谷氨酰胺對COPD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中p38MAPK、IL-8及IL-17影響的臨床研究

黃美健 吳偉

谷氨酰胺對COPD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中p38MAPK、IL-8及IL-17影響的臨床研究

黃美健 吳偉

目的 通過觀察谷氨酰胺（Gln）對慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）活性、IL-8及IL-17表達(dá)的影響，探討Gln在COPD患者治療中的抗炎作用機(jī)制。方法 將32例住院COPD急性加重期（AECOPD）患者設(shè)為AECOPD組，經(jīng)治療后轉(zhuǎn)為穩(wěn)定期（SCOPD）再設(shè)為SCOPD組。收集兩組患者的PBMC，再平均分為加Gln干預(yù)的Gln組和不加Gln干預(yù)的空白對照組，另選擇16例健康體檢者為健康對照組。采用RT-PCR法檢測各組PBMC中p38MAPK、IL-8及IL-17的表達(dá)水平。結(jié)果 （1）AECOPD和SCOPD的空白對照組中p38MAPK、IL-8及IL-17的表達(dá)均高于健康對照組（均P＜0.05），且急性期增高更加顯著。（2）AECOPD的Gln組中p38MAPK、IL-8及IL-17的表達(dá)低于AECOPD空白對照組（均P＜0.01）；SCOPD的Gln組中p38MAPK、IL-8及IL-17的表達(dá)低于SCOPD空白對照組（均P＜0.05）。 結(jié)論 Gln可抑制COPD患者炎癥細(xì)胞中p38MAPK的活化并下調(diào)IL-8、IL-17的表達(dá)水平。

慢性阻塞性肺疾病 谷氨酰胺 p38絲裂原活化蛋白激酶 白介素-8 白介素-17

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，目前在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和病死率均逐年增高，嚴(yán)重影響著患者的生命質(zhì)量。急性加重和合并癥更加影響患者整體疾病的嚴(yán)重程度，因此深入探討COPD的發(fā)病機(jī)制，選擇有效藥物對COPD患者進(jìn)行規(guī)范化治療，對減輕患者的病痛、延緩病情加重、降低病死率、提高生命質(zhì)量具有深遠(yuǎn)意義[1]。當(dāng)前研究表明肺部炎癥反應(yīng)仍是COPD發(fā)病的主要原因之一[2]，炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程與炎癥細(xì)胞活性密切相關(guān)，炎癥細(xì)胞的激活和轉(zhuǎn)錄是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此以抑制或阻斷炎癥細(xì)胞及促炎因子的活化環(huán)節(jié)為靶點(diǎn)，進(jìn)而阻斷COPD的進(jìn)展，以達(dá)到治療COPD的目的，是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。筆者通過觀察谷氨酰胺（glutamine，Gln）對COPD急性加重期（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonarydisease，AECOPD）和COPD穩(wěn)定期（stable chronic obstructive pulmonary disease，SCOPD）患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinases，p38MAPK）、IL-8及IL-17表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步探討Gln在COPD治療中的抗炎作用機(jī)制，為臨床治療COPD提供新的思路和方法。

1 對象和方法

1.1.1 對象 選取2014年5月至2015年4月杭州市第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科住院患者中確診為AECOPD的患者32例，男17例，女15例，年齡56~78（73.2±6.7）歲；上述患者經(jīng)常規(guī)治療10~20d后，病情穩(wěn)定后再設(shè)為SCOPD組；選取杭州市第三人民醫(yī)院同期健康體檢者16例作為健康對照組，男9例，女7例，年齡53~77（67.4±7.3）歲；經(jīng)詳細(xì)詢問病史在近1個(gè)月內(nèi)未患過其他疾病且不吸煙或已戒煙5年以上。所有納入研究的患者均簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。COPD組與健康對照組性別、年齡等一般情況的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合2013年COPD診治指南修訂版[3]的診斷標(biāo)準(zhǔn)。（2）近2周內(nèi)未接受過糖皮質(zhì)激素治療（包括靜脈、口服或吸入用藥等）。（3）未高流量吸氧（吸氧濃度≤35%）及未行機(jī)械通氣。（4）不吸煙或已戒煙5年以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有嚴(yán)重心腦血管系統(tǒng)疾病、較嚴(yán)重的消化系統(tǒng)疾病、腎臟疾病、內(nèi)分泌、血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤和重大手術(shù)等。（2）合并有可致咳嗽、咳痰、氣短的其他疾病，如支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核、矽肺、閉塞性細(xì)支氣管炎、彌漫性泛細(xì)支氣管炎等。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 人淋巴細(xì)胞分離液（美國SIGMA公司）；無GInRPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液、L-Gln、磷酸鹽緩沖液（美國GIBCO公司）；氯仿（美國Biotech公司）；TRIzol（加拿大BioBasic公司）；定量試劑盒Power國應(yīng)用生物系統(tǒng)中國公司）；RT-PCR試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司，D2640A-CK101D]；Du-640紫外分光光度儀（美國Beckman公司）；CFX384 Real-timePCR儀、電泳系統(tǒng)Mini-Proten Tetra System、凝膠成像儀ChemiDoc XRS+System（美國Bio-RAD公司）。

1.3.2 PBMC的提取 清晨空腹抽取靜脈血5ml，置于肝素抗凝管中，加入5ml磷酸鹽緩沖液將靜脈血充分稀釋。室溫下，將4ml人淋巴細(xì)胞分離液加入15ml離心管，然后將稀釋后的10ml靜脈血緩慢地沿著管壁加入離心管，使其均勻的覆蓋在人淋巴細(xì)胞分離液上，緩慢地將離心管放入離心機(jī)內(nèi)，以2 000r/min離心20min，離心后管自上而下依次為稀釋的血漿層、單個(gè)核細(xì)胞層、分離液層、紅細(xì)胞和粒細(xì)胞層，小心緩慢地吸取第2層單個(gè)核細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到10ml離心管，加入5倍體積磷酸鹽緩沖液液洗滌，后1 000r/min離心10min，棄去上清液，相同條件重復(fù)洗滌1次，棄去上清液，位于最底部的沉淀為PBMC，0.4%臺盼藍(lán)染色，排除無活性的細(xì)胞，活細(xì)胞＞90%可采用。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組 采用無Gln RPMI 1640培養(yǎng)液將上述提取的PBMC調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2.0×106個(gè)/ml，并接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入細(xì)胞混勻液1ml，其中AECOPD組患者細(xì)胞混勻液隨機(jī)平均分成兩組：（1）Gln組：PBMC中加入終濃度為8mmol/L的Gln；（2）空白對照組：僅用無Gln RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。SCOPD組患者細(xì)胞混勻液隨機(jī)平均分成兩組：（1）Gln組：PBMC中加入終濃度為8mmol/L的Gln；（2）空白對照組：僅用無Gln RPMI 1640培養(yǎng)液。健康對照組僅用無Gln RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。所有細(xì)胞均在37℃含25%CO2溫箱里培養(yǎng)24h。

1.3.4 RT-PCR法檢測p38MAPK、IL-8及IL-17的表達(dá) 采用Real-time PCR法檢測。用Trizol法提取上述培養(yǎng)后細(xì)胞的總RNA，并測定RNA的濃度和純度。用RT-PCR試劑盒合成cDNA。PCR引物按照引物設(shè)計(jì)原則采用Primer 5.0和Beacon designer 7.8設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，由上海生物工程有限公司負(fù)責(zé)合成，詳見表1。

表1 各目的基因引物序列

PCR反應(yīng)條件：95℃，1min；40個(gè)循環(huán)：95℃15s；63℃25s（收集熒光）；熔點(diǎn)曲線分析55~95℃。20μl反應(yīng)體系如下：雙蒸水8.0μlMix 10.0μl，上游和下游引物各 0.5μl，cDNA模板1.0μl。實(shí)驗(yàn)樣本經(jīng)定量PCR得到各反應(yīng)孔循環(huán)數(shù)（Ct

值）后運(yùn)用相對表達(dá)量△Ct或2-△△Ct進(jìn)行相對定量結(jié)果分析。其中△Ct=目的基因Ct值－內(nèi)參Ct值，△Ct值越大說明表達(dá)越低，△Ct值越小說明表達(dá)越高。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 目的基因及內(nèi)參電泳圖 實(shí)驗(yàn)的電泳條帶和設(shè)計(jì)的擴(kuò)增條帶長度全部符合擴(kuò)增條帶為目的條帶（圖1），電泳圖中無雜質(zhì)，表明RT-PCR擴(kuò)增為特異性擴(kuò)增；RT-PCR擴(kuò)增顯示各個(gè)引物擴(kuò)增產(chǎn)物熔點(diǎn)曲線圖（圖2），均具有單一主峰，表明引物RT-PCR擴(kuò)增具有較強(qiáng)的特異性。

2.2 檢測PBMC中p38MAPK、IL-8及IL-17△Ct值變化

2.2.1 各組p38MAPK、IL-8及IL-17△Ct值的比較 見表2。

圖1 目的基因及內(nèi)參電泳圖（a：p 3 8 M A P K；b：I L-8；c：I L-1 7；d：1 8 s r R N A；M：M a k e r；1~6各目的基因擴(kuò)增條帶）

圖2 目的基因及內(nèi)參擴(kuò)增曲線圖（a：p 3 8 M A P K；b：I L-8；c：I L-1 7；d：1 8 s r R N A）

表2 各組p 3 8 M A P K、I L-8及I L-1 7△C t值的比較

由表2可見，無論是在AECOPD空白對照組還是在SCOPD空白對照組中，p38MAPK表達(dá)均高于健康對照組，且急性期更為顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。IL-8和IL-17在AECOPD空白對照組和SCOPD空白對照組中的表達(dá)也高于健康對照組，且急性期更加顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.2.2 經(jīng)Gln干預(yù)前后各組p38MAPK、IL-8及IL-17△Ct值比較 見表3。

表3 經(jīng)G l n干預(yù)前后p 3 8 M A P K、I L-8及I L-1 7△C t值比較

由表3可見，AECOPD組中用Gln干預(yù)的較未用Gln的PBMC中p38MAPK、IL-8及IL-17的表達(dá)均下降（均P＜0.01）；SCOPD組中用Gln干預(yù)的較未用Gln的PBMC中p38MAPK、IL-8及IL-17的表達(dá)均下降（均P＜0.05）。

3 討論

慢性炎癥過程一直被認(rèn)為是COPD發(fā)生和發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)[2]。IL-8是人體內(nèi)重要的趨化因子，參與了COPD患者中性粒細(xì)胞的形態(tài)改變、趨化、脫顆粒等過程，同時(shí)又參與誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞IL-8基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致IL-8進(jìn)一步的釋放，構(gòu)成了氣道內(nèi)的“炎性循環(huán)”[3]，在COPD的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。王彥霞等[4]發(fā)現(xiàn)，COPD急性期患者PBMC中的IL-8和TNF-α水平高于治療后組和對照組。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在COPD小鼠的PBMC中，IL-6和IL-8的表達(dá)是顯著增加的，并且抑制p38MAPK通路可以減少IL-6和IL-8的表達(dá)[5]。IL-17主要由近年來發(fā)現(xiàn)的新型Th細(xì)胞Th17細(xì)胞所分泌，有研究表明IL-17可以調(diào)節(jié)氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞及肺巨噬細(xì)胞的趨化和激活，在COPD的發(fā)病中起到極為重要的作用[6]。Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)在COPD患者肺組織中的CD4+細(xì)胞中IL-17的表達(dá)是顯著增加的。p38MAPK是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，作為細(xì)胞信號從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞內(nèi)部的重要信使，參與了應(yīng)激條件下細(xì)胞的生長、分化、凋亡以及炎癥等過程。p38MAPK可被TNF-α、IL-8等炎癥因子以及各種氧化應(yīng)激因子等所激活，影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成以及細(xì)胞表面受體表達(dá)等過程[8]。Renda等[9]發(fā)現(xiàn)p38MAPK在COPD急性期患者肺泡巨噬細(xì)胞中表達(dá)是明顯高于健康對照組的，并且與患者的一秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1）和一秒率（FEV1/forced vital capacity，F(xiàn)EV1/FVC）是呈負(fù)相關(guān)的。有研究表明，COPD患者的肺巨噬細(xì)胞和肺支氣管上皮細(xì)胞中 p38MAPK的表達(dá)是增加的，而使用p38MAPK抑制劑則可減少炎癥介質(zhì)（TNF-α、IL-8）等的釋放[10]。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)p38MAPK通過減少IL-17的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而調(diào)控著腦脊髓炎的病理過程[11]。由此可見，p38MAPK通路作為炎性細(xì)胞活化、炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的重要的細(xì)胞通路，在COPD發(fā)病的炎癥機(jī)制中起著重要作用。因此以p38MAPK通路為靶點(diǎn)，選擇一種有效物質(zhì)來抑制p38MAPK的活化，降低炎癥因子的表達(dá)，應(yīng)該是治療COPD的一種新的思路和方法。

Gln是人體中的條件性必需氨基酸，具有廣泛的生物學(xué)活性，作為免疫系統(tǒng)的主要能量來源，在改善營養(yǎng)不良的COPD患者免疫功能上具有顯著效果。近年來有研究顯示,Gln能下調(diào)脂多糖（LPS）刺激下人體PBMC中多種炎癥因子的過度表達(dá)[12]。有研究報(bào)道Gln能抑制敗血癥小鼠的p38MAPK、NF-κB等通路的激活及細(xì)胞因子的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過Gln治療后肺組織中TNF-α和IL-18的表達(dá)顯著降低[13]。Chang-Hoon Lee等[14]發(fā)現(xiàn)通過Gln的干預(yù)，可阻斷p38MAPK及其下游通路絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1（MKP-1）通路的激活，減少小鼠氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞的增殖和活化。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)Gln可以抑制COPD患者NF-κB的活化，并且可下調(diào)炎癥因子TNF-α的表達(dá)[16]。因此筆者分析，能否進(jìn)一步從炎性反應(yīng)的角度，通過應(yīng)用Gln來抑制COPD患者肺組織中p38MAPK、IL-8及IL-17等炎癥因子的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)其抗炎作用，從而達(dá)到改善和治療COPD，減輕患者痛苦的效果。

本研究采用RT-PCR法檢測經(jīng)過 Gln干預(yù)的COPD急性期患者治療前后外周血PBMC中p38MAPK、IL-8及IL-17表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)p38MAPK、IL-8及IL-17在COPD患者炎癥細(xì)胞中存在表達(dá)，COPD患者治療前、后空白對照組較正常對照組表達(dá)量增高，且急性加重期高于穩(wěn)定期，揭示了p38MAPK、IL-8及IL-17在COPD患者的整個(gè)病程中長期存在，這也進(jìn)一步證實(shí)了COPD是一種慢性氣道炎癥的實(shí)質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)經(jīng)Gln干預(yù)后的COPD急性期組和穩(wěn)定期組其p38MAPK、IL-8及IL-17表達(dá)顯著低于未予Gln干預(yù)的空白對照組，且急性加重期較穩(wěn)定期降低更明顯。證明Gln可抑制COPD患者PBMC中p38MAPK活化，并減少炎癥介質(zhì)IL-8及IL-17的釋放。

目前國內(nèi)外尚未見關(guān)于Gln對COPD患者PBMC中p38MAPK及IL-8及IL-17表達(dá)影響的研究報(bào)道。本研究結(jié)果表明COPD患者PBMC中分泌的p38MAPK、IL-8及IL-17參與了COPD炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展的整個(gè)過程；Gln能明顯抑制 COPD患者PBMC中p38MAPK的活化和降低IL-8及IL-17的表達(dá)，從而減輕COPD患者的氣道炎癥，改善患者的病情，減輕其痛苦，為臨床應(yīng)用Gln治療COPD提供新的理論依據(jù)和方法。鑒于本研究限于離體細(xì)胞水平及樣本量的局限，有關(guān)Gln抗炎作用更深入的分子機(jī)制仍有待今后進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量的臨床研究和發(fā)現(xiàn)。

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Effect of glutamine on p38MAPK,IL-8 and IL-17 expression in PBMC of patients with chronic obstructive pulmonary disease

HUANG Meijian,WU Wei.Department of Respiratory Medicine,Hangzhou Third People's Hospital,Hangzhou 310009，China

Chronic obstructive pulmonary disease Glutamine p38MAPK IL-8 IL-17

2 0 1 6-0 9-1 8）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

d o i：1 0.1 2 0 5 6/j.i s s n.1 0 0 6-2 7 8 5.2 0 1 7.3 9.1 5.2 0 1 6-1 4 5 1

3 1 0 0 0 9杭州市第三人民醫(yī)院呼吸科（黃美?。?；安徽醫(yī)科大學(xué)杭州臨床學(xué)院呼吸科（吳偉）

黃美健，E-m a i l：h m e i j i a n@1 6 3.c o m

【 Abstract】 Objective To investigate the effects of glutamine on the p38MAPK,IL-8 and IL-17 expression in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)of patients with chronic obstructive pulmonary disease(COPD). Methods Thirty-two patients with acute exacerbation of COPD(AECOPD)and 32 patients with stable COPD(SCOPD)were enrolled in the study.Venous blood samples were collected and PBMCs were isolated.The patients were equally divided into the Gln intervention group and blank control group.Sixteen healthy subjects served as normal control group.The expression levels of p38MAPK,IL-8 and IL-17 in PBMCs were detected by real-time PCR.Results The expression of p38MAPK,IL-8 and IL-17 in AECOPD and SCOPD blank control groups were higher than those in normal control group(P＜0.05),while the difference was more marked in AECOPD blank control group.The expression of p38MAPK,IL-8 and IL-17 in AECOPD and SCOPD Gln groups were significantly lower than those in AECOPD and SCOPD blank control groups,respectively(P＜0.01,P＜0.05). Conclusion Glutamine may exert an anti-inflammatory role in COPD patients by inhibiting p38MAPK cell signaling pathway and reducing the expression of IL-8 and IL-17.