阿帕替尼對人涎腺腺樣囊性癌生長抑制作用的體內(nèi)外研究

吳麗紅，溫智輝，歐陽可雄，賀軻，葛林虎

(1.廣州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院·廣州口腔疾病研究所·口腔醫(yī)學重點實驗室，廣東 廣州 510140； 2.中山大學中山醫(yī)學院 生化教研室/教育部干細胞與組織工程重點實驗室，廣東 廣州 510080)

人唾液腺樣囊性癌(SACC)是最常見的頭頸上皮惡性腫瘤之一,是唾液腺第二常見的惡性腫瘤[1-5]。SACC是一種生長緩慢但具有侵略性的腫瘤，約占人類頭頸部上皮惡性腫瘤的27%。SACC界限不清，且有高度組織浸潤性，容易沿著神經(jīng)、血管浸潤進入組織和破壞組織正常結構。手術、放射和化學藥物治療效果均不理想和常復發(fā)。其生長、浸潤和轉移依賴于腫瘤新生血管的形成[6-8]。

阿帕替尼(apatinib)是一種口服的血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2(VEGFR2)特異性抑制劑[7-11]，能有效靶向作用于受體中的酪氨酸激酶，抑制VEGFR2分子信號轉導，從而抑制血管內(nèi)皮的更新和代謝，對多種癌癥都有良好的治療效果。阿帕替尼作為肺癌、結腸癌、胃癌等腺癌的靶向VEGFR2藥物治療效果良好，但在人頭頸部腺癌治療中鮮有報道。本文利用阿帕替尼作用于口腔腺樣囊性癌細胞SACC83和裸鼠移植瘤模型，觀察藥物作用效果和對血管生成相關基因的影響，從而評估阿帕替尼治療口腔腺樣囊性癌的應用前景。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

12只6周齡健康的裸小鼠BALB/c-nu/nu，雌雄各半，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2016-0041。動物實驗于廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院[SYXK(粵)2013-0093 ]的SPF級環(huán)境中進行，室溫為26～28 ℃，相對濕度保持在40%～60%，自由飲食，水和鼠料均經(jīng)高壓滅菌消毒。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：阿帕替尼購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司(A129753)；噻唑藍、二甲基亞砜(DMSO)均購自中國Sigma-Aldrich公司；血管生成因子芯片(Human Angiogeesis Array GS1)購自Raybiotech公司；細胞實驗所涉及的主要試劑均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。SACC83細胞系由廣州醫(yī)科大學口腔醫(yī)學實驗室保存。在實驗開始前，需制備100 mmol/L阿帕替尼DMSO儲存液。

主要儀器：HF151型CO2培養(yǎng)箱(上海力康)；5810R型低溫臺式高速離心機(德國艾本德)；Epoch2微孔板分光光度計(Biotek公司)；Ariamx實時熒光定量PCR儀(Agilent Technologies)。

1.3 方法

1.3.1 不同濃度的阿帕替尼對SACC83細胞增殖的影響 SACC83 細胞培養(yǎng)體系：10%～15%胎牛血清、雙抗(100 IU/mL青霉素+100 IU/ mL鏈霉素)、RPMI1640 培養(yǎng)基。SACC83 細胞相對于其他的口腔癌細胞生長緩慢。收取對數(shù)期生長階段的SACC83細胞，制成細胞懸液，96孔板中每孔加入5 000個細胞，補充孔內(nèi)培養(yǎng)基至100 μL。細胞貼壁后第2天分別用含有0、20、40、60、80、100、200、400、600、800、1 000 μmol/L阿帕替尼的無雙抗、低血清(5%胎牛血清)RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d或4 d，每個濃度和時間點復孔數(shù)為n=6。阿帕替尼作用結束后，MTT法測定細胞活力。MTT法測定細胞活力具體步驟參考文獻[12]，簡單步驟如下：每孔加入20 μL的噻唑藍(5 mg/mL)。2 h后終止培養(yǎng)，小心吸走孔內(nèi)的培養(yǎng)基，孔內(nèi)加入200 μL的DMSO，37 ℃溫箱孵育10 min或搖床低速緩慢振蕩10 min，用微孔板分光光度計檢測各孔的吸光度值(A570 nm)。

1.3.2VEGFR2、肝細胞生長因子(HGF)、表皮細胞生長因子(EGF)和血管生成素(Angiogenin)基因表達水平的檢測 采用熒光定量PCR方法檢測VEGFR2、HGF、EGF和Angiogenin在PBS或者400 μmol/L阿帕替尼處理過的腺樣囊性癌細胞SACC83的表達水平。

總RNA抽提：采用常規(guī)方法從PBS或者400 μmol/L阿帕替尼處理過的腺樣囊性癌細胞SACC83抽提總RNA。

將VEGFR2、HGF、EGF和Angiogenin基因與GAPDH同時進行定量PCR擴增，記錄各個基因擴增的ct值。定量PCR體系：上下游引物(20 μmol/L)各0.2 μL、反轉錄產(chǎn)物1 μL、ddH2O 8.56 μL，SYBR green-Taq 10 μL，50×ROX0.04 μL。引物序列見表1。定量循環(huán)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，[95 ℃ 15 s，60 ℃(GAPDH)或60 ℃(HGF) 或60.5 ℃(EGF)或60 ℃(Angiogenin)或58 ℃(VEGFR2)30 s]40個循環(huán)。計算公式：Relative Quantification (ddCt)法，基因的平均相對含量=2-averageΔΔCt×100%(Ct值是表示每個PCR反應管內(nèi)熒光信號到達設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))。

表1 定量PCR引物序列Table 1 Primers for real-time PCR amplication

1.3.3 裸小鼠皮下人涎腺腺樣囊性癌移植瘤模型的建立與阿帕替尼治療方案 處于對數(shù)生長期的SACC83細胞，用0.25%含EDTA胰酶消化、PBS沖洗和重懸SACC83細胞2次，最后使細胞懸液終濃度為4×107/mL。每只裸小鼠左側腋窩皮下注射0.1 mL的SACC83細胞懸液，3～5 d左右便能觀察到綠豆粒般體積的腫瘤塊。此時，將成瘤的小鼠分成2組(n=6)，每天每只裸小鼠分別瘤內(nèi)注射0.1 mL的PBS或者400 μg/mL阿帕替尼，共注射2周。實驗終止時安樂死動物，從裸小鼠皮下剝離移植瘤、稱質(zhì)量和測量腫瘤的長、寬，計算腫瘤體積。腫瘤體積計算公式：V(mm3)=長(mm)×寬(mm)2×0.5。

1.3.4 檢測阿帕替尼治療后血管生成因子的表達水平 從裸小鼠皮下剝離移植瘤，隨機每組抽取3個樣本的腫瘤塊。根據(jù)Raybiotech公司生產(chǎn)的血管生成因子芯片(Human Angiogeesis Array GS1)試劑盒說明抽提蛋白和實施檢測。

1.3.5 實驗數(shù)據(jù)處理與分析 利用SPSS17.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，使用Graphpad prism 5作圖；實驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差表示，采用student’t test進行統(tǒng)計分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。使用Graphpad prism 5計算阿帕替尼對SACC83細胞處理4 d的IC50。利用STRING 10.0分析VEGFR2、HGF、EGF和Angiogenin基因之間的相互作用關系。

2 結果

2.1 阿帕替尼對SACC83細胞增殖的影響

不同濃度的阿帕替尼分別作用于SACC83細胞系2 d和4 d，對其活力的影響是不同的。圖1A和圖1B結果顯示，SACC83細胞活力隨著阿帕替尼濃度的增加而顯著降低。與PBS對照組比較，阿帕替尼組各濃度、各時間點細胞活力都顯著下降(P<0.01)。當400 μmol/L阿帕替尼作用SACC83細胞，細胞活力達到較低水平[2 d，細胞活力為(53.1±2.3)%]或者最低水平[4 d，細胞活力為(38.7±3.7)%]，并且增加濃度不會引起細胞活力發(fā)生太大的變化，作用效果趨于穩(wěn)定。圖1C顯示阿帕替尼對SACC83細胞抑制的最佳濃度為400 μmol/L，最佳作用時間為4 d(96 h)，此時400 μmol/L阿帕替尼能有效抑制SACC83細胞增殖，抑制率約為61.3%。阿帕替尼對SACC83細胞處理4 d的IC50為(179.26±2.3)μmol/L。

2.2 阿帕替尼對血管生成相關基因VEGFR2、HGF、EGF和Angiogenin mRNA表達水平的影響

圖2結果顯示，阿帕替尼處理組與PBS對照組比較，VEGFR2、HGF、EGF和Angiogenin基因在400 μmol/L阿帕替尼處理4 d的人涎腺腺樣囊性癌細胞中mRNA表達水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

1201008060402012010080604020****************************************細胞活力/%2d4d-61.3%細胞活力/%c(阿帕替尼)/(μmol?L-1)**1000100200400600800020406080ABC

A. 2 d時細胞活力； B.4 d時細胞活力。與0 μmol/L的阿帕替尼處理組比較：**P<0.01； C.最佳濃度和作用時間摸索：400 μmol/L阿帕替尼對SACC83細胞處理4 d。

圖1不同濃度的阿帕替尼在不同時間點對SACC83細胞增殖影響

Figure1Effect of different concentrations of apatinib on the proliferation of SACC83 cells

PBS阿帕替尼1.51.20.90.60.30.0mRNA表達水平Genes/GAPDH*******HGFEGFVEGFR2Angiogenin

與PBS組比較：*P<0.05，**P<0.01。

圖2血管生成相關的基因mRNA表達水平

Figure2mRNA expression of angiogenesis-related genesVEGFR2,HGF,EGFandAngiogenin

2.3 阿帕替尼對裸小鼠SACC細胞皮下移植瘤的生長和血管生成因子的蛋白表達水平影響

給藥后14 d，與阿帕替尼組相比，PBS對照組裸小鼠出現(xiàn)飲水、采食量顯著減少，體形消瘦明顯，有2只裸鼠移植瘤周圍出現(xiàn)大小不等的衛(wèi)星癌灶。與阿帕替尼注射前相比，阿帕替尼組裸鼠進水未見異常，采食量和體質(zhì)量略有降低，移植瘤周圍未見衛(wèi)星癌灶。實驗結束安樂死裸小鼠，剝離腫瘤組織稱重和測量腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤的體積大小。

圖3結果顯示，與PBS對照組相比，瘤內(nèi)注射0.1 mL的400 μg/mL阿帕替尼14 d后，腫瘤明顯縮小(圖3A)，腫瘤的質(zhì)量和體積分別只有對照組的31.4%[圖3B，對照組(1 216.5±120.04) mg和10.6%[圖3C，對照組(1 790.25±467.92) mm3]。利用血管生成因子芯片檢測移植瘤體中血管生成因子的表達水平，圖4結果顯示，阿帕替尼治療后，HGF、EGF和Angiogenin因子表達水平極顯著地銳減，表達水平分別只有未治療組的15.7%(對照組，因子與內(nèi)參灰度值比：0.46±0.11)、8.6%(對照組，因子與內(nèi)參灰度值比：0.18±0.06)和5.9%(對照組，因子與內(nèi)參灰度值比：0.08±0.02)。

PBS阿帕替尼150012009006003000腫瘤質(zhì)量/mgPBS阿帕替尼****腫瘤體積/mm3300025002000150010005000阿帕替尼PBSABC

A. 剝離腫瘤大體圖(隨機抽取每組3只裸小鼠的腫瘤展示)；B.腫瘤質(zhì)量；C.腫瘤體積。與PBS組比較：**P<0.01。

圖3阿帕替尼對裸小鼠SACC83細胞皮下移植瘤生長的影響

Figure3Effect of apatinib on the growth of subcutaneous transplantation tumor of SACC83 cells in nude mice

2.4 血管生成相關基因VEGFR2、HGF、EGF和Angiogenin的分子網(wǎng)絡作用關系

利用STRING 10.0進行分子網(wǎng)絡關系分析，圖5A結果顯示，VEGFR2處于HGF、EGF和Angiogenin網(wǎng)絡關系的較為核心的位置，提示阿帕替尼可能通過抑制VEGFR2下調(diào)HGF、EGF和Angiogenin基因的表達水平。

POS1POS2ANGEGFHGFPBS阿帕替尼PBS阿帕替尼0.80.60.40.20.0蛋白表達水平AngiogeninEGFHGF*****

與PBS組比較：*P<0.05，**P<0.01。

圖4阿帕替尼對裸小鼠SACC83細胞皮下移植瘤中HGF、EGF和Angiogenin因子表達水平的影響

Figure4Effect of apatinib on the expression ofHGF,EGFandAngiogeninprotein in subcutaneous transplantation tumor of SACC83 cells in nude mice

EGFHGFVEGFR-2Angiogenin阿帕替尼VEGFR-2EGFHGFAngiogenin

A.血管生成相關基因VEGFR2、HGF、EGF和Angiogenin分子網(wǎng)絡關系； B.阿帕替尼作用機制預測分析。線的粗細代表分子之間的關系密切程度，線越粗代表關系越緊密，反之亦然。

圖5血管生成相關基因VEGFR2、HGF、EGF和Angiogenin分子網(wǎng)絡關系分析

Figure5Molecular network of angiogenesis-associated genesVEGFR2,HGF,EGFandAngiogenin

3 討論

人涎腺腺樣囊性癌患者目前主要采用手術治療，術后嚴重影響容貌和生活質(zhì)量，術后也可能進食困難和營養(yǎng)狀況較差，也可影響化療方案的耐受性。目前，頭頸部腺癌臨床化療主要使用多西他賽、卡培他濱和5-FU等藥物。以上化療藥物副作用較大，療效也不夠理想。SACC患者的腫瘤組織中往往VEGFR2高表達，因而本課題組設想，抗血管生成的靶向藥可能對治療SACC有效。因此，若能通過VEGFR2靶向藥物，特定地只對癌癥組織和腫瘤血管起破壞或抑制作用，將會大大提高癌癥患者的生存率。

阿帕替尼是VEGFR2特異性抑制劑，是口服藥物，副作用少[13-15]。在臨床阿帕替尼應用到晚期非小細胞肺癌腺癌、結腸癌、胃癌、肝癌以及乳腺癌等癌癥有顯著療效[16-18]。阿帕替尼不僅可以直接抑制癌細胞增殖，還可以通過抑制增殖相關信號通路的激活、阻礙細胞周期過程，從而抑制血管的生成來發(fā)揮抗腫瘤作用。阿帕替尼對于頭頸部癌的治療作用尚不明確，更鮮有阿帕替尼治療人涎腺腺樣囊性癌的報道。如果將阿帕替尼應用于治療涎腺腺樣囊性癌患者，阻止腫瘤形成過程中血管和微血管生成及腫瘤和細胞增殖，便可阻礙腫瘤組織和腫瘤細胞的生長、增殖，在控制癌癥治療和預后轉歸中發(fā)揮重要的輔助治療作用。

本研究利用400 μmol/L阿帕替尼作用于SACC83細胞4 d，細胞活力顯著降低約39%，抑制效率高且效果顯著，說明阿帕替尼可有效抑制人涎腺腺樣囊性癌細胞株SACC83的生長。另外本研究利用SACC83細胞構建裸小鼠涎腺腺樣囊性癌移植瘤模型，結果顯示，阿帕替尼組裸小鼠每天瘤內(nèi)注射0.1 mL的400 μg/mL阿帕替尼，14 d時阿帕替尼組移植瘤體積約只有PBS對照組體積的1/10，說明阿帕替尼具有抗裸小鼠人涎腺腺樣囊性癌移植瘤生長的作用。以上體內(nèi)外實驗結果提示，阿帕替尼在人涎腺腺樣囊性癌組織和人涎腺腺樣囊性癌細胞生長中發(fā)揮重要抑制作用，與阿帕替尼在其他組織器官腺癌中的研究結果一致。

阿帕替尼能競爭性地抑制VEGF與VEGFR2結合，阻斷VEGFR2自動磷酸化過程和抑制腫瘤血管的生成，從而發(fā)揮強有力的抗腫瘤作用[19-20]，并不會導致VEGFR-2表達下調(diào)。但本文結果顯示阿帕替尼下調(diào)SACC83自身VEGFR2基因mRNA表達，推測可能與VEGFR2基因代償性表達有關，阿帕替尼競爭性地抑制VEGF與VEGFR2結合，致使VEGF的功能作用發(fā)揮受阻，迫使細胞代償性的增加了VEGFR2基因mRNA的表達。HGF是一種可促分裂、分化和侵襲運動及誘發(fā)血管生成的多肽類生長因子，其與受體c-Met結合后可以使酪氨酸蛋白激酶信號通路活化和磷酸化。EGF具有刺激上皮細胞運動和參與上皮形成的功能，腫瘤組織和腫瘤細胞中可見EGF表達水平升高。Angiogenin是促進內(nèi)皮細胞生長和血管生成的關鍵因子之一。它是核糖核酸酶超家族成員，在不同類型的腫瘤細胞中有較高的表達，它不但與血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和血管生成有關，還與腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程、侵襲轉移和微血管的形成密切相關。本實驗利用STRING 10.0進行基因之間網(wǎng)絡關系分析，發(fā)現(xiàn)阿帕替尼可能通過的VEGFR2下調(diào)HGF、EGF和Angiogenin基因mRNA和蛋白的表達水平，但阿帕替尼如何通過抑制VEGFR2調(diào)控HGF、EGF和Angiogenin，有待本課題組繼續(xù)深入研究。

本研究通過細胞活力、裸小鼠實驗、基因表達水平分析和生物信息學分析，初步證明阿帕替尼可抑制SACC細胞的增殖和下調(diào)SACC83細胞VEGFR2、HGF、EGF和Angiogenin的mRNA或蛋白表達，為臨床利用阿帕替尼治療人SACC提供實驗科學依據(jù)。