花生殼分級(jí)萃取物對(duì)大腸桿菌抑制作用的研究

鄧麗莎　施宇萌　王榮雪　馮若晨　王沁梅　戚馨月　汪海峰　周建新

[摘要]通過(guò)濾紙片法、平板計(jì)數(shù)法和生長(zhǎng)曲線法等方法研究了花生殼分級(jí)萃取物對(duì)大腸桿菌的抑制作用。結(jié)果表明，不同溶劑花生殼萃取物對(duì)大腸桿菌的抑制作用存在差異性，乙酸乙酯萃取物抑菌效果最強(qiáng)，而且濃度越大，抑菌效果越強(qiáng)。不同溶劑花生殼萃取物對(duì)大腸桿菌的MIC和MBC也存在差異，乙酸乙酯萃取物最低，分別為31.255mg/mL和62.5mg/mL。其抗菌能力與萃取物中總多酚含量呈正相關(guān)，初步判定起主要抗菌作用的物質(zhì)是多酚類。本研究為花生殼開(kāi)發(fā)成高附加值天然糧食防霉劑或食品防腐劑提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]花生殼;分級(jí)萃取物;大腸桿菌;抑菌作用

中圖分類號(hào)：TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.201909

花生是我國(guó)重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物，年產(chǎn)量達(dá)到1 450萬(wàn)t以上，加工成花生仁、油等過(guò)程中每年產(chǎn)生約450萬(wàn)t的花生殼。黃酮類、多酚類物質(zhì)在花生殼中含量較高，具有抗菌、抗氧化、降血脂和膽固醇和治療冠心病的作用[1]。但與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我國(guó)花生殼資源的開(kāi)發(fā)和利用程度還相距甚遠(yuǎn)，僅作為燃料和肥料使用，用作農(nóng)副產(chǎn)品下腳料方面尚未得到有效開(kāi)發(fā)。林姣[2]研究表明花生殼含有豐富的黃酮類化合物，其中木犀草素含量較多且具有抗菌作用。楊洋等[3-4]確定了花生殼木犀草素最佳提取工藝，測(cè)定了花生殼木犀草素抑菌特性，其抑菌活性強(qiáng)于同濃度的山梨酸和亞硝酸鈉。陳春濤等[5]以甲醇粗提、溶劑梯度萃取配合抑菌活性跟蹤檢測(cè)，得到了花生殼乙酸乙酯組分，并用酸堿沉淀、柱層析等法純化得到3種化合物，發(fā)現(xiàn)這3種化合物都有一定抑菌效果。邢俊紅[6]采用濾紙片抑菌圈法探討花生殼多酚類物質(zhì)對(duì)3種常見(jiàn)細(xì)菌的抑菌效果，結(jié)果表明花生殼多酚類物質(zhì)對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的生長(zhǎng)有很好的抑制作用，且對(duì)大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)。也有國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究或報(bào)道了黃酮類化合物的安全性，表明是無(wú)毒物質(zhì)[7]，這些研究表明花生殼提取物具有抗菌性，具有作為天然糧食防霉劑或食品防腐劑的開(kāi)發(fā)潛力，而不同溶劑的花生殼分級(jí)萃取物的抗菌性研究未見(jiàn)報(bào)道。以食品中常見(jiàn)的腐敗菌和致病菌大腸桿菌為對(duì)象，研究了不同溶劑的花生殼分級(jí)萃取物對(duì)其的抑制作用，初步探索了抗菌機(jī)理，為其開(kāi)發(fā)高附加值天然糧食防霉劑或食品防腐劑和高效開(kāi)發(fā)花生殼資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

大腸桿菌：江蘇省疾病預(yù)防控制中心微生物試劑廠;牛肉膏、蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;瓊脂：石獅市環(huán)球瓊膠工業(yè)有限公司;平板計(jì)數(shù)瓊脂：海博生物技術(shù)有限公司;石油醚、氯仿、乙酸乙酯（AR）：廣東光華科技股份有限公司;無(wú)水乙醇（AR）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;蒸餾水：實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 主要儀器與設(shè)備

FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司;SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠;101-34S型電熱鼓風(fēng)干燥器：上海蘇進(jìn)儀器設(shè)備廠;LDZX-50FBS型立式高壓蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠;GNP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;U-3900型紫外可見(jiàn)光光度計(jì)：日立高新技術(shù)公司;HZ1001A型電子天平：上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司;BSC-1300ⅡA2 型生物安全柜：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠;ZQTY-70S型大容量低溫?fù)u床：上海知楚儀器有限公司;TDL-5-A型臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠;鍍鉻游標(biāo)卡尺（0～150mm）：桂林量具廠。

1.3 花生殼分級(jí)萃取物的制備

選取產(chǎn)自江蘇省南通市的優(yōu)質(zhì)花生，手工剝殼并除去發(fā)黑、蟲洞品。將花生殼清洗瀝干后置于50℃烘箱中烘干4h，粉碎過(guò)40目篩。稱取400.00g花生殼粉，濾布包扎，置于索氏抽提器內(nèi)，先用石油醚萃取8h，收集石油醚溶液，過(guò)濾，旋蒸后冷凍干燥，得到石油醚萃取物，4℃保存?zhèn)溆?。用相同的方法，?duì)過(guò)濾后的殘?jiān)来斡寐确?、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇和蒸餾水萃取，分別得到氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、無(wú)水乙醇萃取物和蒸餾水萃取物，用50%乙醇溶液定容至400mL，此時(shí)不同溶劑花生殼萃取物的濃度均為1 000mg/mL（原料花生殼/定容體積），并對(duì)萃取物倍比稀釋成500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、62.5mg/mL、32.15mg/mL。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 濾紙片法測(cè)定花生殼分級(jí)萃取物對(duì)大腸桿菌抑菌圈

取0.1mL大腸桿菌肉湯培養(yǎng)液（106-107CFU/mL）均勻涂布于平板計(jì)數(shù)瓊脂平板上，將直徑為6mm無(wú)菌濾紙片置于制備的萃取物溶液中浸泡3h，取出瀝干后3個(gè)1組呈正三角形平鋪皿中，以50%乙醇作為對(duì)照。倒置培養(yǎng)（36±1℃，24h）。用游標(biāo)卡尺十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.4.2 平板計(jì)數(shù)法測(cè)定花生殼分級(jí)萃取物對(duì)大腸桿菌抑制率

在平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基中按照5%的添加量分別加入制備的不同溶劑和梯度濃度萃取物，同樣以50%乙醇作為對(duì)照。滅菌，冷卻，加入1mL大腸桿菌肉湯培養(yǎng)液，混勻，傾注平板。倒置在恒溫箱培養(yǎng)（36±1℃，24h），計(jì)數(shù)，計(jì)算抑菌率。

（1）

1.4.3 花生殼乙酸乙酯和無(wú)水乙醇萃取物對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響

試管中分別加入8mL肉湯培養(yǎng)基，0.5mL的500mg/mL、250mg/mL的花生殼乙酸乙酯和無(wú)水乙醇萃取物和1mL的大腸桿菌肉湯培養(yǎng)液，混勻，搖床培養(yǎng)（36±1℃，120 r/min），并在培養(yǎng)0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h時(shí)取出相應(yīng)的試管，振蕩器上振蕩10s，使菌體均勻懸浮于培養(yǎng)基中，立即用紫外分光光度計(jì)600nm處測(cè)吸光度[8-9]。

1.4.4 花生殼分級(jí)萃取物最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定

準(zhǔn)確量取10 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基分裝試管。配制含不同濃度的花生殼分級(jí)萃取物溶液的液體培養(yǎng)基，花生殼萃取物濃度梯度設(shè)為500mg/mL、250mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL、15.625mg/mL、7.812 5mg/mL。每一系列梯度接種大腸桿菌培養(yǎng)液100ug。將液體培養(yǎng)基放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（36℃，200r/min，12h）。渾濁的試管為陽(yáng)性對(duì)照管，即為有菌生長(zhǎng);陰性對(duì)照管為透明試管，代表無(wú)菌生長(zhǎng)。呈透明液體的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）。將認(rèn)為不長(zhǎng)菌的試管（透明液體）從低濃度到高濃度取3支，各吸取1mL液體于培養(yǎng)皿中，加入營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混勻，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（36±1℃），無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低濃度為最低殺菌濃度（MBC）[10]。

1.4.5 花生殼分級(jí)萃取物總多酚含量的測(cè)定（Folin-Ciocalteu法）

配制500μg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0 mL于10mL比色管中定容。從各溶液中吸取1 mL加入25 mL容量瓶?jī)?nèi)，加10 mL蒸餾水，1.5mL Folin-Ciocalteu試劑，在0.5～8min內(nèi)加入6mL 10% Na2CO3溶液，加水定容，然后在30℃下避光放置反應(yīng)2h，以0樣為空白，在760nm處測(cè)定吸光度。吸光度（y）對(duì)濃度（x）的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程：y=3.500 3x+0.011 9，R2=0.999。準(zhǔn)確移取1 000 mg/mL的各萃取物1mL于25mL容量瓶中，根據(jù)以上方法測(cè)定波長(zhǎng)760nm處的吸光度，代入回歸方程計(jì)算萃取液中總多酚濃度（萃取液中總多酚濃度按沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)）。

2 結(jié)果與討論

2.1 濾紙片法測(cè)定花生殼分級(jí)萃取物對(duì)大腸桿菌抑菌圈

濾紙片法測(cè)定不同濃度花生殼分級(jí)萃取物對(duì)大腸桿菌的抑制效果見(jiàn)圖1，抑菌圈直徑越大，表明抑菌效果越好。從圖中可以看出，同一濃度時(shí)，大多數(shù)乙酸乙酯萃取物對(duì)大腸桿菌的抑制效果最顯著，花生殼乙酸乙酯萃取物濃度越大，對(duì)大腸桿菌的抑制效果越好，而其他萃取物對(duì)大腸桿菌的抑制效果與濃度關(guān)系不大。

2.2 平板計(jì)數(shù)法測(cè)定花生殼分級(jí)萃取物對(duì)大腸桿菌抑制率

平板計(jì)數(shù)法測(cè)定不同濃度花生殼分級(jí)萃取物對(duì)大腸桿菌抑制率見(jiàn)圖2，由圖可知，在相同濃度時(shí)，抑菌效果為乙酸乙酯萃取物>乙醇萃取物>石油醚萃取物>氯仿萃取物>水萃取物;對(duì)于同種萃取物，隨著濃度的增加，對(duì)大腸桿菌的抑菌效果增強(qiáng)。

2.3 花生殼乙酸乙酯和無(wú)水乙醇萃取物對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響

花生殼乙酸乙酯、無(wú)水乙醇萃取物對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響見(jiàn)圖3，由圖3可知，對(duì)于不加萃取物的對(duì)照組，大腸桿菌很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而實(shí)驗(yàn)組的大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的延滯期不同程度的延長(zhǎng)，在生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期時(shí)，數(shù)量也不同程度比對(duì)照組低。500mg/mL乙酸乙酯萃取物甚至無(wú)明顯的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌量很低。

2.4 花生殼分級(jí)萃取物最低抑菌濃度（MIC）及最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定

MIC即最低抑菌濃度，指的是抑制細(xì)菌生長(zhǎng)所需的最低藥物濃度;MBC即最低殺菌濃度，指的是能夠殺滅培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌（即殺死99.9%供試微生物）的最低濃度?；ㄉ鷼し旨?jí)萃取物對(duì)大腸桿菌的MIC及MBC分別見(jiàn)表1、表2，從表中可以看出，花生殼的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、水萃取物對(duì)大腸桿菌的MIC分別為62.5、250、31.25、62.5和125mg/mL;而MBC則分別為125mg/mL、125mg/mL、62.5mg/mL、62.5mg/mL和125mg/mL。因此，花生殼乙酸乙酯對(duì)大腸桿菌MIC及MBC都是最低的，能夠在較低濃度下達(dá)到抑菌效果。

2.5 花生殼分級(jí)萃取物總多酚含量的測(cè)定

花生殼溶劑分級(jí)萃取物（1 000mg/mL）中總多酚含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖中可以看出，花生殼萃取物中總多酚含量最高的是花生殼乙酸乙酯萃取物，其次為無(wú)水乙醇、水、氯仿和石油醚萃取物，與上述抗菌結(jié)果比較，花生殼萃取物中的總多酚含量與對(duì)大腸桿菌抑菌效果呈正相關(guān)。

3 結(jié) 論

通過(guò)濾紙片法、平板計(jì)數(shù)法和生長(zhǎng)曲線法測(cè)定了不同溶劑花生殼萃取物對(duì)大腸桿的抗菌活性，表明不同溶劑存在差異性，乙酸乙酯萃取物對(duì)大腸桿菌的抑制效果最強(qiáng)。并且花生殼乙酸乙酯萃取物濃度越大，對(duì)大腸桿菌的抑制效果越強(qiáng)。

不同溶劑花生殼萃取物對(duì)大腸桿菌的MIC和MBC也存在差異，乙酸乙酯萃取物最低，分別為31.25 mg/mL和62.5mg/mL。

不同花生殼分級(jí)萃取物中的總多酚含量不一樣，含量與其抗菌能力呈正相關(guān)，初步判定花生殼分級(jí)提取物中起主要抗菌作用的物質(zhì)是多酚類。

參考文獻(xiàn)

[1] 楊國(guó)峰，周建新，汪海峰，等.花生殼提取物的制備及其抗氧化與抗菌活性的研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)， 2007，33（2）： 97-101.

[2] 林姣.花生殼木犀草素的提取分離及抗菌作用的研究[D].南京： 南京財(cái)經(jīng)大學(xué)，2013.

[3] 楊洋，聶靜然，關(guān)紅艷，等.花生殼木犀草素的提取及其抑菌性能研究[J].食品科技，2009，34（12）：211-216.

[4] 聶靜然.花生殼中木犀草素的分離提純及其抑菌性能研究[D].南寧：廣西大學(xué)，2018.

[5] 陳春濤，馬慶一，高玉美，等.花生殼中木犀草素等抑菌活性成分的提取、純化與研究[J].食品科學(xué)，2003，24（5）：84-88.

[6] 邢俊紅.花生殼多酚的提取工藝及活性研究[D].大連：大連工業(yè)大學(xué)，2015.

[7] ZGORKA G A，HAJNOS A A.The application of solid-phase extraction and reversed phase high-performance liquid chromatography for simultaneous isolation and determination of plant flavonoids and phenolic acids[J].Journal of Chromatography A，2006，1137（2）：145-152.

[8] 龍海榮.黃酮類化合物的安全性研究進(jìn)展[J].食品研究與開(kāi)發(fā)， 2008（10）：154-157.

[9] 馮亞凈，張媛媛，王瑞鑫，等.五味子木脂素對(duì)大腸桿菌的抑菌機(jī)理及效果[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2016，42（2）：72-76.

[10] 周琰冰，趙鑫薈，艾啟俊.三種中草藥對(duì)大腸桿菌的抑制作用及機(jī)理初探[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，30（12）：294-300.

[11] 趙二勞，武宇芳，白建華.花生殼不同溶劑提取物的總酚含量及抗氧化性的比較研究[J].食品科學(xué)，2012，33（11）：79-81.