建陽桔柚兩種真菌病原菌的鑒定

葛慈斌 黃素芳 阮傳清 肖榮鳳 劉韜

摘?要：【目的】明確引起福建建陽桔柚落葉、枝梢枯死的兩種病害的病原菌種類，為防治病害提供基礎(chǔ)。【方法】從建陽桔柚上采集典型發(fā)病葉片，進(jìn)行病原菌的分離、形態(tài)觀察和菌株rDNA-ITS 區(qū)序列比對、致病性測定。【結(jié)果】桔柚病葉片中分離出兩種主要病原真菌，代表菌株分別為FJAT-32214和FJAT-32151。菌株FJAT-32214在PSA培養(yǎng)基上的菌落顏色為灰褐色，產(chǎn)褐色分生孢子，多呈鏈狀分隔，其rDNA-ITS區(qū)序列與互隔交鏈孢霉Alternaria alternata的ITS序列相似性達(dá)99%;菌株FJAT-32151在PSA培養(yǎng)基平板上的菌絲呈灰白色，絨狀、茂密，后期會在菌落表面產(chǎn)生磚紅色孢子堆，分生孢子柱形或棒狀，單胞，無色， 其rDNA-ITS區(qū)序列與膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides 的ITS序列相似性也達(dá)99%，通過回接可引起樣本致病，分離獲得與接種物一致的病原物，符合Koch氏法則?！窘Y(jié)論】通過病原形態(tài)學(xué)與ITS序列分析，鑒定了發(fā)生在建陽桔柚葉片上的兩種主要真菌性病原，分別為引起褐斑病的互隔交鏈孢霉和炭疽病的膠孢炭疽菌。

關(guān)鍵詞： 建陽桔柚;病害鑒定;互隔交鏈孢霉;膠孢炭疽菌

中圖分類號：S 687文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1008-0384（2019）08-958-07

Abstract：【Objective】 To identify the pathogens of the severe defoliation and dieback diseases on Jianyang tangelos. 【Method】 Leaf specimens were collected from the diseased tangelo plants in Jianyang city. Microbial strains were isolated for morphological observation， pathogenicity determination， and sequence analysis on internal transcribed spacer （ITS） of ribosomal DNA for taxonomic identification. 【Result】 Separately， two strains were considered the pathogens for the diseases. The FJAT-32214 strain formed grayish brown colonies on a PSA medium and produced brown septate spores. Its rDNA-ITS sequences showed a 99% similarity with that of Alternaria alternata from NCBI. The other strain， FJAT-32151， formed on PSA gray-white， velvety， dense colonies with brick-red spore piles on the surface in late stage and produced columnar or rod-like， unicellular， colorless spores. The rDNA-ITS sequence of FJAT-32151 was 99% homologous with that of Colletotrichum gloeosporioides. Each of these isolated strains met Koch requirement with a challenge test by inoculation on healthy plants to show the typical morphological characteristics of the respective fungal disease. 【Conclusion】 It was confirmed that A. alternata was the pathogen that caused the brown spots disease， and C. gloeosporioides the anthracnose disease on the tangelos.

Key words：Jianyang tangelo; disease diagnosis; Alternaria alternata; Colletotrichum gloeosporioides

0?引言

【研究意義】建陽桔柚是由福建省建陽市農(nóng)業(yè)開發(fā)公司于20世紀(jì)80～90年代在從日本引進(jìn)的甜春桔柚基礎(chǔ)上，通過優(yōu)良變異單株選育而成的雜柑類品種[1]，是建陽市具有地方特色的名優(yōu)水果和主要經(jīng)濟(jì)作物，于2009年11月獲國家地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)。建陽桔柚果大質(zhì)優(yōu)，既有桔子的清香，又具柚子的脆甜，色澤金黃、汁多肉脆、清香爽口[2]，是醫(yī)藥、食品工業(yè)的重要原料;其果實性涼味甘，有生津止咳、潤肺化痰、理氣健胃、散結(jié)止痛、醒酒利尿等多種功效，在省內(nèi)外享有聲譽。為了提高建陽桔柚的產(chǎn)量和品質(zhì)，生產(chǎn)滿足人們需求的綠色果品，必須輔以良好的配套栽培管理技術(shù)，其中做好病害防治管理是關(guān)鍵;而明確各種病害的病原菌，是進(jìn)行病害防治的重要基礎(chǔ)。

【前人研究進(jìn)展】目前國內(nèi)外關(guān)于桔柚，特別是建陽桔柚主要病害的研究報道較少，僅有葉新[3]報道建陽桔柚病害主要是潰瘍病和炭疽病，其中炭疽病為害嚴(yán)重;劉韜等[4]也認(rèn)為，急性炭疽病是建陽桔柚的主要病害;也有部分建陽桔柚會被柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus， CTV）侵染而發(fā)生衰退病[5]。對柑橘真菌病害的研究報道較多，主要集中在柑橘瘡痂病Elsino?fawcettii[6]、炭疽病Colletotrichum gloeosporioides[7]、樹脂病Diaporthe sp.[8]、腳腐病Phytophthora parasitica[9]、黑斑病Phoma citricarpa[10]、煤煙病Capnodium citri[11]和灰霉病Botrytis cinerea[12]等。對作物病害的診斷方法，一般是田間實地觀察植株的發(fā)病癥狀，再加上對病菌的分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定等，這需要有較豐富的病害診斷經(jīng)驗，否則容易出現(xiàn)誤診。但現(xiàn)代分子生物學(xué)手段和特異性引物PCR擴(kuò)增等技術(shù)的應(yīng)用，為病害診斷提供了輔助措施，提高了病害診斷的準(zhǔn)確率。

【本研究切入點】目前為止，有關(guān)建陽桔柚生產(chǎn)過程中發(fā)生的褐斑病、炭疽病等病害還未見詳細(xì)的診斷報道，影響了對兩種病害的及時防治，進(jìn)而影響到建陽桔柚產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究調(diào)查、鑒定建陽桔柚上發(fā)生的兩種主要真菌性病害的病原菌，在病害癥狀與病原形態(tài)特征觀察的基礎(chǔ)上，利用分子鑒定方法進(jìn)一步分析確認(rèn)。

1?材料與方法1.1

試驗材料

1.1.1?試驗地點?試驗地點為位于福建省南平市建陽區(qū)宋慈桔柚果場。

1.1.2?試驗試劑、儀器?病原菌培養(yǎng)采用馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA），真菌基因組DNA提取試劑盒為DP2032，Taq酶（2.5 U·μL-1）[鉑尚（上海）生物技術(shù)有限公司]，100 bp Marker（上海英駿生物技術(shù)有限公司）;真菌樣品研磨儀為MP FastPrep-24（美國），凝膠成像儀（VP GelDoc-It TS Imaging System），PCR儀（Tpersonal Biometra）;引物合成由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司完成。

1.2?試驗方法

1.2.1?癥狀觀察

2018-2019年觀察建陽桔柚樹的發(fā)病情況，并在開花期、結(jié)果期和果實成熟期進(jìn)行病害調(diào)查，并于2019年4月23日從建陽桔柚樹的上部枝條中采集帶有典型病斑的發(fā)病葉片。病害癥狀以肉眼觀察為主，結(jié)合顯微鏡檢查進(jìn)行觀察描述[13]。

1.2.2?病原真菌的分離、培養(yǎng)和觀察

采用常規(guī)的組織分離法對發(fā)病葉片進(jìn)行病菌的分離[14]。切取病健交界處的新鮮組織0.5 cm×0.3 cm大小的薄片，經(jīng)75%酒精處理2 s，再用0.1%升汞處理2～3 min后，用無菌水清洗3遍，置于馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）上培養(yǎng)，每皿放5片病組織，共分離10個樣本，（25.0±1.5）℃培養(yǎng)96 h，從典型菌落邊緣挑取菌絲，接種在新的PSA平板上，直至獲得分離物的純培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)入試管斜面4℃保存和-80℃甘油保存。

將獲得純培養(yǎng)的分離物在光學(xué)顯微鏡下觀察、記錄其菌絲、分生孢子和分生孢子梗的形態(tài)、大小及色澤特征，并拍照。

1.2.3?病原真菌的分子鑒定

（1）菌絲DNA的提取：

接種菌株至PSA培養(yǎng)基平板，7 d后從平板上刮取菌絲約50 mg，放置于樣品收集管中（含石英砂與玻璃珠），采用真菌基因組DNA試劑盒提取各菌株的基因組DNA。含菌絲體的收集管加入預(yù)熱緩沖液FP1后，用樣品研磨儀（型號美國MP FastPrep-24）40 s研磨2次，具體步驟參照試劑盒的提取說明。

（2） rDNA-ITS區(qū)擴(kuò)增：?采用真菌ITS擴(kuò)增通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，正向引物（ITS4）：5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′，反向引物（ITS5）：5′-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3′PCR反應(yīng)的總體積為25 μL，含有1個單位的Taq酶、10×buffer 2.5 μL、dNTP 0.2 μL、10 μmol·L-1的正向引物和反向引物各1 μL、DNA模板25 ng。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性10 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，共25個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

（3） PCR產(chǎn)物的測序及比對分析：

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，送交鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行測序。將測得的序列在GenBank注冊、獲得登錄號，在網(wǎng)站NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）和CBS-KNAW（http：//www.westerdijkinstitute.nl）中進(jìn)行同源性比對分析;并選用同源種和近緣種的ITS基因序列，用軟件MEGA 7構(gòu)建相關(guān)系統(tǒng)發(fā)育樹（方法為Neighbour-Joining）[16-17]。利用bootstrap（1 000 次重復(fù)） 檢驗各分支的置信度[18]。

1.2.4?病原真菌的致病性測定

選擇新鮮無病的建陽桔柚嫩枝，采用針刺接種法，葉片皮下注射孢子懸液（含量為1.0×107 cfu·mL-1）20 μL于嫩葉上，接種部位用潤濕的濾紙保濕，培養(yǎng)3 d后去除濾紙，便于孢子萌發(fā)與侵染，嫩枝下部插入濕潤的棉球團(tuán)中保濕培養(yǎng)，接種后每天觀察發(fā)病情況，待發(fā)病特征明顯時，重新分離和鑒定病原菌。

2?結(jié)果與分析

2.1?病害癥狀

2.1.1?褐斑病的癥狀

該病害可為害建陽桔柚的葉片、新梢和果實，以新梢和幼果期發(fā)病受害最重。葉片染病初期為褐色針頭狀小點并伴有黃色暈圈，隨著時間推移，病斑迅速沿葉脈不斷擴(kuò)大，形成帶尾須狀的病斑，出現(xiàn)深褐色霉?fàn)钗?，大多?shù)病斑周圍還有明顯的黃色暈圈，這類病葉極易脫落（圖1）。

2.1.2?炭疽病的癥狀

該病害可引起建陽桔柚落葉、枝梢枯死、果實腐爛及落果。為害葉片有兩種癥狀類型：急性型（葉枯型）癥狀常從葉尖開始，初呈淡青色至暗褐色水漬狀病斑，病、健部位邊緣處很不明顯，后變?yōu)榈S或黃褐色，葉卷曲，葉片很快脫落;慢性型（葉斑型）多發(fā)生在成長葉片或老葉，從葉尖或近葉緣處開始，病斑圓形或近圓形，邊緣褐色或深褐色，中間灰褐色、稍凹陷，病健部交界明顯（圖2）。

2.2?病原真菌形態(tài)學(xué)鑒定

2.2.1?褐斑病病原菌形態(tài)特征

從發(fā)生褐斑病的建陽桔柚葉片上分離出的菌株FJAT-32214在PSA平板培養(yǎng)基上的菌落顏色為灰褐色，產(chǎn)生黑褐色色素浸入培養(yǎng)基內(nèi)，致菌落背面為黑褐色（圖3）;分生孢子褐色，單生或鏈生，梨形、棍棒形或近短橢圓形，多呈鏈狀分隔，長度8.5～30.1 μm、直徑8.2～19.6 μm;分生孢子梗簇生或單生，直立或頂端稍彎曲，有分隔（圖4）。參照陸家云[14]的相關(guān)描述，可初步將菌株FJAT-32214鑒定為鏈孢霉屬Alternaria sp.。

2.2.2?炭疽病病原菌的形態(tài)特征

從發(fā)生炭疽病的建陽桔柚葉片上分離出的菌株FJAT-32151在PSA培養(yǎng)基平板上的菌絲呈灰白色，絨狀、茂密，后期會在菌落表面產(chǎn)生磚紅色孢子堆，培養(yǎng)皿背面呈現(xiàn)不均勻的灰白色至黑褐色（圖5）;分生孢子梗粗短，無色或淡褐色，基部分枝，梗無隔膜;分生孢子柱形或棒狀，單胞，無色，表面光滑，兩端鈍圓，大小平均為15.8（13.4～19.5） μm×4.6（3.9～5.1） μm（圖6）。初步鑒定為炭疽菌屬Colletotrichum sp.。

2.3?病原菌的分子鑒定

將測序得到的菌株FJAT-32214、FJAT-32151的ITS序列提交到GenBank獲得基因登錄號分別為MN170555和MN170554，將2個菌株的ITS序列在NCBI、CBS-KNAW上進(jìn)行比對，結(jié)果表明，菌株FJAT-32214與互隔交鏈孢霉Alternaria alternata、菌株FJAT-32151與膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides的相似性均在99%以上。同時，為了更直觀地顯示這2個菌株分別與其他鏈格孢、炭疽菌的親緣關(guān)系，選用同源或近緣相應(yīng)序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明，F(xiàn)JAT-32214與Alternaria alternata、菌株FJAT-32151與Colletotrichum gloeosporioides均以高相似度聚類在一起，而同屬其他菌株的相似度則更低（圖7～8）。綜合病原菌的形態(tài)鑒定、NCBI與CBS-KNAW比對及系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結(jié)果，可以將這兩種病原菌菌株FJAT-32214、菌株FJAT-32151分別鑒定為Alternaria alternata與Colletotrichum gloeosporioides。

2.4?病原真菌的致病性測定

接種后約15 d，接種不同病原菌的桔柚葉片上出現(xiàn)明顯的褐斑?。▓D9）或炭疽病癥狀（圖10），重新分離感病部位的病健交界處病組織，可分離到與接種病原菌相同的病原菌，證實所分離的病原菌是桔柚的致病菌。

3?討論與結(jié)論

本文在田間病害調(diào)查的基礎(chǔ)上，結(jié)合病理學(xué)及分子生物學(xué)鑒定對建陽桔柚在田間主要發(fā)生的炭疽病、褐斑病兩種真菌性病害進(jìn)行調(diào)查分析。通過癥狀觀察、病原分離、致病性測定及分子鑒定確定了本次從建陽桔柚采集的炭疽病，其病原為膠孢炭疽菌C.?gloeosporioides，褐斑病的病原菌是互隔交鏈孢霉Alternaria alternata。

鏈孢霉（又名鏈格孢）是農(nóng)作物的主要致病菌之一，能引起糧食作物及果樹、蔬菜和花卉等多種經(jīng)濟(jì)作物產(chǎn)生病害，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[19]。在柑橘上，鏈孢霉可以引起4種病害，其中互隔交鏈孢霉橘致病性A.?alternate pathotype tangerine、柑橘鏈格孢褐斑病（Alternaria brown spot， ABS）可危害部分橘類、葡萄柚以及橘與柚、或橘與橙的雜交類柑橘，給感病柑橘品種生產(chǎn)帶來巨大的困難[20]。鏈格孢褐斑病最早發(fā)現(xiàn)于澳大利亞，之后在北美洲、南美洲、地中海國家和歐洲、非洲等地的柑橘產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[21]，是柑橘生產(chǎn)中的一大限制因素。在國內(nèi)，2010年Wang等[22]首次鑒定了云南省文山市塘房橘上的鏈格孢褐斑病，之后該病在重慶、浙江、湖南、廣東、廣西和四川等省區(qū)的紅橘、甌柑、椪柑、貢柑、八月橘、天草和默科特品種上均有發(fā)生，造成局部損失嚴(yán)重[23-24]。本研究則首次在建陽桔柚上鑒定到鏈格孢褐斑病。

由膠孢炭疽菌侵染引起的柑橘炭疽病是世界柑橘產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的重要病害之一[25]，也是一種周年流行的病害，其發(fā)病程度與氣候、栽培管理條件有著密切的關(guān)系。炭疽病是為害建陽桔柚較重的病害，可引起落葉、枝梢枯死，果實腐爛及落果;帶病果實常在儲運期間發(fā)生腐爛，所以其又是一種重要的采后病害。除了建陽桔柚外，廣東的德慶貢柑[25]、重慶地區(qū)的甜橙、溫州蜜柑、來檬等柑橘品種[26]、云南的塘坊橘[27]等都有發(fā)生嚴(yán)重炭疽病的報道。

因此，對于建陽桔柚上發(fā)生的褐斑病、炭疽病等真菌性病害，通過癥狀觀察與PCR擴(kuò)增鑒定相結(jié)合的早期診斷，有利于盡早針對性地開展藥物防治，防止病害的傳播、蔓延為害，減少病害造成的損失。

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（責(zé)任編輯：張?梅）