正相色譜技術(shù)結(jié)合氣相色譜-聞香技術(shù)解析中國傳統(tǒng)曬露醬油香氣活性成分

周莉，陳雙，王棟，徐巖

(教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，釀造微生物學(xué)與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇 無錫，214122)

醬油是以大豆、豆粕等植物蛋白為主要原料，經(jīng)微生物發(fā)酵而成的風(fēng)味濃郁的傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，廣泛用于亞洲國家的食品烹飪。按照生產(chǎn)工藝，主要分為中國傳統(tǒng)曬露醬油、低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油和高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油，后者又可細(xì)分為廣式醬油和日式醬油[1-3]。其中中國傳統(tǒng)曬露醬油由于“長期日曬夜露、翻醬曬醬[1]以及多菌種參與發(fā)酵[4]”的獨(dú)特工藝賦予產(chǎn)品以“醬香突出、風(fēng)味濃郁”的典型風(fēng)味特征[4-8]。

香氣特征是醬油品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)之一，直接影響消費(fèi)者的產(chǎn)品接受度[9]。對(duì)醬油香氣的解析是產(chǎn)品設(shè)計(jì)和風(fēng)味品質(zhì)控制的基礎(chǔ)，然而醬油香氣活性成分只占醬油眾多揮發(fā)性組分中的小部分，因此對(duì)香氣活性成分的解析是醬油風(fēng)味研究的關(guān)鍵。為從樣品復(fù)雜揮發(fā)性組分中解析少量的關(guān)鍵香氣成分，德國SCHIEBERLE團(tuán)隊(duì)通過將精密儀器檢測(cè)和人的感官相結(jié)合建立感官組學(xué)(sensomics)的研究方法，并應(yīng)用該方法解析日式醬油的關(guān)鍵香氣成分，成功重構(gòu)出典型日式醬油香氣風(fēng)味輪廓[10]；KANEKO等[11]基于該方法解析了5類不同工藝日式醬油的香氣活性成分差異，之后又對(duì)比研究了加熱前后日式醬油中關(guān)鍵香氣活性成分的濃度變化[12]，既為不同工藝日式醬油的風(fēng)味品質(zhì)控制提供了理論基礎(chǔ)，又豐富了學(xué)者們對(duì)醬油加熱前后香氣變化的認(rèn)識(shí)。國內(nèi)趙謀明團(tuán)隊(duì)[2]采用儀器與感官相結(jié)合的思想剖析了廣式醬油的香氣活性成分，并對(duì)比研究了中國高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油和低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油的香氣活性成分差異[13]，豐富了中國醬油的風(fēng)味化學(xué)理論，同時(shí)為其風(fēng)味品質(zhì)控制提供理論基礎(chǔ)。然而，中國傳統(tǒng)曬露醬油的風(fēng)味研究目前仍停留在揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)層面[14-18]， GAO等[18]解析了中國傳統(tǒng)醬油醪液發(fā)酵過程中的揮發(fā)性組分，但其香氣活性功能尚不清楚。

如何從復(fù)雜的揮發(fā)性組分中挖掘香氣活性成分是醬油香氣研究的關(guān)鍵。GC-O聯(lián)合氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass，GC-MS)技術(shù)是目前食品香氣分析中廣泛采用的香氣活性成分篩選鑒定技術(shù)[19]，其核心是以人的鼻子作為檢測(cè)器，能夠有效地在眾多揮發(fā)性化合物中找到對(duì)樣品風(fēng)味有貢獻(xiàn)的香氣活性成分。然而由于食品尤其是醬油的揮發(fā)性組分十分復(fù)雜，在GC分離過程中共流出等問題會(huì)嚴(yán)重干擾GC-O技術(shù)對(duì)香氣活性成分的準(zhǔn)確鑒定。通過合適的樣品預(yù)分離以降低樣品GC-O嗅聞的復(fù)雜性是解決這一問題的關(guān)鍵。目前食品中香氣組分預(yù)分離技術(shù)主要有調(diào)整pH進(jìn)行酸堿性物質(zhì)分離[10]；正相色譜分離[20-21]；HPLC分離[22-23]等。

因此，針對(duì)我國傳統(tǒng)曬露醬油揮發(fā)性組分復(fù)雜的特征，本研究擬采用正相色譜預(yù)分離技術(shù)結(jié)合GC-O技術(shù)系統(tǒng)地解析其香氣活性成分。本研究有助于豐富對(duì)我國傳統(tǒng)曬露醬油風(fēng)味化學(xué)的認(rèn)識(shí)及為后續(xù)的風(fēng)味品質(zhì)控制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中國傳統(tǒng)曬露醬油：老恒和太油，由浙江省湖州市老恒和釀造有限公司提供；主要原料：水、非轉(zhuǎn)基因大豆、小麥粉、小麥、食用鹽，氨基態(tài)氮≥1.3 g/100 mL，鹽質(zhì)量濃度180 g/L；色譜純戊烷、二氯甲烷、甲醇(純度均>99%)：購于(北京)百靈威公司；無水乙醚、NaCl、無水Na2SO4(分析純)：購于中國醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司(無水乙醚后期重蒸)；C6-C30正構(gòu)烷烴標(biāo)品：購于Sigma-Aldrich(上海)公司。

GC 6890N-MS 5975氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；ODP 2聞香儀，德國Gerstel公司；SAFE裝置，德國GlasblasereiBahr公司；N-EVAP111型氮吹儀，美國Organomation公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液液萃取結(jié)合溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)技術(shù)提取醬油香氣組分

參考馮云子的方法[2]，使用二氯甲烷作為萃取劑。100 mL醬油樣品使用300 mL飽和食鹽水稀釋，使用300 mL二氯甲烷萃取3次，收集合并萃取相稱作“萃取液A”；參考SCHIEBERLE等[10]的方法，在40 ℃條件下，通過SAFE去除非揮發(fā)性組分，將香氣組分從“萃取液A”中分離，使用無水Na2SO4于-20 ℃下過夜干燥，得到無色清亮萃取液，氮吹濃縮至1 mL，稱作“萃取液B”。

1.2.2 正相色譜柱技術(shù)預(yù)分離醬油香氣“萃取液B”

參考FAN等[20]方法，進(jìn)一步采用正相色譜技術(shù)將“萃取液B”預(yù)分離，以降低后續(xù)GC-O/MS分析的干擾性和復(fù)雜性。分離使用手工填充硅膠的30 cm×1.5 cm 直徑玻璃色譜柱。上樣前分別依次使用50 mL甲醇、二氯甲烷、乙醚、戊烷洗脫活化硅膠色譜柱。活化完成后，將1 mL“萃取液B”注入硅膠色譜柱。香氣組分預(yù)分離過程中采用不同濃度比例的溶劑混合液梯度洗脫硅膠色譜柱。初始溶劑為100%戊烷，然后乙醚比例逐步提高以提高洗脫極性，再使用100%二氯甲烷、100%甲醇進(jìn)一步提高洗脫極性。每個(gè)梯度收集1個(gè)組分，整個(gè)分離過程共收集11個(gè)不同的洗脫組分。將這11個(gè)不同組分進(jìn)行感官分析后，分別濃縮至200 μL，稱作“F1～F11”。

1.2.3 醬油香氣萃取組分的GC-O/MS分析及香氣物質(zhì)鑒定

GC-O分析。參照CHEN等[24]的方法，挑選2名經(jīng)過聞香訓(xùn)練的碩士研究生進(jìn)行聞香分析。應(yīng)用時(shí)間強(qiáng)度法，記錄香氣出現(xiàn)時(shí)間和香氣特征，香氣強(qiáng)度以0～5六個(gè)級(jí)別表述，“0”表示未聞到，“3”表示香氣強(qiáng)度中等，“5”表示香氣強(qiáng)度非常強(qiáng)。每人對(duì)每個(gè)組分聞香3次，每個(gè)化合物的香氣強(qiáng)度為6次聞香結(jié)果的平均值。

GC-MS分析。色譜條件：色譜柱，DB-FFAP (60 m ×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：起始溫度50 ℃，保持2 min后，以5 ℃ /min升溫至230 ℃， 保持15 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣(He)流速2 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，不分流；樣品經(jīng)色譜柱分離后以1∶1分別進(jìn)入Mass和ODP進(jìn)行檢測(cè)。MS條件：EI電離源；電子能量70 eV；掃描范圍30.00～350.00 amu；離子源溫度230 ℃。

香氣物質(zhì)定性方法。通過與NIST 05 質(zhì)譜庫(Agilent Technologies Inc.)中標(biāo)準(zhǔn)譜圖匹配、與文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)比對(duì)、香氣化合物香氣特征進(jìn)行初步鑒定，最后通過與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)譜圖及RI值比對(duì)進(jìn)行最終的驗(yàn)證。保留指數(shù)是根據(jù)改進(jìn)的Kovats法計(jì)算得出，將C7-C30的正構(gòu)烷烴標(biāo)樣配制于正己烷中，進(jìn)行GC-MS分析，根據(jù)得到的正構(gòu)烷烴保留時(shí)間計(jì)算香氣成分的保留指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬油樣品香氣組分的提取和預(yù)分離

本研究用二氯甲烷萃取傳統(tǒng)醬油香氣組分，進(jìn)一步通過SAFE除去萃取液中的不揮發(fā)性組分得到無色透明的醬油香氣萃取液。通過嗅聞條對(duì)醬油香氣萃取液進(jìn)行感官分析確認(rèn)萃取液的整體香氣特征與醬油的香氣十分接近，表明萃取液能夠顯著地代表醬油的典型風(fēng)味特征。為鑒定傳統(tǒng)醬油樣品中的香氣活性成分，對(duì)香氣萃取液進(jìn)行GC-O/MS分析。

對(duì)傳統(tǒng)醬油香氣萃取液直接進(jìn)行GC-O分析發(fā)現(xiàn)其香氣組分十分復(fù)雜，共流出現(xiàn)象較為突出，直接聞香分析難以有效判別。因此本研究進(jìn)一步采用正相色譜技術(shù)將醬油香氣萃取液中的香氣組分根據(jù)極性的不同分離為11個(gè)組分。實(shí)驗(yàn)室PANEL小組對(duì)11個(gè)組分進(jìn)行感官分析(如表1)表明不同組分間具有顯著的風(fēng)味差異，各組分香氣的復(fù)雜性顯著降低。F1和F2呈現(xiàn)溶劑香，隨洗脫極性提高，F(xiàn)3～F5逐漸呈現(xiàn)出植物、花香和甜香的香氣特征，隨著洗脫極性進(jìn)一步增強(qiáng)，F(xiàn)6和F7呈現(xiàn)奶酪、面包、煮蔬菜、堅(jiān)果、香辛料等香氣特征，F(xiàn)8～F11具有奶油、煙熏、焦糖、調(diào)味品等香氣特征。進(jìn)一步通過GC-O/MS對(duì)不同組分進(jìn)行分離鑒定后可以觀察到樣品中化合物的洗脫順序基本按照極性大小依次洗脫。如圖1所示，酯類等極性較低的化合物集中在前幾個(gè)組分中，醇類等中等極性化合物集中在中間組分，而酸類等強(qiáng)極性化合物最后洗脫。表明正相色譜技術(shù)能夠有效地將復(fù)雜樣品的香氣組分按照極性大小依次分離。

表1 醬油預(yù)分離組分F1～F11感官特征分析Table 1 Analysis of sensory characteristics of soy sauce pre-separation fractions F1-F11

圖1 各類香氣活性成分在各組分中分布統(tǒng)計(jì)Fig.1 Statistical distribution of different types of aroma-active compounds in each fraction

2.2 醬油樣品香氣組分的GC-O分析

通過GC-O分析，本實(shí)驗(yàn)在中國傳統(tǒng)曬露醬油中共鑒定出80種香氣成分(表2)，包括7種醇類、6種酸類、7種醛類、11種酮類、12種酯類、8種吡嗪類、5種酚類、9種含硫化合物、11種內(nèi)酯和呋喃(酮)類(內(nèi)酯類、呋喃類、呋喃酮類)、3種萜烯類化合物以及1種其他類香氣化合物。相較于馮云子[2]聯(lián)合采用液液萃取、同時(shí)蒸餾萃取和固相微萃取3種萃取方法結(jié)合GC-O技術(shù)在廣式醬油中鑒定到60種香氣活性成分，本實(shí)驗(yàn)采用1種香氣提取方法結(jié)合GC-O技術(shù)共鑒定出80種香氣活性成分，表明了中國傳統(tǒng)醬油香氣組分的復(fù)雜性特征。

根據(jù)鑒定化合物的香氣特征，將具有相同或相似香氣特征的香氣活性成分歸類整理形成如圖2所示的中國傳統(tǒng)醬油香氣特征分類圖，結(jié)果表明鑒定的香氣活性成分主要可以分成花果香，焦糖，堅(jiān)果、烘焙，煙熏，奶酪、酸，奶油、甜香，煮蔬菜(煮土豆、蔥蒜等，具有蘑菇香氣的1-辛烯-3-醇和1-辛烯-3-酮，由于香氣屬性相似，也歸到此類)和其他香氣共8類，表明醬油整體香氣特征是由多種香氣活性成分共同作用形成的復(fù)合香。根據(jù)香氣特征，對(duì)中國傳統(tǒng)曬露醬油的香氣活性成分?jǐn)?shù)量和總香氣貢獻(xiàn)度統(tǒng)計(jì)如表3所示，由表3可知具有花果香、焦糖以及堅(jiān)果、烘焙類香氣特征的香氣活性成分對(duì)中國傳統(tǒng)曬露醬油的整體風(fēng)味具有較高的貢獻(xiàn)。

表2 醬油香氣活性化合物GC-O結(jié)果Table 2 Aroma-active compounds of soy sauce detected by GC-O

續(xù)表1

編號(hào)RIDB-FFAPaRILb物質(zhì) 香氣描述 鑒定依據(jù)c 香氣強(qiáng)度d181 3191 316異戊烯醇(prenol)杏子Mass、RI、Aroma2191 3321 3322,6-二甲基吡嗪(pyrazine, 2,6-dimethyl-)堅(jiān)果、烘焙Mass、RI、Aroma、Std.2201 3371 3392-巰基丙酸乙酯(ethyl 2-mercapto propionate)熱帶水果Mass、RI、Aroma、Std.2211 3481 352二甲基三硫(dimethyl trisulfide)煮洋蔥Mass、RI、Aroma、Std.2221 3501 3531-羥基-2-丁酮(1-hydroxy-2-butanone)甜香Mass、RI、Aroma、Std.2231 3541 3572-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮(2-cyclopenten-1-one, 2-methyl-)湯、熟食Mass、RI、Aroma1241 3731 3722-環(huán)戊烯-1-酮(2-cyclopenten-1-one)薄荷Mass、RI、Aroma2251 3751 3712-乙基-6-甲基吡嗪(2-ethyl-6-methylpyrazine)堅(jiān)果、烘焙Mass、RI、Aroma1261 3951 397壬醛(nonanal)青草Mass、RI、Aroma、Std.2271 4091 4132,3,5-三甲基吡嗪(2,3,5-trimethyl pyrazine)堅(jiān)果、烤土豆Mass、RI、Aroma、Std.2281 4121 4162-乙烯基吡嗪(2-vinylpyrazine)堅(jiān)果Mass、RI、Aroma、Std.2291 4121 4002-羥基丁酸乙酯(butanoic acid, 2-hydroxy-, ethyl ester)水果Mass、RI、Aroma2301 4231 427乙酸(acetic acid)酸香Mass、RI、Aroma、Std.2311 4381 4421-辛烯-3-醇(1-octen-3-ol)蘑菇Mass、RI、Aroma、Std.3321 4521 4552-乙基-3,5-二甲基吡嗪(2-ethyl-3,5-dimethylpyrazine)面包、烘焙Mass、RI、Aroma2331 4581 4523-甲硫基丙醛(propanal, 3-(methylthio)-)煮土豆Mass、RI、Aroma、Std.3.5341 4741 467糠醛(furfural)堅(jiān)果Mass、RI、Aroma、Std.2.5351 4901 4872,3-二乙基-5-甲基吡嗪(2,3-diethyl-5-methylpyrazine)烘焙Mass、RI、Aroma1.5361 4961 4922-乙烯基-6-甲基吡嗪(2-vinyl-6-methylpyrazine)新鮮榛子Mass、RI、Aroma2371 5301 5482,3-丁二醇(2,3-butanediol)水果、甜香Mass、RI、Aroma、Std.2381 5301 529苯甲醛(benzaldehyde)杏仁Mass、RI、Aroma、Std.1.5391 5461 552芳樟醇(linalool)花香Mass、RI、Aroma、Std.1.5401 5571 5595-甲基糠醛(5-methylfurfural)烘焙Mass、RI、Aroma2411 5871 5802-甲基丙酸(2- methyl propionic acid)奶酪Mass、RI、Aroma、Std.1.5421 6141 614γ-戊內(nèi)酯(γ-valerolactone)花香、椰子Mass、RI、Aroma1431 6221 6243-甲基-4-戊內(nèi)酯(3-methyl-4-pentanolide)焦糖、木頭Mass、RI、Aroma、Std.2441 6231 6442-乙?；邕?2-acetyl thiazole)爆米花Mass、RI、Aroma2451 6301 628丁酸(butanoic acid)奶酪Mass、RI、Aroma、Std.2461 6421 650苯乙醛(benzeneacetaldehyde)花香Mass、RI、Aroma、Std.3481 6431 640糠醇(2-furanmethanol)焦糖、甜香Mass、RI、Aroma、Std.3471 6431 6443-甲基丁酸(butanoic acid, 3-methyl-)奶酪Mass、RI、Aroma、Std.2.5491 6481 6482-甲基丁酸(butanoic acid, 2-methyl-)奶酪Mass、RI、Aroma、Std.3501 6851 6662-異戊基-3,6-二甲基吡嗪(2-isopentyl-3,6-dimethylpyrazine)甜香、堅(jiān)果Mass、RI、Aroma1.5511 7181 7193-甲硫基丙醇(propanol, 3-(methylthio)-)煮土豆Mass、RI、Aroma、Std.2521 7251 7215-甲基糠醇(2-furanmethanol, 5-methyl-)焦糖、甜香Mass、RI、Aroma、Std.2.5531 7581 768苯乙酸乙酯(benzeneacetic acid, ethyl ester)蜂蜜、花香Mass、RI、Aroma、Std.2541 7731 7672(5H)呋喃酮(2(5H)-furanone)焦糖Mass、RI、Aroma2551 8281 806突厥酮((E)-β-damascenone)花香、蘋果Mass、RI、Aroma、Std.2561 8341 8332-羥基-3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮(2-hydroxy-3-methyl-2-cyclopenten-1-one)焦糖、楓糖漿Mass、RI、Aroma、Std.3571 8361 835乙酸-2-苯乙酯(acetic acid, 2-phenylethyl ester)蜂蜜、蘋果Mass、RI、Aroma、Std.2.5581 8381 815愈創(chuàng)木酚(phenol, 2-methoxy-)煙熏Mass、RI、Aroma、Std.3591 8831 885苯甲醇(benzyl alcohol)花香Mass、RI、Aroma、Std.1.5601 9091 9272-乙酰基吡咯(2-acetylpyrrole)爆米花Mass、RI、Aroma、Std.2611 9161 914苯乙醇(phenylethyl alcohol)花香Mass、RI、Aroma、Std.2621 9741 970苯并噻唑(benzothiazole)橡膠Mass、RI、Aroma2632 0172 019γ-壬內(nèi)酯(γ-nonalactone)桃子、水果Mass、RI、Aroma、Std.2642 0252 002麥芽酚(maltol,(3-hydroxy-2-methyl-4H-pyran-4-one))焦糖、棉花糖Mass、RI、Aroma、Std.2652 0262 0244-乙基愈創(chuàng)木酚(phenol, 4-ethyl-2-methoxy-)煙熏Mass、RI、Aroma、Std.3662 0452 037HDMF(furaneol)焦糖Mass、RI、Aroma、Std.3.5672 0542 0482-吡咯烷酮(2-pyrrolidinone)爆米花Mass、RI、Aroma2682 0552 070泛內(nèi)酯(3-hydroxy-4,4-dimethyldihydro-2(3H)-furanone)棉花糖、椰子、焦糖Mass、RI、Aroma、Std.2692 0812 085HEMF(5-ethyl-4-hydroxy-2-methyl-3(2H)furanone)焦糖Mass、RI、Aroma、Std.3702 1372 1234-羥基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮(4-hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanone)焦糖Mass、RI、Aroma、Std.2.5712 1652 1604-乙烯基愈創(chuàng)木酚(2-methoxy-4-vinylphenol)煙熏Mass、RI、Aroma、Std.1.5722 1742 1744-乙基苯酚(phenol, 4-ethyl-)辛料Mass、RI、Aroma、Std.2.5732 2092 203葫蘆巴內(nèi)酯(sotolone)焦糖、調(diào)味品Mass、RI、Aroma、Std.3742 2492 2492-羥基-3-苯基丙酸乙酯(ethyl 2-hydroxy-3-phenylpropanoate)煙氣Mass、RI、Aroma2752 2632 270二苯并呋喃(dibenzofuran)橡膠Mass、RI、Aroma2762 3432 3033,4,5-三甲基苯酚(phenol, 3,4,5-trimethyl-)墨水、煙氣Mass、RI、Aroma2.5772 5272 520雙(2-糠基)二硫(bis(2-furfuryl)disulfide)炒洋蔥Mass、RI、Aroma、Std.2.5782 5632 565苯乙酸(phenylacetic acid)蜂蜜Mass、RI、Aroma、Std.2.5792 5822 585香蘭素(benzaldehyde, 4-hydroxy-3-methoxy-)香草、奶油Mass、RI、Aroma、Std.3802 6292 623香蘭酸乙酯(ethyl vanillate)香草Mass、RI、Aroma1

注：a：化合物在FFAP極性柱上的保留指數(shù)；b：RIL，參考文獻(xiàn)保留指數(shù)；c：鑒定依據(jù)，MS表示經(jīng)質(zhì)譜比對(duì)鑒定，RI表示與文獻(xiàn)報(bào)道RI值比對(duì)鑒定，Aroma表示與文獻(xiàn)報(bào)道香氣描述比對(duì)鑒定，Std.表示使用標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證；d化合物的香氣強(qiáng)度值為該化合物在所有組分中檢測(cè)出的最高值。

圖2 中國傳統(tǒng)曬露醬油香氣特征分類Fig.2 Classification according to aroma characteristic in traditional Chinese-type soy sauce

表3 中國傳統(tǒng)曬露醬油中香氣活性成分?jǐn)?shù)量和總香氣貢獻(xiàn)度Table 3 The amount of aroma-active compounds and total aroma contribution in traditional Chinese-type soy sauce

香氣特征分類 數(shù)量總香氣貢獻(xiàn)度/%花果香2426.2焦糖1218.8堅(jiān)果、烘焙1416 煙熏69 奶酪、酸56.8奶油、甜香65.6煮蔬菜912 其他55.6綜合80100

花果香氣特征類物質(zhì)：由表3可知，在中國傳統(tǒng)曬露醬油中共鑒定出24種具有花果香氣特征的香氣活性成分，總香氣貢獻(xiàn)度為26.2%，是對(duì)醬油整體風(fēng)味貢獻(xiàn)度最高的一類物質(zhì)。絕大部分酯類、醇類和萜烯類物質(zhì)以及部分含苯環(huán)的酸類和醛類(如苯乙酸和苯乙醛)、部分內(nèi)酯類和呋喃(酮)物質(zhì)(如γ-壬內(nèi)酯)呈現(xiàn)花果香氣，能夠使醬油整體風(fēng)味更加清雅。具有水果香氣的乙酸乙酯(香氣強(qiáng)度=3)、玫瑰香氣的苯乙醛(3)、蜂蜜香氣的乙酸-2-苯乙酯(2.5)和苯乙酸(2.5)的香氣強(qiáng)度較大，可能是中國傳統(tǒng)曬露醬油潛在的關(guān)鍵香氣活性成分，同時(shí)這4種物質(zhì)均是廣式醬油或日式醬油的香氣活性成分[25-27]。酯類物質(zhì)為有機(jī)酸與醇類物質(zhì)經(jīng)過曲霉或酵母酯化酶的酯化作用生成，乙酸乙酯為代表性物質(zhì)[28]。苯乙醛是常見的Strecker醛，能夠由氨基酸熱降解產(chǎn)生[2]。SCHIEBERLE團(tuán)隊(duì)[10]研究表明具有花香蜂蜜特征的苯乙醇是日式醬油的關(guān)鍵香氣成分，但在本研究中苯乙醇的香氣強(qiáng)度為2，表明同一香氣活性成分對(duì)不同工藝醬油風(fēng)味貢獻(xiàn)的差異性。兩種萜烯類化合物，花香特征的芳樟醇[29]和檸檬樣香氣的檸檬烯[30]作為香氣活性成分第一次在中國傳統(tǒng)曬露醬油中鑒定到，萜烯類物質(zhì)能夠使醬油的風(fēng)味更加優(yōu)雅細(xì)膩。萜烯類物質(zhì)廣泛存在于天然植物體內(nèi)，一般具有花果、青草、樹木等植物香氣，是一類香氣閾值較低的重要香氣物質(zhì)，而且是有益身體健康的生理活性物質(zhì)[31]。

焦糖香氣特征類物質(zhì)：在中國傳統(tǒng)曬露醬油中共鑒定出12種具有焦糖香氣的物質(zhì)，總香氣貢獻(xiàn)度為18.8%，單個(gè)物質(zhì)的平均香氣貢獻(xiàn)度達(dá)1.56%，表明具有焦糖香氣類物質(zhì)對(duì)醬油整體風(fēng)味具有重要的貢獻(xiàn)，是中國傳統(tǒng)曬露醬油中潛在的關(guān)鍵香氣成分。焦糖香氣主要是內(nèi)酯和呋喃(酮)類，以及某些酮類物質(zhì)，焦糖香氣特征物質(zhì)能夠使醬油整體風(fēng)味更加濃厚甜潤。大部分具有焦糖香氣化合物的分子結(jié)構(gòu)特征均是環(huán)酮分子中含有烯醇化的結(jié)構(gòu)單元，此類物質(zhì)在食用香料中占有非常重要的地位[2]。在中國傳統(tǒng)曬露醬油中具有焦糖樣香氣強(qiáng)度較大的物質(zhì)有：HDMF(3.5)、糠醇(3)、2-羥基-3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮(3)、HEMF(3)、葫蘆巴內(nèi)酯(3)和4-羥基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮(2.5)。HDMF、HEMF和葫蘆巴內(nèi)酯作為醬油香氣活性成分被多次報(bào)道[2,10-12,25-27]，而2-羥基-3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮被馮云子等[2]檢測(cè)到作為廣式醬油的香氣活性成分。兩種內(nèi)酯類化合物，3-甲基-4-戊內(nèi)酯[32]和泛內(nèi)酯[33]作為香氣活性成分首次在中國傳統(tǒng)曬露醬油中鑒定出，對(duì)醬油整體風(fēng)味具有正面的貢獻(xiàn)，能夠增加醬油的“焦糖”風(fēng)味。

堅(jiān)果、烘焙和煙熏香氣類特征物質(zhì)：在中國傳統(tǒng)曬露醬油中分別鑒定出14種具有堅(jiān)果、烘焙香氣和6種具有煙熏香氣的物質(zhì)，總香氣貢獻(xiàn)度分別為16%和9%，對(duì)醬油的整體風(fēng)味具有較高的貢獻(xiàn)，與醬油具有烘焙、煙熏的風(fēng)味感官特征較一致。吡嗪類香氣化合物主要呈現(xiàn)典型的堅(jiān)果、烤面包等烘焙類香氣特征，微生物代謝和美拉德反應(yīng)是吡嗪類香氣物質(zhì)生成的主要途徑[28]，推測(cè)中國傳統(tǒng)曬露醬油中豐富的吡嗪類物質(zhì)可能與其長期日曬夜露的獨(dú)特工藝有著密切的關(guān)系。愈創(chuàng)木酚(3)、4-乙基愈創(chuàng)木酚(3)和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚(1.5)這3種物質(zhì)具有典型的煙熏樣香氣特征，這3種物質(zhì)以及其他酚類化合物(如3,4,5-三甲基苯酚(煙氣))可能是構(gòu)成中國傳統(tǒng)曬露醬油“煙熏”風(fēng)味特征的重要香氣化合物，香氣強(qiáng)度較大的愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚可能是中國傳統(tǒng)曬露醬油中潛在的關(guān)鍵香氣活性成分。酚類物質(zhì)可能主要來源于植物原料中木質(zhì)素和其他植物次級(jí)代謝產(chǎn)物[28]。

奶酪、酸和奶油甜香香氣類特征物質(zhì)：在中國傳統(tǒng)曬露醬油中分別鑒定出5種具有奶酪、酸香香氣特征和6種具有奶油甜香香氣特征的物質(zhì)。其中2-甲基丁酸(3)和3-甲基丁酸(2.5)以及香蘭素(3)具有較高的香氣強(qiáng)度，可能是中國傳統(tǒng)曬露醬油潛在的關(guān)鍵香氣活性成分，且這3種物質(zhì)均作為日式醬油香氣活性成分被鑒定到[10-11]。香蘭素具有典型的香草、奶油香氣特征[11]，研究表明小麥中含有高濃度的阿魏酸，而阿魏酸通過生物或化學(xué)作用轉(zhuǎn)化為香蘭素的途徑已經(jīng)得到廣泛證實(shí)[34]，因此香蘭素可能來自醬油釀造過程中使用的小麥原料。

煮蔬菜與其他香氣特征類物質(zhì)：含硫化合物一般具有煮蔬菜的香氣特征，如煮土豆的3-甲硫基丙醛和3-甲硫基丙醇、煮白菜的二甲基二硫、煮洋蔥的二甲基三硫以及炒洋蔥香氣的雙(2-糠基)二硫，含硫化合物的生成通常被認(rèn)為與含硫氨基酸的代謝有關(guān)，在中國傳統(tǒng)曬露醬油中共鑒定出9種具有煮蔬菜香氣特征的物質(zhì)，總香氣貢獻(xiàn)度為12%，硫化物的含量雖然較低[2]，但對(duì)醬油整體風(fēng)味具有重要的貢獻(xiàn)。在中國傳統(tǒng)曬露醬油中3-甲硫基丙醛具有較高的香氣強(qiáng)度(3.5)，該物質(zhì)具有極低的閾值(1.4 μg/L)[10]，是醬油的關(guān)鍵香氣活性組分[9-11]。具有炒洋蔥香氣特征的雙(2-糠基)二硫[35]首次作為香氣活性成分在中國傳統(tǒng)曬露醬油中被鑒定到，可能能夠增強(qiáng)醬油整體風(fēng)味的“調(diào)味品”香氣特征。此外，具有蘑菇樣香氣的1-辛烯-3-醇(3)和1-辛烯-3-酮(2)是廣式醬油或日式醬油的香氣活性成分[9-13]，也可能是中國傳統(tǒng)曬露醬油中潛在的關(guān)鍵香氣化合物。

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用液液萃取結(jié)合溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)技術(shù)分離濃縮醬油樣品的香氣成分，并應(yīng)用正相色譜技術(shù)將樣品香氣萃取液預(yù)分離，聯(lián)用GC-O和GC-MS分析技術(shù)，解析醬油樣品的香氣活性成分。通過聞香分析，在中國傳統(tǒng)曬露醬油中共鑒定出80種香氣活性成分，并根據(jù)鑒定的香氣化合物的香氣特征，將具有相同或相似香氣特征的香氣活性成分歸類整理為花果香，焦糖，堅(jiān)果、烘焙，煙熏，奶酪、酸，奶油、甜香，煮蔬菜和其他香氣共8種類。其中，12種香氣強(qiáng)度較大(≥3)的物質(zhì)：3-甲硫基丙醛、乙酸乙酯、1-辛烯-3-醇、2-甲基丁酸、愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、香蘭素、2-羥基-3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮、葫蘆巴內(nèi)酯、HEMF、HDMF以及糠醇可能是中國傳統(tǒng)曬露醬油潛在的關(guān)鍵香氣成分。另外，3-甲基-4-戊內(nèi)酯、泛內(nèi)酯、芳樟醇、檸檬烯和雙(2-糠基)二硫作為香氣活性成分首次在中國傳統(tǒng)曬露醬油中被鑒定到。