UPLC法同時(shí)測(cè)定三白草中7種木脂素類(lèi)成分的含量

胥愛(ài)麗，江潔怡，畢曉黎，陳偉韜，李養(yǎng)學(xué)，李素梅，段福先

[廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院(廣東省中醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，廣東 廣州 510095]

三白草Saururuschinensis(Lour.) Baill，又名水木通、五路白、白水雞、白黃腳、三點(diǎn)白、白葉蓮等，為三白草科三白草屬植物，以干燥地上部分入藥，具有清熱解毒、利尿消腫之功效，用于治療小便不利、淋瀝澀痛、帶下或尿路感染、腎炎水腫，外治瘡瘍腫毒、濕疹等癥[1]。三白草在我國(guó)南方分布廣泛，資源十分豐富。據(jù)研究報(bào)道，三白草含有揮發(fā)油、木脂素類(lèi)、黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)化合物[2-4]。

在前期研究中，本課題組對(duì)三白草的抗病毒活性成分進(jìn)行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三白草中的木脂素類(lèi)成分為抗病毒的主要活性成分，并從三白草中提取分離得到了三白草酮、三白草醇、Saurucinol I、里卡靈A、4-O-馬納薩亭B、里卡靈B、馬納薩亭B等7種活性成分單體。目前，現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》已收載了三白草中三白草酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定方法，但僅測(cè)定了1個(gè)指標(biāo)成分，而文獻(xiàn)報(bào)道的三白草質(zhì)量控制方法多是針對(duì)其中的黃酮類(lèi)成分[5-6]，尚未有全面控制木脂素類(lèi)成分的研究報(bào)道。因此，本文旨在建立一種同時(shí)測(cè)定三白草中多個(gè)木脂素類(lèi)活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法，以便更全面、更有針對(duì)性地控制三白草藥材的質(zhì)量，為該藥物的臨床應(yīng)用及進(jìn)一步的研究開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

Agilent 1290超高效液相色譜儀，包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器(美國(guó))；KQ-700DE數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；TLE204十萬(wàn)分之一電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；HH-6恒溫水浴鍋(北京精科華瑞有限公司)；CIENTZ-30F冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司)；DHG-9203A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；ALB-200高速多功能粉碎機(jī)(上海塞耐機(jī)械有限公司)；Milli Pore Advantage A10自動(dòng)純水機(jī)(美國(guó))。

三白草酮(自制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.51%)、三白草醇(自制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.60%)、Saurucinol I(自制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.50%)、里卡靈A(自制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.10%)、4-O-去甲基馬鈉薩亭B(自制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.52%)、馬鈉薩亭B(自制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.20%)、里卡靈B(自制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.80%)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均采用液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，峰面積歸一法計(jì)算；甲醇[色譜純，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]；水為屈臣氏蒸餾水；其余試劑均為分析純。

33批三白草批號(hào)及產(chǎn)地來(lái)源見(jiàn)表1，均經(jīng)廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院劉法錦教授鑒定為三白草科植物三白草Saururuschinensis(Lour.) Baill.。

表1 33批三白草樣品信息Table 1 Sources of Saururus chinensis (Lour.) Baill.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：AdvanceBio Peptide Plus C18(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-0.1%H3PO4(B)，梯度洗脫(0～3 min，45%～59%A；3～15 min，59%～60%A；15～17 min，60%～70%A；17～25 min，70%～75%A；25～30 min，75%～100%A；柱溫：30 ℃；流速：0.4 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量：2 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別取三白草酮、三白草醇、Saurucinol I、里卡靈A、4-O-馬納薩亭B、里卡靈B、馬納薩亭B適量，加甲醇配制成含三白草酮179.04 μg/mL、三白草醇39.55 μg/mL、Saurucinol I 26.27 μg/mL、里卡靈A 48.02 μg/mL、4-O-去甲基馬納薩亭B 37.03 μg/mL、里卡靈B 48.14 μg/mL、馬納薩亭B 48.16 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取三白草粉末(過(guò)四號(hào)篩)約1.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min(功率700 W，頻率25 kHz)，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液和混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果三白草中7種木脂素類(lèi)成分的分離度和理論塔板數(shù)均符合要求，三白草酮、三白草醇、Saurucinol I、里卡靈A、4-O-馬納薩亭B、里卡靈B、馬納薩亭B的分離度分別為2.39、4.15、2.98、1.52、18.29、2.15、4.77，理論塔板數(shù)分別為27 507、19 675、17 799、28 952、235 755、166 675、212 084。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取混合對(duì)照品溶液各0.1、1、2、4、6、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得不同質(zhì)量濃度的系列混合對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，各峰面積值為縱坐標(biāo)，分別算得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

2520151050-52520151050-512435123456677101520255ABt/minmAUmAU

1.三白草酮; 2.三白草醇; 3. Saurucinol I; 4.里卡靈A; 5. 4-O-去甲基馬納薩亭B; 6.里卡靈B; 7.馬納薩亭B。

圖1三白草樣品(A)與混合對(duì)照品(B)的超高效液相色譜圖

Figure1UPLC chromatograms of sample (A) and control (B)

表2 7種木脂素類(lèi)成分的線性關(guān)系考察結(jié)果Table 2 The linear relationship of seven lignans components

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液(S1)2 μL，注入液相色譜儀，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果測(cè)得三白草酮、三白草醇、Saurucinol I、里卡靈A、4-O-馬納薩亭B、里卡靈B、馬納薩亭B峰面積的RSD值分別為0.25%、0.64%、0.84%、0.46%、1.08%、0.59%、0.67%，均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液(S1)，分別在0、3、6、9、12、24 h各進(jìn)樣1次，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果測(cè)得三白草酮、三白草醇、Saurucinol I、里卡靈A、4-O-馬納薩亭B、里卡靈B、馬納薩亭B峰面積的RSD值分別為0.23%、0.30%、0.97%、0.47%、1.10%、0.39%、0.64%，均小于2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品(S1)，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2. 1”項(xiàng)下色譜條件下分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積并計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果測(cè)得三白草酮、三白草醇、Saurucinol I、里卡靈A、4-O-馬納薩亭B、里卡靈B、馬納薩亭B的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.472 5、0.223 2、0.213 4、0.364 3、0.222 3、0.371 4、0.221 3 mg/g，其RSD值分別為0.44%、1.58%、0.69%、1.12%、2.57%、1.22%、1.92%，均小于2%，表明方法重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量同一批次的三白草樣品(S1)9份，每份0.5 g，精密稱(chēng)定，分別加入7種成分相應(yīng)的對(duì)照品溶液1、2、3 mL(三白草酮0.870 5 mg/mL，三白草醇0.056 1 mg/mL，Saurucinol I 0.053 5 mg/mL，里卡靈A 0.091 3 mg/mL，4-O-去甲基馬薩納亭B 0.055 7 mg/mL，里卡靈B 0.091 3 mg/mL，馬薩納亭B 0.055 5 mg/mL)，揮干溶劑，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.9 7種木脂素類(lèi)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

取不同批次三白草樣品，照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定，以干燥品計(jì)算三白草酮、三白草醇、Saurucinol I、里卡靈A、4-O-去甲基馬薩納亭B、里卡靈B、馬薩納亭B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果表4。

表3 7種木脂素類(lèi)成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of the recovery determination of seven lignans components

表3 (續(xù))

表4 33批三白草藥材木脂素類(lèi)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果Table 4 The content of lignans in 33 batches Saururus chinensis (Lour.) Baill.(n=2) w/(mg·g-1)

表4 (續(xù))

3 討論

從本研究結(jié)果可見(jiàn)，三白草中三白草酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高；不同產(chǎn)地三白草中，7種木脂素類(lèi)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在差異，其中云南產(chǎn)地(S32)的三白草酮、三白草醇、Saurucinol I、里卡靈A、4-O-去甲基馬納薩亭B、里卡靈B、馬納薩亭B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較高，影響三白草中木脂素類(lèi)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)大小的因素可能與藥材生長(zhǎng)的環(huán)境(光照、氣候、土壤等)有關(guān)，同時(shí)，藥材采收時(shí)節(jié)，干燥方法、貯存和養(yǎng)護(hù)條件等因素也可能有影響。

本研究分別比較了用甲醇、80%甲醇、50%甲醇、90%乙醇、50%乙醇5種溶劑進(jìn)行超聲提取的效果，結(jié)果顯示以采用甲醇提取的效果較好；在此基礎(chǔ)上比較了回流提取和超聲提取的效率，結(jié)果顯示2種提取方法無(wú)明顯差異，因此選擇操作較方便的超聲提取。另外，比較了超聲時(shí)間和固液比對(duì)提取效果的影響，結(jié)果顯示超聲30 min、固液比為1∶50時(shí)，三白草中的7種木脂素成分基本能夠提取完全。

采用DAD二極管陣列檢測(cè)器對(duì)樣品及對(duì)照品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示7種木脂素成分在230 nm附近均有最大吸收，因此選定230 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。分別試驗(yàn)了甲醇-水、甲醇-甲酸、甲醇-冰醋酸、甲醇-磷酸4種流動(dòng)相系統(tǒng)，以及不同流動(dòng)相比例，并考察了不同濃度磷酸水溶液對(duì)7種木脂素成分色譜行為的影響。結(jié)果表明，以甲醇-0.1%磷酸作為流動(dòng)相為佳，各成分的色譜峰均能達(dá)到基線分離，且峰形對(duì)稱(chēng)。

本研究建立的同時(shí)測(cè)定三白草中三白草酮、三白草醇、Saurucinol I、里卡靈A、4-O-去甲基馬納薩亭B、里卡靈B、馬納薩亭B質(zhì)量分?jǐn)?shù)的UPLC法，方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，可用于三白草藥材木脂素類(lèi)成分的質(zhì)量控制，為三白草的進(jìn)一步深入研究和開(kāi)發(fā)利用提供了技術(shù)支持。