酸法和酶法提取羅非魚魚皮膠原蛋白特性分析

王晴　曹穩(wěn)根　錢玉梅　李紅俠　汪慧文

摘要：以羅非魚魚皮為材料，利用醋酸和胃蛋白酶分提取膠原蛋白，通過紫外光譜、紅外光譜、吸油性、保水性、溶解性等對(duì)其理化特性進(jìn)行比較分析.結(jié)果表明兩者在230nm左右出現(xiàn)最大紫外吸收峰，均屬典型的膠原蛋白;紅外顯示兩種蛋白結(jié)構(gòu)相似;酶溶性膠原蛋白吸油性優(yōu)于酸溶性膠原蛋白，且兩者都有很好的保水性和溶解性.以期為膠原蛋白的提取及應(yīng)用提供理論依據(jù).

關(guān)鍵詞：羅非魚;提取;膠原蛋白;特性

中圖分類號(hào)：TS201.2? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1673-260X（2019）09-0090-03

羅非魚是世界第三大養(yǎng)殖品種，在我國(guó)養(yǎng)殖量居第二[1].目前，其主要用來(lái)生產(chǎn)冷凍魚肉片，因此會(huì)留下60%～70%下腳料，包括魚皮、魚頭、魚鰭和魚骨，其中魚皮中含有豐富的膠原蛋白[3]，對(duì)其進(jìn)行有效利用，避免浪費(fèi)的同時(shí)還可減少環(huán)境污染[2].

膠原蛋白是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多、分布最廣的功能性蛋白質(zhì)，它構(gòu)成了動(dòng)物皮的支持組織，具有增強(qiáng)機(jī)體皮膚組織細(xì)胞儲(chǔ)水能力、增強(qiáng)肌膚彈性、保持皮膚柔軟、使皮膚細(xì)嫩等生理功能，其理化性質(zhì)和生物學(xué)特性優(yōu)良，在醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)和化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛.膠原蛋白的提取分離方法包括熱水提法、酸提法、酶提法等[4].

醋酸酸法和胃蛋白酶酶法提取膠原蛋白，通過紫外光譜、紅外光譜以及吸油性、保水性、溶解性測(cè)定對(duì)兩者理化特性進(jìn)行分析比較，以期為膠原蛋白的提取及應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

羅非魚魚皮產(chǎn)自江蘇連云港飛凡水產(chǎn)公司;羥脯氨酸購(gòu)于Sigma公司;氯化鈉、異丙醇、胃蛋白酶、正丙醇、無(wú)水乙酸鈉、乙酸、硫酸銅、檸檬酸購(gòu)于上海國(guó)藥，均為分析純.

1.2 試驗(yàn)儀器

SC-3612離心機(jī)（江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司）、ST3100酸度計(jì)（奧豪斯儀器有限公司）、SP-723分光光度計(jì)（光譜儀器有限公司）、Nicolet IS50傅立葉變換紅外光譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）等.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 魚皮預(yù)處理

將魚皮烘干，粉碎，5%氯化鈉浸泡6h，蒸餾水洗滌數(shù)次并瀝干水分，置于異丙醇、乙醚與蒸餾水體積比為2：2：8的溶液中浸泡6h，蒸餾水洗滌數(shù)次后瀝干水分并在55℃恒溫干燥箱中烘干備用[5].

1.3.2 酸溶性膠原蛋白（ASC）的制備

按料液比1：20加入預(yù)處理所得魚皮和0.5mol/L乙酸，磁力攪拌24小時(shí)，離心得到上清，加入氯化鈉使得濃度至0.9mol/L，靜置過夜.6000r/min離心20min，舍棄上清，沉淀加入10倍體積0.1mol/L的乙酸進(jìn)行溶解，并在10倍體積的0.1mol/L乙酸溶液中透析12h，每4h換一次透析液，蒸餾水透析至中性，得到酸溶性膠原蛋白提取液，冷凍干燥得到酸溶性膠原蛋白（ASC）[6].

1.3.3 酶溶性膠原蛋白（PSC）的制備

將預(yù)處理后的魚皮按料液比1：20加入0.5mol/L乙酸中，并加入魚皮質(zhì)量2%的胃蛋白酶.磁力攪拌提取24h，離心取上清，加入一定質(zhì)量的氯化鈉至上清液氯化鈉溶液最終濃度為0.9mol/L，靜置過夜.6000r/min離心20min，棄上清，加入10倍體積的0.1mol/L的乙酸中溶解沉淀，并在10倍體積的0.1mol/L乙酸溶液中透析12h，每4h換一次透析液，蒸餾水透析至中性，得到酶溶性膠原蛋白提取液，冷凍干燥得到酶溶性膠原蛋白（PSC）[6].

1.3.4 膠原蛋白得率計(jì)算

膠原蛋白得率/%=（凍干膠原蛋白粗品質(zhì)量/提取用魚皮質(zhì)量）×100（1）

1.3.5 紫外吸收光譜分析

將酸溶性膠原蛋白提取液和酶溶性膠原蛋白提取液，以0.5mol/L的醋酸作為對(duì)照，在200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，得到膠原蛋白紫外吸收曲線[7].

1.3.6 紅外光譜分析

采用傅里葉紅光譜儀對(duì)ASC和PSC進(jìn)行紅外掃描，分別將適量的ASC和PSC與KBr混合壓片，在400～4000cm-1波數(shù)區(qū)間掃描，分辨率4cm-1[8，16].

1.3.7 溶解性測(cè)定

取一定質(zhì)量ASC、PSC溶于0.5mol/L醋酸中，使得濃度為5mg/mL.取5mL分別調(diào)至pH為4、5、6、7、8、9，保持pH值不變，蒸餾水定容至10mL，4000r/min離心15min，雙縮脲法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)含量，并同時(shí)將樣品溶于0.5mol/L醋酸溶液采用雙縮脲法測(cè)定樣品總蛋白含量，用公式（2）計(jì)算溶解性[7].

溶解性%=（上清液蛋白質(zhì)量/總蛋白質(zhì)量）×100 （2）

1.3.8 吸油性測(cè)定

取兩份10mL精煉油，分別加入0.1g ASC和PSC，振蕩器震蕩1min，靜置半小時(shí)，于200r/min離心25min，按公式（3）計(jì)算吸油性[7].

X=（10.0-v）/m? ?（3）

式中：X為吸油性/（mL/g）;Vf為游離油的體積/mL;m為0.1g.

1.3.9 保水性測(cè)定

量取50mL蒸餾水，加入ASC和PSC 0.05g，攪拌，置于1000r/min條件下離心5min，棄分離水，稱量殘留物質(zhì)量，并置于25℃干燥箱中，每隔20min測(cè)一次質(zhì)量，按公式（4）計(jì)算水分殘存率[7]，以其衡量?jī)烧弑Ｋ詮?qiáng)弱.

Y%=（m-m/m-0.05）×100? （4）

式中：Y表示水分殘存率%;m0表示離心剩余物質(zhì)量/g;m表示每隔一段時(shí)間剩余物質(zhì)量/g.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取液膠原蛋白得率

在酸性條件下，蛋白質(zhì)分子之間離子鍵遭到破壞，發(fā)生膠原纖維膨脹、溶解現(xiàn)象，因而可利用酸法提取膠原蛋白;酶法提取是利用蛋白酶使膠原溶解[9].由圖1可得，酶法提取膠原蛋白得率較酸法提取高，且提高近2倍.

2.2 紫外吸收光譜分析

對(duì)酸溶性膠原蛋白提取液和酶溶性膠原蛋白提取液在紫外光區(qū)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描測(cè)試，得到的紫外掃描曲線如圖2所示，由于膠原蛋白共軛氨基酸含量較少，在280nm波長(zhǎng)處無(wú)吸收峰，而在225nm左右有最大吸收峰，試驗(yàn)結(jié)果符合膠原蛋白的吸收特征[10]，且雜峰較少，表明提取膠原蛋白純度較高.

2.3 紅外光譜分析

如圖3所示，ASC和PSC產(chǎn)生的吸收峰形狀和位置基本一致，在4000～3000cm-1范圍內(nèi)，ASC和PSC均有一個(gè)較寬的峰，分別在3450cm-1和3440cm-1處，是由酰胺A帶所產(chǎn)生[11];PSC在2000～1000cm-1波數(shù)內(nèi)出現(xiàn)三個(gè)強(qiáng)而窄的吸收峰，其中1640cm-1處吸收峰是由膠原蛋白酰胺I帶產(chǎn)生，在1550cm-1（ASC）和1560cm-1（PSC）處的吸收峰是由膠原蛋白酰胺II帶產(chǎn)生，1390cm-1處為酰胺III帶吸收峰，綜上表明PSC和ASC主體結(jié)構(gòu)均保留比較完整.

2.4 溶解性

溶解度指物質(zhì)在特定溶劑中溶解的最大限度，其在天然蛋白質(zhì)提取、分離和純化時(shí)起到重要作用，蛋白質(zhì)變性程度也可通過蛋白質(zhì)的溶解行為的變化作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，此外蛋白質(zhì)在飲料中的應(yīng)用也與其溶解性能有直接的關(guān)系[12].

如圖4所示，隨著pH值的上升，PSC和ASC的溶解性先快速下降又逐漸趨于平緩.pH=4時(shí)PSC和ASC的溶解性最好，ASC可達(dá)80%，PSC達(dá)63%，而pH在7～9時(shí)膠原蛋白的溶解性較差，在30%左右.膠原蛋白溶解性隨pH的變化跟其等電點(diǎn)位置有關(guān)，當(dāng)處于等電點(diǎn)，兩性離子達(dá)到電荷平衡，溶解度達(dá)到最低[13-14]，因此結(jié)果表明羅非魚魚皮膠原蛋白等電點(diǎn)位于7附近.

2.5吸油性

圖5可見，ASC和PSC的吸油能力約為30mL/g和49mL/g.PSC的吸油性更佳，可能與胃蛋白酶作用于酶切位點(diǎn)使得較多疏水基團(tuán)暴露，使得酶溶性膠原蛋白吸油能力增加，且研究表明，蛋白質(zhì)吸油性跟其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[15].

2.6 保水性

保水性指當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)受到外力作用時(shí)其保持水分的能力，受濃度、離子種類以及環(huán)境等影響[7].ASC和PSC在25℃條件下隨時(shí)間改變保水性的變化如圖6所示，水分殘存率隨時(shí)間增加逐漸下降，但ASC保水性較PSC下降緩慢，可能由于醋酸和胃蛋白酶對(duì)親水基團(tuán)的作用差異，使得暴露的親水基團(tuán)不同360min后，ASC和PSC的水殘存率仍然在90%作用，保水性均優(yōu)良.

3 結(jié)論與討論

酸法和酶法提取羅非魚魚皮膠原蛋白并比較其理化性質(zhì)，兩種方法提取得到的膠原蛋白主體結(jié)構(gòu)基本一致，均保留較完整;但從得率、溶解性和吸油性的角度，酶法提取得到的膠原蛋白更優(yōu)，而酸法提取的膠原蛋白保水性較好，因此，醋酸法和胃蛋白酶法提取的膠原蛋白可應(yīng)用于不同的領(lǐng)域.

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參考文獻(xiàn)：

〔1〕鞏育軍，郭先霞，李瑞偉，等.羅非魚營(yíng)養(yǎng)成分研究進(jìn)展[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2009（11）：50-52.

〔2〕Zheng S K， Zheng C H， Lin H， et al. Isolation and cliaracterization of acid-solubilised collagen from the skin of Nile tilapia （Oreochromis niloticus） [J]. Food Chemistry， 2009， 116：879-883.

〔3〕倪娜.羊血漿蛋白-肌原纖維蛋白復(fù)合凝膠形成的作用力分析[D].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2014.27-30.

〔4〕郅慧，于慧，張輝，等.動(dòng)物源膠原蛋白提取及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].吉林中醫(yī)藥，2019，39（02）：225-227.

〔5〕田宏，張春華，陳山喬，等.羅非魚頭磷脂組成及其化學(xué)特性[J].赤峰學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，32（24）：11-14.

〔6〕王曉軍，吳婷，賈偉，等.酸法和酶法提取牦牛骨膠原蛋白的特性分析[J].食品科學(xué)，2018，39（12）：101-106.

〔7〕包玉龍，陳孫福，羅永康.酸法和酶法提取鱷魚皮膠原蛋白及性質(zhì)研究[J].肉類研究，2012，26（07）：1-4.

〔8〕Z·elechowska E， Sadowska M， Turk M. Isolation and some properties of collagen from the backbone of Baltic cod （Gadus morhua）[J]. Food Hydrocolloids， 2010， 24（4）： 325-329.

〔9〕張敏.酸法和酶法提取齊口裂腹魚皮膠原蛋白及鑒定性質(zhì)研究[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

〔10〕辛菲.鲅魚皮膠原蛋白的提取及分子特性的初步研究[D].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

〔11〕黃石溪，陳桂平，羅燦，等.酸法和酶法提取鮰魚皮膠原蛋白的工藝研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊），2013（16）：51-54.

〔12〕Zhenying H， Liang Q， Yong S， et al. Improvement of the solubility and emulsifying properties of rice bran protein by phosphorylation with sodium trimetaphosphate[J]. Food Hydrocolloids， 2019（96）：288-299.

〔13〕王碧，賈冬英，羅紅平，等.皮邊角廢料提取膠原蛋白的功能特性[J].中國(guó)皮革，2002（15）：13-16.

〔14〕肖桂華，朱蓓薇，董秀萍，等.鮑魚腹足不同部位的質(zhì)構(gòu)特性及組織結(jié)構(gòu)研究[J].食品科技，2010，35（11）：155-159.

〔15〕孫冰玉，石彥國(guó).微波對(duì)醇提大豆?jié)饪s蛋白吸油性的影響[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2006（05）：97-100.