發(fā)現(xiàn)白牡丹茶中的常量氨基酸的含量與樣品等級間，呈現(xiàn)明顯的線性相關性，即，高等級樣品的常量氨基酸顯著高于低等級樣品;而微量氨基酸的含量與樣品等級間則未見明顯規(guī)律。主成分分析是一種可直觀地反映樣本組分構成的近似度的統(tǒng)計方法，樣本間的相似度越高則距離越近。如圖2-A所示，不同等級樣品間呈現(xiàn)較好的聚集狀態(tài);其中，特級樣品僅通過第一主成分就獲得良好分離;而一級和二級樣本的區(qū)分需要結合第二主成分才能得以實現(xiàn);即，一級和二級樣品間的差別較小，而與特級樣品間則存在較大差異性。R2和Q2是主成分分析過程中，用于反映模型擬合度和預測準確率的參數(shù)，可知，該模型的第一、第二主成分的累積貢獻方差為96.21%，預測準確率為73.25%，進一步地驗證了該模型用于等級區(qū)分的有效性。如圖2-B所示，高等級白牡丹茶中的氨基酸構成具有顯著的多樣性特征，共有17種氨基酸 （天冬氨酸、茶氨酸、精氨酸、γ-氨基丁酸、谷氨酰胺、色氨酸、絲氨酸、肌氨酸、脯氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、天冬酰胺）臨近特級白牡丹的質心，即它們與特級白牡丹的品質密切相關。相比較而言，一級樣品質心 （B）和二級樣品質心 （C）附近所集中的氨基酸則較少。通過載荷矩陣圖，可以進一步剖析各種類氨基酸對判別結果的貢獻程度，當變量與等級質心距離近時，則說明該變量其對樣品等級貢獻度大。

2.2?不同等級白牡丹茶游離氨基酸組分的味覺活性分析

表3的統(tǒng)計結果呈現(xiàn)了不同等級白牡丹茶樣品的氨基酸含量差異。不同等級間氨基酸總量存在顯著性差異，并與等級呈現(xiàn)明顯線性相關性，總量由高至低依次為：特級 （45.04±0.98）mg·g-1、一級 （37.92±0.88） mg·g-1、二級 （26.41±1.89） mg·g-1。具體到各種構成氨基酸而言，常量氨基酸中除丙氨酸在不同等級間不存在顯著差異外，其余氨基酸均存在差異。其中，尤以茶氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸這5種氨基酸差異顯著，含量越高則等級越高。從呈味上看，茶氨酸鮮爽帶甜，谷氨酰胺、天冬氨酸鮮甜帶酸，蘇氨酸呈微甜味;精氨酸呈苦味。由此可推斷，鮮甜味氨基酸對白茶的滋味等級間存在明顯的正相關，而苦味氨基酸則與其等級間存在負相關。

統(tǒng)計分析結果還顯示，特級白牡丹中的絲氨酸、脯氨酸、色氨酸、甘氨酸的含量顯著高于其他等級，而它們在一級與二級樣品間卻不存在顯著差異。從呈味上看，絲氨酸、脯氨酸、甘氨酸主要呈甜味;色氨酸則主要呈苦味。由此推斷，上述氨基酸會對于白茶滋味品質的進一步提升有促進作用。

不同等級的白牡丹茶具有各自的滋味特征，特級白牡丹的滋味特征為清甜醇爽、毫味足;一級白牡丹的滋味則較清甜、醇爽;二級白牡丹的滋味為尚清甜、醇厚。為了進一步研究不同等級白牡丹種各種氨基酸對滋味的貢獻，采用Dot值對滋味屬性的貢獻進行了量化分析，如表4所示，除對收斂性澀味有貢獻的γ-氨基丁酸外，其余氨基酸的Dot值均小于1。而且γ-氨基丁酸在茶湯中的DoT值與樣品等級呈現(xiàn)明顯線性相關，由高至低依次為：特級 （15.43）、一級 （14.45）、二級 （11.70）。因此，我們認為γ-氨基丁酸是白牡丹茶湯收斂性又一個重要來源，對白牡丹茶滋味品質的形成起重要的促進作用。

3?討論與結論

已有的研究肯定了氨基酸對茶葉鮮味貢獻作用[10，12]，但Dot的分析結果卻顯示，茶葉中絕對含量高的氨基酸，往往因其呈味閾值較高，基本都無法獨立地形成主要滋味屬性，故而筆者推測不同氨基酸組分間存在交互作用，進而以一種整體性的累積方式，對茶葉滋味，特別是鮮味的形成有貢獻作用。例如，茶葉中的茶氨酸，雖然呈味閾值較高，但是它是一種典型的鮮味增強劑，在與其他氨基酸共同存在時，會顯著降低其他氨基酸的呈味閾值;而茶葉中的谷氨酸可以顯著降低 EGCG 苦味的作用。茶氨酸和谷氨酸在茶湯苦味和鮮味的形成上具有明顯的交互和協(xié)同效應。此外，近年的研究還發(fā)現(xiàn)，茶葉中甘氨酸和脯氨酸對茶湯鮮味有協(xié)同增效作用[19，21-22]。因此，筆者認為白牡丹中游離氨基酸組分的比例關系對等級存在影響。

氨基酸含量可促進名茶香氣鮮爽風味和茶湯鮮醇滋味的形成[23]。白牡丹中游離氨基酸的總量、常量氨基酸含量的高低與白牡丹品質等級間存在密切相關性，其中茶氨酸、精氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸這4種氨基酸的絕對含量與白牡丹品質等級的緊密相關。這與陳丹等[13，24]對云南紅碎茶、永川秀芽茶的研究結果表明氨基酸總量隨茶葉品質等級依次遞減及阮宇成等[11]的研究結果表明茶氨酸、天冬氨酸、精氨酸的含量與綠茶品質呈極顯著正相關相同。

張丹丹等[17]的研究結果顯示茶氨酸、脯氨酸、甘氨酸、脯氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、丙氨酸是對白茶的甜味存在貢獻物質，其中谷氨酸還同時對白茶鮮味有貢獻。楊晨[20]的研究結果顯示白茶中除了γ-氨基丁酸外，其余氨基酸的濃度都遠低于其呈味閾值。本研究結果顯示，γ-氨基丁酸、絲氨酸、脯氨酸、色氨酸、甘氨酸的含量對于白牡丹茶滋味品質的提升有關鍵性作用。其中γ-氨基丁酸的DoT值與樣品等級呈現(xiàn)明顯線性相關，是白牡丹茶湯收斂性的主要來源，其余氨基酸都無法獨立呈現(xiàn)其滋味屬性，氨基酸對白牡丹鮮甜滋味的貢獻應該是多種氨基酸的整體作用的結果，與前人結論相符。

本研究涉及的3個等級白牡丹茶的游離氨基酸構成與其品質等級間存在密切相關性，不同氨基酸組分通過交互作用對白牡丹茶的滋味等級形成產(chǎn)生整體性的貢獻作用?？蔀榘啄档げ枳涛稑嫵杉捌焚|等級的科學評價提供基礎性參考。

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（責任編輯：黃愛萍）