紫斑百合遠(yuǎn)緣雜交親和性分析及雜交障礙克服

郭朋輝 吳景芝 王玉英 鄭冉冉 吳紅芝

摘要：【目的】探究野生紫斑百合遠(yuǎn)緣雜交親和性及克服雜交障礙的措施，為野生紫斑百合資源開(kāi)發(fā)利用及具有綠色、清香、抗性等優(yōu)良性狀的百合新品種選育提供理論參考。【方法】以云南地區(qū)野生紫斑百合及栽培品系東方百合（7個(gè)品種）和OT百合（5個(gè)品種）為材料，采用切割花柱（CS）和常規(guī)授粉（NP）兩種方法進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，分析紫斑百合與東方百合和OT百合的遠(yuǎn)緣雜交親和性，通過(guò)熒光顯微技術(shù)觀察花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，并通過(guò)染色體法鑒定F1代的倍性?！窘Y(jié)果】常規(guī)授粉方式下，紫斑百合作母本的12個(gè)雜交組合中僅紫斑百合×索邦（NP）、紫斑百合×西諾紅（NP）和紫斑百合×布卡迪（NP）3個(gè)雜交組合的親和性相對(duì)較好，其他9個(gè)組合（NP）均雜交不親和，存在受精前障礙，但切割花柱授粉方式下，紫斑百合作母本的12個(gè)雜交組合均具有不同程度親和性，其中，紫斑百合×羅賓娜（CS）雜交親和性最佳，其子房膨大率、有胚率、雜種胚萌發(fā)率和親和指數(shù)分別為40.00%、15.12%、43.08%和6.05。以紫斑百合為父本的6個(gè)雜交組合在兩種授粉方式下的雜交親和性整體較差，僅切割花柱授粉方式下的羅賓娜×紫斑百合（CS）的子房膨大率和有胚率分別為20.00%和10.71%，其他5個(gè)雜交組合的子房假膨大或授粉后不久枯萎衰敗。紫斑百合×索邦（CS）授粉后其花粉管到達(dá)子房胚珠的時(shí)間比紫斑百合×索邦（NP）提前4 d，有利于減少花粉管伸長(zhǎng)過(guò)程中的營(yíng)養(yǎng)消耗及雜交障礙的克服。西諾紅×紫斑百合（NP）和黃天霸×紫斑百合（NP）2個(gè)雜交組合授粉8 h后花粉均在雌蕊柱頭上萌發(fā)，花粉管沿著花柱向下延伸，黃天霸×紫斑百合（NP）的花粉萌發(fā)量較西諾紅×紫斑百合（NP）少，但二者均在花柱和胚囊兩端出現(xiàn)不同程度的胼胝反應(yīng)，花粉管扭曲纏繞，阻礙花粉管伸長(zhǎng)及伸向胚珠完成受精。紫斑百合×白色眼睛（CS）的雜交后代組培苗染色體數(shù)為24條，屬二倍體;但紫斑百合×斯特騰（CS）和紫斑百合×維拉布蘭斯（CS）的雜交后代組培苗染色體數(shù)分別為26和28條，為非整倍體植株?！窘Y(jié)論】切割花柱授粉法可較好地克服紫斑百合與東方百合和OT百合遠(yuǎn)緣雜交受精前雜障礙，提高各雜交組合的子房膨大率、有胚率和雜種胚萌發(fā)率，且紫斑百合正反交組合的雜交親和性差異明顯，紫斑百合作母本的雜交組合較其作父本的雜交組合親和性好，說(shuō)明其雜交親和性具有單向性。

關(guān)鍵詞： 紫斑百合;遠(yuǎn)緣雜交;親和性;雜交障礙克服;倍性

中圖分類號(hào)： S682.265.036? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? ? ? ?文章編號(hào)：2095-1191（2019）09-1903-10

Abstract：【Objective】The study aimed to explore compatibility and the way to overcome the difficulties from distant hybridization of wild Lilium nepalense to provide a theoretical reference for the development of wild lily resources and the breeding of new lily varieties with good characteristics such as green， fragrance and resistance. 【Method】Wild L. nepa-lense in Yunnan and cultivated lines Oriental hybrids（seven varieties），OT hybrids（five varieties） were used as experimental materials，pollination was carried out by cut-style method（CS） and normal pollination（NP） to analyze the distant hybridization compatibility between L. nepalense and Oriental hybrids， OT hybrids. Pollen germination and pollen tube growth were observed by fluorescence microscopy method，ploidy of F1 hybrid progeny were identified by chromosome method. 【Result】Under conventional pollination style， in the 12 combinations of interspecific hybridization which wild L. nepalense was as female parent，only three combinations of L. nepalense×Sorbonne（NP）， L. nepalense×Viviana（NP） and L. nepalense×Bacardi（NP） had relatively good cross compatibility， but the other nine combinations（NP） with L. nepa-lense as female parent were all incompatible and had pre-fertilization obstacles. The 12 combinations by cutting style pollination all had compatibility with different levels. Among them，hybridization between L.nepalense and Robina was the best one，the ovary enlargement rate， embryo rate， germination rate and compatibility index of hybrid embryos were 40.00%， 15.12%， 43.08% and 6.05， respectively. The compatibility of six crossing combinations of L. nepalense as the male parent was poor under two pollination methods. Among the crossing combinations，only the ovary of crossing combination between Robina×L. nepalense（CS） by cutting style pollination developed，and the rate of ovary swelling and the rate of embryo developing were 20.00% and 10.71% respectively，but the ovaries of other five crossing combinations were pseudo-enlarged or withered shortly after pollination. When hybridization between L. nepalense as female parent and Sorbonne was used cutting style（CS） for pollination，the time of the pollen tube reached the ovule of the ovary which was 4 d earlier than normal pollination（NP）. So cutting style method could reduce the nutrient consumption during the elongation of the pollen tube，which was beneficial to overcome the hybridization obstacle.Two combinations of distant hybridization? Viviana×L. nepalense（NP） and Manissa×L. nepalense（NP） were carried out，the pollens of L. nepalense germinated on the stigma after 8 h of pollination，pollen germination of Manissa×L. nepalense（NP） was less than Viviana×L. nepalense（NP）. But there were some abnormal phenomena such as winding and transverse growth during the pollen tube extending toward the style，and strong callus reaction happened in pollen tube and ovule bead hole，which hindered the growth of the pollen tube and reaching to the ovule for fertilization by fluorescence microscopic observation. The results from chromosome observation showed that hybrid between L. nepalense×White eyes（CS） was diploid with 24 chromosomes;while hybrids between L. nepalense×Stentor（CS），L. nepalense×Villa Balance（CS） were aneuploid with 26 and 28 chromosomes respectively. 【Conclusion】Style-cutting pollination can overcome the pre-fertilization obstacles from distant hybridization between wild L. nepalense and Oriental hybrids，OT hybrids，and improve the ovary enlargement rate， embryonic rate and germination rate of each hybrid combination. There are great differences of compatibility in reciprocal crossing combinations when L. nepalense was used for parents. The combination with L. nepalense as female parent has better compatibility than that with L. nepalense as male parent. The results show that the hybridization compatibility is unidirectional.

Key words： Lilium nepalense; distant hybridization; compatibility; overcoming hybridization obstacles; ploidy

0 引言

【研究意義】我國(guó)是百合的起源地和分布中心，全世界百合屬植物約有115種，我國(guó)有55種，其中，云南有25種（傅立國(guó)等，2002）。紫斑百合（Lilium ne-palense）為百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）卷瓣組（Sect. Sinomartagon Comber）多年生球根花卉，其花為淡黃綠色，花朵外部綠色，內(nèi)部帶紫色斑點(diǎn)，花香清淡，單株花量多（6～10朵/株），抗病性和適應(yīng)性較強(qiáng)，觀賞價(jià)值較高，為云南最具利用前景的野生花卉資源之一（吳英英等，2013;李旦等，2017）。目前，百合栽培種中尚無(wú)綠花品種，因此，紫斑百合是培育綠花百合新品種的潛在親本之一（Lim and van Tual，2006）。通過(guò)育種可挖掘野生百合的優(yōu)良性狀，選育出花香、花色、抗性等性狀優(yōu)良的百合新品種（van Tuyl et al.，2011），其中，遠(yuǎn)緣雜交育種是提高抗病性、豐富花色和改良花期的重要途徑。因此，鑒于紫斑百合潛在的育種價(jià)值，探究其遠(yuǎn)緣雜交親和性及雜交障礙的克服方法，對(duì)紫斑百合與其他百合栽培種的雜交組合選配及百合新品種選育具有重要的現(xiàn)實(shí)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】亞洲百合、東方百合和OT百合是目前市場(chǎng)上流行的三大栽培品系，其中，東方百合和OT百合具有香味濃郁、花大、抗灰霉病等優(yōu)點(diǎn)，但其花色不夠豐富多樣，花香過(guò)濃，對(duì)鐮刀菌引起的腐爛病和病毒病的抗性差;亞洲百合雖然花小、普遍無(wú)香味，但具有豐富多樣的花色、對(duì)鐮刀菌和病毒病抗性強(qiáng)、清香型資源等優(yōu)點(diǎn)（van Tuyl et al.，2011;潘云兵等，2018）。國(guó)內(nèi)外對(duì)百合栽培品系與野生種間遠(yuǎn)緣雜交、新品種選育及優(yōu)化育種技術(shù)等進(jìn)行了大量研究（李守麗等，2006;van Tuyl et al.，2011），發(fā)現(xiàn)百合遠(yuǎn)緣雜交存在受精前和受精后障礙，即克服遠(yuǎn)緣雜交障礙是百合新品種選育的關(guān)鍵技術(shù)（van Tuyl et al.，2011;潘云兵等，2018），其中，切割花柱和胚搶救是克服百合遠(yuǎn)緣雜交受精前和受精后障礙的有效方法（van Tuyl et al.，2018）。Okazaki等（1994）對(duì)東方百合與亞洲百合遠(yuǎn)緣雜交進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胚搶救是獲得百合雜交后代的有效方法。van Tuyl等（2000）對(duì)麝香百合、湖北百合等7種野生百合與東方百合和亞洲百合的遠(yuǎn)緣雜交親和性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，麝香百合適宜作母本，切割花柱能克服受精前障礙。謝松林等（2010）分別以麝香百合、亞洲百合、東方百合和喇叭百合為親本，通過(guò)切割柱頭進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，并采用離體培養(yǎng)技術(shù)對(duì)雜種幼胚進(jìn)行搶救，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與自然條件下的種間雜交相比，切割柱頭法能不同程度地克服受精前障礙，不能克服受精后的胚敗育，但胚培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)和胚珠培養(yǎng)均可對(duì)雜種幼胚進(jìn)行搶救，順利得到雜種后代。van Tuyl等（2011）將麝香百合與亞洲百合雜交，利用胚搶救技術(shù)獲得LA雜種系，為清香型百合的培育提供了技術(shù)支持。高雪等（2015）對(duì)東方百合（O）、亞洲百合（A）和LA雜種系進(jìn)行雜交，結(jié)果表明，OA型或AO型遠(yuǎn)緣雜交的親和性障礙主要為受精后障礙。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的努力，近年來(lái)成功培育出較多遠(yuǎn)緣雜交品種，如OA雜交種（東方百合×亞洲百合）（van Tuyl et al.，2000;Barba-Gonzalez et al.，2004）、LO雜交種（麝香百合或新鐵炮百合×東方百合）（van Tuyl et al.，2000;Rhee and Kim，2008）和Kushi Maya（東方百合×紫斑百合）（van Tuyl et al.，2018）。【本研究切入點(diǎn)】國(guó)內(nèi)對(duì)紫斑百合的研究主要集中在居群生物學(xué)（何顯靜等，2003）、染色體核型變異（李標(biāo)等，2004）、組培繁育體系（吳英英等，2013）、資源調(diào)查評(píng)價(jià)（梁振旭，2014）、親緣關(guān)系分析（侯珺等，2016）和多倍體誘導(dǎo)（李旦等，2017）等方面，未見(jiàn)有關(guān)紫斑百合遠(yuǎn)緣雜交親和性、雜交障礙發(fā)生及克服的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以云南地區(qū)野生紫斑百合及栽培品系東方百合和OT百合為材料，采用切割花柱和常規(guī)授粉兩種方法進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，探究紫斑百合與東方百合和OT百合的遠(yuǎn)緣雜交親和性，利用熒光顯微技術(shù)觀察花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，分析遠(yuǎn)緣雜交障礙與花粉對(duì)柱頭識(shí)別或花粉管伸長(zhǎng)的相關(guān)性，并通過(guò)染色體法鑒定F1代的倍性，為野生紫斑百合資源開(kāi)發(fā)及綠色、清香、抗性等優(yōu)良性狀百合新品種選育提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試野生紫斑百合采自云南省紅河、玉溪、保山等地區(qū)，在溫室種植3年。供試栽培品系東方百合和OT百合均從市場(chǎng)購(gòu)買，其中，百合的7個(gè)品種為白色眼睛（White eyes，花重瓣、白色）、贊比西（Zambezi，花白色）、羅賓娜（Robina，花粉紅）、黃天霸（Manissa，花黃色）、維拉布蘭斯（Villa Balance，花白色）、斯特騰（Stentor，花白色帶淡粉邊）和卡沃內(nèi)羅（Carbonero，花粉色）;東方百合的5個(gè)品種為西伯利亞（Siberia，花白色）、索邦（Sorbonne，花粉色）、卡恩塔（Kayenta，花白色）、西諾紅（Viviana，花紅色）和布卡迪（Bacardi，花紅色）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 野生紫斑百合與東方百合和OT百合遠(yuǎn)緣雜交及胚搶救 試驗(yàn)于2017年6月—2018年10月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院園林系溫室進(jìn)行。雜交組合分為兩類：第一類以紫斑百合為母本、5個(gè)東方百合品種和7個(gè)OT百合品種為父本;第二類以紫斑百合為父本、3個(gè)東方百合品種和3個(gè)OT百合品種為母本，具體雜交組合信息如表1所示。母本花朵授粉前1～2 d，于早上去雄套袋，采集父本花粉保存?zhèn)溆谩４副净ǘ渲^粘液最多時(shí)，于8：00—11：00對(duì)各雜交組合分別采用切割花柱（Cutting style，CS）（留花柱基部1 cm授粉）和常規(guī)授粉（Normal pollination，NP）兩種方法進(jìn)行雜交，套上錫紙?zhí)?，掛牌記錄。授粉? d左右，除去錫紙?zhí)?，觀察子房膨大發(fā)育情況。授粉后35～60 d統(tǒng)計(jì)各雜交組合的子房膨大率、有胚率和親和指數(shù)。子房膨大率（%）=膨大子房數(shù)/授粉花朵數(shù)×100;有胚率（%）=有胚種子數(shù)/種子數(shù)×100;親和指數(shù)=子房膨大率×有胚率×100;雜種幼胚萌發(fā)率（%）=胚萌發(fā)數(shù)/胚搶救種子數(shù)×100。

胚搶救：在超凈工作臺(tái)上對(duì)膨大子房進(jìn)行消毒后，剝開(kāi)子房取出有胚種子進(jìn)行組織培養(yǎng)，獲得組培苗，統(tǒng)計(jì)雜種幼胚萌發(fā)率。胚搶救培養(yǎng)基配方：MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+蔗糖30 g/L+瓊脂6.25 g/L，pH 6.0。

1. 2. 2 遠(yuǎn)緣雜交親和性熒光觀察 參照杜文文（2013）的方法并略作改進(jìn)。取紫斑百合自交、紫斑百合×西諾紅（NP）、紫斑百合×索邦（CS和NP）、紫斑百合×黃天霸（NP）、西諾紅×紫斑百合（NP）和黃天霸×紫斑百合（NP）授粉后4、8、24、48、72、96、120和144 h的雌蕊（花柱連同子房），每個(gè)組合處理3朵花，雌蕊用FAA固定、保存?zhèn)溆?。壓片前，?0%酒精→50%酒精→30%酒精→蒸餾水逐級(jí)復(fù)水漂洗花柱及子房各3次，然后在4.0 mol/L NaOH中60 ℃下軟化2 h使其呈透明狀，蒸餾水沖洗數(shù)次后，用0.1%脫色水溶性苯胺藍(lán)（0.1 mol/L K3PO4配制）染色12 h以上，雌蕊在載玻片上縱切剖開(kāi)并展平壓片，Leica DM 3000熒光顯微鏡下觀察并照相。

1. 2. 3 雜交后代組培苗的倍性及形態(tài)觀察 將紫斑百合×白色眼睛、紫斑百合×斯特騰和紫斑百合×維拉布蘭斯3個(gè)雜交組合胚搶救的組培苗接種在生根培養(yǎng)基（MS+0.1 mg/L NAA+活性炭0.5 g/L+蔗糖60 g/L+瓊脂6.25 g/L，pH 6.0）中生根，待幼根生長(zhǎng)至1～2 cm時(shí)于8：00—11：00取幼根樣品，置于0.7 mmol/L放線菌酮溶液中4 ℃下預(yù)處理10 h，然后放入卡諾氏固定液（無(wú)水乙醇∶冰乙酸=3∶1）中4 ℃下處理12 h，最后將固定好的根置于70%酒精中4 ℃下保存?zhèn)溆?。制片前將固定好的根置?%纖維素酶和1%果膠酶混合液中37 ℃金屬浴中酶解50 min后，取出根用清水漂洗數(shù)次，吸干其表面水分置于載玻片上，用鑷子尖頭充分敲碎，用改良品紅染色5 min后制片，光學(xué)顯微鏡下觀察照相并記錄。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 紫斑百合與東方百合和OT百合的遠(yuǎn)緣雜交結(jié)果

2. 1. 1 紫斑百合作母本的雜交組合親和性 由表2和圖1可看出，常規(guī)授粉方式下，紫斑百合作母本的12個(gè)雜交組合雜交親和性存在明顯差異，且整體效果較差，其中紫斑百合×索邦（NP）、紫斑百合×西諾紅（NP）和紫斑百合×布卡迪（NP）3個(gè)雜交組合的子房膨大率分別為31.43%、32.76%和26.67%，有胚率分別為25.00%、23.41%和16.25%，雜種胚萌發(fā)率分別為10.59%、54.17%和34.62%，親和指數(shù)分別為7.86、7.67和4.33，說(shuō)明紫斑百合與索邦、西諾紅和布卡迪的雜交親和性較好，但以紫斑百合為母本的其他9個(gè)雜交組合（NP）均子房敗育，枯萎，不能正常膨大，說(shuō)明紫斑百合與西伯利亞、卡恩塔及7個(gè)OT百合品種雜交不親和，存在受精前障礙。

由表2和圖1還可看出，切割花柱授粉方式下，紫斑百合作母本的12個(gè)雜交組合具有不同程度雜交親和性，其中，紫斑百合×羅賓娜（CS）雜交親和性最佳，其子房膨大率、有胚率、雜種胚萌發(fā)率和親和指數(shù)分別為40.00%、15.12%、43.08%和6.05，其次是紫斑百合×索邦（CS），其子房膨大率、有胚率、雜種胚萌發(fā)率和親和指數(shù)分別為13.33%、31.75%、26.50%和4.23，以紫斑百合×西伯利亞（CS）的雜交親和性最差，雖然其子房膨大率較高，為17.5%，但有胚率和親和指數(shù)較低，分別為7.14%和1.25?？梢?jiàn)，切割花柱授粉法能有效提高以紫斑百合為母本的雜交組合親和性。

2. 1. 2 紫斑百合作父本的雜交組合親和性 從表2和圖2可知，紫斑百合作父本的雜交組合親和性差異較明顯。在兩種授粉方式下，黃天霸×紫斑百合（NP和CS）和白色眼睛×紫斑百合（NP和CS）授粉2周后子房發(fā)黑干枯，萎縮，未見(jiàn)子房膨大，子房膨大率、有胚率、雜種胚萌發(fā)率和親和指數(shù)均為0，表明這兩對(duì)雜交組合完全不親和，具有受精前障礙;西諾紅×紫斑百合（NP和CS）的有胚率、雜種胚萌發(fā)率和親和指數(shù)均為0，而子房膨大率分別為0和2.35%，其原因是切割柱頭授粉45 d后子房有膨大跡象，50 d后子房開(kāi)始枯萎，剝開(kāi)子房可見(jiàn)種子皺縮，存在假膨大現(xiàn)象，表明二者雜交親和性較差。在常規(guī)授粉方式下，雖然羅賓娜×紫斑百合（NP）和索邦×紫斑百合（NP）的子房膨大率均不為0，但有胚率、雜種胚萌發(fā)率和親和指數(shù)均為0，其原因是子房多為微膨大，不能正常發(fā)育成胚，說(shuō)明其雜交親和性較差。在切割柱頭授粉方式下，羅賓娜×紫斑百合（CS）的子房膨大，子房膨大率為20.00%，有胚率10.71%，從授粉到子房枯萎時(shí)間約70 d，但胚搶救后仍有胚種子未萌發(fā)?？梢?jiàn)，紫斑百合作父本的雜交組合存在受精前和受精后障礙。

2. 2 遠(yuǎn)緣雜交母本雌蕊中花粉管生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)熒光觀察

2. 2. 1 紫斑百合作母本的花粉管生長(zhǎng)情況 紫斑百合自交授粉4 h后，花粉開(kāi)始大量萌發(fā)生長(zhǎng)，萌發(fā)率達(dá)70.23%;24 h后大量花粉管伸向柱頭基部;48 h后花粉管成束到達(dá)花柱1/2處;96 h后花粉管到達(dá)花柱基部，開(kāi)始伸向子房;120 h后花粉管進(jìn)入子房，并向胚珠伸入（圖3-A）。紫斑百合×索邦（CS）授粉8 h后花粉粒萌發(fā)，花粉管開(kāi)始生長(zhǎng);24 h后花粉管逐漸伸入紫斑百合花柱基部;48 h后花粉管進(jìn)入子房，并開(kāi)始伸向胚珠;72 h后花粉管進(jìn)入胚珠;144 h后花粉管在子房1/2處停止生長(zhǎng)（圖3-B）。紫斑百合×索邦（NP）授粉4 h后，花粉在柱頭萌發(fā)量少，24 h后花粉大量萌發(fā)，花粉管迅速生長(zhǎng)，部分花粉管開(kāi)始進(jìn)入花柱授粉，96 h后花粉管到達(dá)子房頂端;120 h后花粉管進(jìn)入子房胚囊中（圖3-D）。紫斑百合×黃天霸（NP）授粉24 h后花粉大量萌發(fā)，部分花粉管生長(zhǎng)至紫斑百合柱頭基部;72 h后花粉管呈束狀到達(dá)花柱3/4處，花粉管發(fā)生胼胝反應(yīng);96 h后花粉管進(jìn)入子房并伸向胚珠（圖3-C）。紫斑百合×西諾紅（NP）在授粉48 h后花粉管出現(xiàn)纏繞扭曲現(xiàn)象;授粉72 h后花粉管在花柱中呈束狀，到達(dá)花柱的2/3處;授粉96 h后花粉管到達(dá)子房頂端;120 h后花粉管進(jìn)入子房胚囊中（圖3-E）。紫斑百合×白色眼睛（NP）授粉后4 h花粉開(kāi)始萌發(fā)，24 h后花粉在紫斑百合柱頭上萌發(fā)量少;48 h后僅少量花粉管到達(dá)花柱1/3處;72 h后花粉管出現(xiàn)纏繞打結(jié)和回旋，并伴隨胼胝反應(yīng)等異常現(xiàn)象;96 h后有少量花粉管到達(dá)子房;144 h后花粉管進(jìn)入子房胚囊，與胚珠接觸（圖3-F）。

2. 2. 2 紫斑百合作父本的花粉管生長(zhǎng)情況 以西諾紅×紫斑百合（NP）和黃天霸×紫斑百合（NP）為例，觀察紫斑百合作父本時(shí)花粉在柱頭和花粉管中的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，如圖4所示。西諾紅×紫斑百合（NP）和黃天霸×紫斑百合（NP）授粉8 h后花粉均在雌蕊柱頭上萌發(fā)，花粉管沿著花柱向下延伸，黃天霸×紫斑百合（NP）的花粉萌發(fā)量較西諾紅×紫斑百合（NP）少，但二者均在花柱和胚囊兩端出現(xiàn)不同程度的胼胝反應(yīng)，花粉管扭曲纏繞，阻礙花粉管伸長(zhǎng)及伸向胚珠完成受精。黃天霸×紫斑百合（NP）授粉96 h后花粉管在花柱2/3處停止生長(zhǎng)，未進(jìn)入子房;但西諾紅×紫斑百合（NP）授粉120 h后花粉管進(jìn)入子房?jī)?nèi)部，僅部分花粉管伸向胚囊，受精未成功。

2. 3 雜交后代組培苗形態(tài)及倍性觀察

由圖5可知，紫斑百合×白色眼睛（CS）的雜交后代組培苗染色體數(shù)為24條，為二倍體（圖5-C），但紫斑百合×斯特騰（CS）和紫斑百合×維拉布蘭斯（CS）的雜交后代組培苗染色體數(shù)均為非整倍體，分別為26（圖5-A）和28條（圖5-B）。由圖6可知，以紫斑百合作母本與布卡迪、西諾紅、索邦、白色眼睛、贊比西、羅賓娜、黃天霸、維拉布蘭斯和斯特騰的雜交組合（NP和CS）的幼胚經(jīng)胚搶救后可獲得幼苗，且幼苗長(zhǎng)勢(shì)健壯，而羅賓娜×紫斑百合（NP和CS）的幼胚胚搶救不成功。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，與紫斑百合自交組培苗相比，紫斑百合×白色眼睛（CS）、紫斑百合×斯特騰（CS）和紫斑百合×維拉布蘭斯（CS）的雜交后代組培苗葉片和根系生長(zhǎng)快，葉片肥厚，根系粗壯。

3 討論

雜交不親和是百合遠(yuǎn)緣雜交的重要障礙，其中，花粉不能在雌蕊柱頭上萌發(fā)或花粉管在母本花柱中發(fā)生異常生長(zhǎng)是受精前障礙的主要原因（杜文文，2013），目前克服受精前不親和性的最有效措施是切割花柱授粉（van Tuyl et al.，1991;李婕等，2013）。本研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)授粉方式下，紫斑百合作母本的12個(gè)雜交組合中僅紫斑百合×索邦（NP）、紫斑百合×西諾紅（NP）和紫斑百合×布卡迪（NP）3個(gè)雜交組合親和性較好，其他9個(gè)組合（NP）均表現(xiàn)為雜交不親和，存在受精前障礙，但切割花柱授粉方式下，紫斑百合作母本的12個(gè)雜交組合具有一定的雜交親和性。可見(jiàn)，與常規(guī)授粉法相比，采用切割花柱授粉法可明顯提高紫斑百合遠(yuǎn)緣雜交親和性，與李婕（2013）、雷家軍等（2014）發(fā)現(xiàn)不同授粉方法下亞洲百合遠(yuǎn)緣雜交親和性的研究結(jié)果基本一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，紫斑百合作母本的雜交組合子房膨大率、有胚率和親和指數(shù)整體上較紫斑百合作父本的對(duì)應(yīng)雜交組合高，紫斑百合作父本的雜交組合存在受精前和受精后障礙，說(shuō)明紫斑百合的雜交親和性具有單向性。綜上所述，切割花柱授粉可較好地克服紫斑百合與東方百合和OT百合遠(yuǎn)緣雜交受精前雜障礙，提高雜交組合的子房膨大率、有胚率和雜種胚萌發(fā)率，且紫斑百合正反交組合的雜交親和性差異明顯，推測(cè)紫斑百合雜交親和性具有單向性，表明不同授粉方式和正反交對(duì)紫斑百合遠(yuǎn)緣雜交親和性的影響不同。

用熒光顯微技術(shù)可直接追蹤花粉管在遠(yuǎn)緣雜交過(guò)程中的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，對(duì)分析花粉管的生長(zhǎng)特性及受精前障礙的抑制部位非常重要，同時(shí)有助于篩選親和性高的雜交組合（王文和等，2007）。植物生殖遺傳學(xué)研究表明，花粉管中適當(dāng)形成胼胝質(zhì)可保護(hù)性母細(xì)胞免受其他因子的影響，但遠(yuǎn)緣雜交時(shí)常引起胼胝質(zhì)沉積過(guò)多而形成胼胝質(zhì)塞，抑制花粉管伸長(zhǎng)，從而導(dǎo)致雜交不親和（王元軍，2005）。本研究利用熒光顯微技術(shù)發(fā)現(xiàn)，以紫斑百合為母本時(shí)東方百合和OT百合花粉均能在紫斑百合柱頭上萌發(fā)，花粉管中胼胝反應(yīng)不強(qiáng)烈，未形成胼胝質(zhì)塞，花粉管能順利到達(dá)子房并伸向胚珠，推測(cè)紫斑百合作母本的雜交組合雜交障礙主要為受精后障礙;以紫斑百合為父本時(shí)，雖然花粉能正常萌發(fā)，但花粉管在花柱伸長(zhǎng)過(guò)程中和胚珠珠孔處出現(xiàn)強(qiáng)烈胼胝質(zhì)反應(yīng)從而形成胼胝質(zhì)塞，花粉管生長(zhǎng)纏繞扭曲和橫向生長(zhǎng)，抑制花粉管伸長(zhǎng)，無(wú)法伸入胚珠，最終導(dǎo)致受精失敗，說(shuō)明紫斑百合作父本存在受精前障礙，與王文和等（2007）、高雪等（2015）研究發(fā)現(xiàn)亞洲百合遠(yuǎn)緣雜交花粉管生長(zhǎng)異常導(dǎo)致不親和的結(jié)論基本一致。杜文文（2013）對(duì)亞洲百合與鐵炮百合正反交組合的親和性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)組合的花粉均可在柱頭上萌發(fā)，但花粉管分別在柱頭乳突細(xì)胞和花柱通道細(xì)胞中發(fā)生胼胝反應(yīng)，正反交組合花粉管的平均生長(zhǎng)速度存在明顯差異，采用切割花柱授粉和子房授粉結(jié)合胚培養(yǎng)可克服雜交障礙，提高雜種胚的概率。本研究結(jié)果表明，紫斑百合×索邦（CS）授粉后其花粉管到達(dá)子房胚珠的時(shí)間比紫斑百合×索邦（NP）提前4 d，可減少花粉管伸長(zhǎng)過(guò)程中的營(yíng)養(yǎng)消耗，有利于克服雜交障礙，說(shuō)明切割花柱授粉法不僅可克服花粉與柱頭不能相互識(shí)別或花粉管在花柱中生長(zhǎng)受到抑制的障礙，還可縮短花粉管到達(dá)子房的時(shí)間，減少花粉管生長(zhǎng)過(guò)程中的營(yíng)養(yǎng)消耗，提高雜交親和性。栗艷齡等（2012）對(duì)切花百合雜種胚搶救方法進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同胚組織、胚齡和培養(yǎng)基中激素濃度配比均會(huì)對(duì)胚萌發(fā)及其成活產(chǎn)生影響。本研究發(fā)現(xiàn)，羅賓娜×紫斑百合雜交后代的幼胚搶救不成功可能是由于胚發(fā)育不良、胚乳敗育、培養(yǎng)基配方不適宜等多方面的原因造成，具體原因有待進(jìn)一步探究，但對(duì)紫斑百合作母本的雜交組合后代進(jìn)行胚搶救，未成熟幼胚能萌發(fā)，幼苗長(zhǎng)勢(shì)好，葉片肥厚，根系粗壯，植株健壯。可見(jiàn)，以紫斑百合為親本的遠(yuǎn)緣雜交后代雜種優(yōu)勢(shì)顯著，利用其培育百合新品種具有巨大的潛力。在今后的研究中應(yīng)對(duì)紫斑百合花色和花香及其與東方百合和OT百合的親緣關(guān)系和雜交后代鑒定進(jìn)行深入研究，為提高紫斑百合觀賞品質(zhì)及改良栽培百合創(chuàng)造新品種提供理論參考。

4 結(jié)論

切割花柱授粉方式可較好地克服紫斑百合與東方百合和OT百合遠(yuǎn)緣雜交受精前雜障礙，提高各雜交組合的子房膨大率、有胚率和萌發(fā)率，且紫斑百合正反交組合的雜交親和性差異明顯，紫斑百合作母本的雜交組合較其作父本的雜交組合親和性好，說(shuō)明其雜交親和性具有單向性。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）