動(dòng)物模型移植人源腸道菌群在中醫(yī)藥防治糖脂代謝病中的關(guān)鍵技術(shù)和挑戰(zhàn)

吳佳銘 高翔 謝抗 榮向路 葉得偉

摘要糖脂代謝病是影響和危害全球公共健康的一類重大疾病。近年來，越來越多的證據(jù)指向糖脂代謝病和腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能改變密切相關(guān)。但是，臨床研究很難在人群進(jìn)行干預(yù)試驗(yàn)揭示腸道菌群改變與疾病核心機(jī)理的因果關(guān)系。因此，動(dòng)物模型移植人源腸道菌群成為揭示中醫(yī)藥等干預(yù)策略或臨床特征與腸道菌群改變因果關(guān)系的關(guān)鍵研究策略之一。動(dòng)物模型移植人源腸道菌群研究方法主要包括4個(gè)主要步驟：1）采集觀察組和對(duì)照人群的的糞便，進(jìn)行移植菌液制備;2）廣譜抗生素誘導(dǎo)的條件性無菌小鼠誘導(dǎo);3）運(yùn)用整體菌群或經(jīng)宏基因組學(xué)分析鑒定出的特異性菌屬，移植到條件性無菌小鼠后，進(jìn)行代謝性疾病動(dòng)物模型誘導(dǎo);4）比較分別接受干預(yù)組和對(duì)照組人源腸道菌群移植小鼠的糖脂代謝表型。作為腸道菌群研究領(lǐng)域的前沿方法之一，動(dòng)物模型移植人源腸道菌群為中醫(yī)藥防治糖脂代謝病提供了新思路和線索。

關(guān)鍵詞糞便菌群移植;糖脂代謝病;腸道菌群;中醫(yī)藥藥效學(xué);無菌小鼠

中圖分類號(hào)：R2031;R825.8文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.007

人類腸道中含有數(shù)萬億的細(xì)菌，統(tǒng)稱為腸道菌群。腸道中的微生物被認(rèn)為是宿主生理中起關(guān)鍵作用的重要器官。人類腸道中微生物群的多樣性和物種的豐富性在出生2到4年后迅速增加，成年后則保持相對(duì)穩(wěn)定[1]。一個(gè)穩(wěn)定的腸道群落可以抵抗病原菌的定植，當(dāng)腸道菌群受到干擾時(shí)，細(xì)菌多樣性減少以及耐定植性降低，可使數(shù)量較少的致病菌增多并引起疾病，例如使用抗生素后艱難梭菌的感染（CDI）。

糖脂代謝病是影響和危害全球公共健康的一類重大疾病。近年來，越來越多的證據(jù)指向糖脂代謝病和腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能改變密切相關(guān)。但是，臨床研究很難在人群進(jìn)行干預(yù)試驗(yàn)揭示腸道菌群改變與疾病核心機(jī)理的因果關(guān)系。因此，動(dòng)物模型移植人源腸道菌群成為揭示中醫(yī)藥等干預(yù)策略或臨床特征與腸道菌群改變因果關(guān)系的關(guān)鍵研究策略之一。

1腸道菌群移植（FMT）的發(fā)展歷史

為了恢復(fù)腸道菌群的平衡，醫(yī)生將健康人群糞便中的功能菌群轉(zhuǎn)移到患者的腸道內(nèi)，即糞便菌群移植技術(shù)（Fecal Microbiota Transplantation，F(xiàn)MT），也被稱為糞便細(xì)菌療法、糞便輸液、糞便移植或糞便灌腸等。FMT在治療多種疾病方面有著悠久的歷史。公元300～400年間，東晉時(shí)期醫(yī)家葛洪在《肘后備急方》中記載運(yùn)用FMT治療食物中毒、發(fā)熱、腹瀉并瀕臨死亡的患者，述“絞糞汁，飲數(shù)合至一二升，謂之黃龍湯，陳久者佳”，還記載了“驢矢，絞取汁五六合，及熱頓服，立定”，可見有奇效[2]?！吨夂髠浼狈健肥侵袊谝槐炯卑Y醫(yī)學(xué)書籍，也是世界上最早記錄青蒿治療瘧疾的文獻(xiàn)。采用人的糞便進(jìn)行多種消化道急危重癥的治療，在明朝更是幾乎達(dá)到極致。16世紀(jì)，李時(shí)珍所著的《本草綱目》記載用人糞治病的療方多達(dá)20種，記載了將各種糞便衍生產(chǎn)品，用于胃腸道和全身癥狀疾病，如嚴(yán)重腹瀉、發(fā)熱、嘔吐和便秘等[2]。中醫(yī)學(xué)一直是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的寶庫，中國古代用糞便治病的方法，看似離譜，但在今天終于找到了對(duì)應(yīng)的科學(xué)解釋。盡管中醫(yī)對(duì)FMT治療疾病的應(yīng)用歷史悠久，但是FMT與病證關(guān)系的機(jī)理需要更深入的探究。

2FMT的應(yīng)用現(xiàn)狀

近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群與多種疾病相關(guān)，例如：梭狀芽胞桿菌感染（CDI）、炎癥性腸?。↖BD）和代謝性疾病（如肥胖、2型糖尿病和非酒精性脂肪性肝炎）等。目前，已經(jīng)證明FMT在CDI治療中的效果優(yōu)于抗生素[3]。此外，F(xiàn)MT在治療多種代謝性疾病中也具有巨大的潛力。

2.1FMT和肥胖

無菌（Germfree）小鼠的出現(xiàn)和測(cè)序方法的技術(shù)進(jìn)步，促使微生物在體重管理和葡萄糖、脂質(zhì)代謝的因果關(guān)系研究中取得重大進(jìn)展。Backhed等人[4]將肥胖和糖尿病模型小鼠的糞便移植到Germfree健康小鼠后，發(fā)現(xiàn)即使減少了進(jìn)食量，Germfree（C56BL/6J）小鼠的體重和胰島素抵抗仍然成升高趨勢(shì)。另外，將ob/ob肥胖小鼠的菌群移植到Germfree小鼠后，發(fā)現(xiàn)普通飼料喂養(yǎng)的Germfree小鼠也會(huì)出現(xiàn)肥胖表型[5]。2013年，Ridaura等人[6]首次將人類糞便移植到Germfree的C57BL/6J小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)移植了肥胖人群糞便材料后的小鼠體重出現(xiàn)升高。

2.2FMT和糖尿病

到目前為止，只有一個(gè)隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)研究了FMT對(duì)胰島素抵抗的影響[7]。研究人員發(fā)現(xiàn)9例胰島素抵抗的糖尿病患者經(jīng)過6周的FMT治療，腸道微生物多樣性增加、短鏈脂肪酸含量增加并且胰島素敏感性改善。雖然FMT對(duì)胰島素敏感性的影響是顯著的，但因?yàn)樗且粋€(gè)侵入性的過程，所以不太可能應(yīng)用于未來的治療。此外，受試者即使有大量腸道菌群是由移植而來，但腸道菌群的組成分析結(jié)果證明受試者的腸道菌群還可以恢復(fù)到最初狀態(tài)[8]。雖然目前只有一個(gè)RCT試驗(yàn)，但是FMT對(duì)未來糖尿病的治療仍然提供了新的思路和線索[9]。

2.3FMT和非酒精性脂肪肝/非酒精性脂肪肝炎

非酒精性脂肪肝病（Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）和非酒精性脂肪肝炎（Nonalcoholic Steatohepatitis，NASH）易發(fā)生在過量脂肪堆積在肝臟時(shí)，其中大部分患者都伴隨有肥胖和胰島素抵抗。全球的肥胖癥流行引發(fā)了NAFLD和NASH危機(jī)，但是缺乏有效的治療策略[10]。有研究發(fā)現(xiàn)同樣采用高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD小鼠模型和未成模小鼠，將模型小鼠的腸道菌群移植到Germfree小鼠體內(nèi)，可以對(duì)Germfree小鼠產(chǎn)生類似HFD的影響，這提示腸道菌群可能在NAFLD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[11]。有研究結(jié)果表明NAFLD/NASH與腸道微生物群的改變，包括腸道通透性增加，乙醇產(chǎn)量改變，膽堿代謝障礙，以及膽汁酸信號(hào)障礙等相關(guān)[12]。

2.4FMT治療有關(guān)的臨床試驗(yàn)

最近，Clinical Trials.gov公布了幾項(xiàng)正在進(jìn)行的用于代謝性疾病治療的FMT臨床測(cè)試試驗(yàn)。1）馬薩諸塞州綜合醫(yī)院招募健康的偏瘦人群作為供體，將其糞便以膠囊的給藥方式對(duì)肥胖人群進(jìn)行FMT，以研究對(duì)體重和胰島素敏感性的影響（Clinical Trials.gov ID NCT02530385）。2）來自中國南京醫(yī)科大學(xué)的研究人員正在評(píng)估一項(xiàng)處于第3階段試驗(yàn)的結(jié)果，旨在通過糞便菌群移植重建2型糖尿病患者的腸道菌群的功能（Clinical Trials.gov ID NCT01790711）。3）加拿大一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)研究將來自健康志愿者的糞便細(xì)菌移植到患有代謝綜合征和NAFLD的患者中，以驗(yàn)證FMT是否可以改變胰島素抗性并減少肝內(nèi)脂肪堆積（Clinical Trials.gov ID NCT02496390）。這些臨床試驗(yàn)表明FMT已經(jīng)成為治療代謝性疾病的重點(diǎn)和熱點(diǎn)技術(shù)之一。

3動(dòng)物模型移植人源腸道菌群的應(yīng)用

3.1研究策略

在臨床試驗(yàn)中，研究微生物群在各種疾病狀態(tài)下的作用機(jī)制是非常困難的，所以多以小鼠為主要研究對(duì)象建立人類微生物相關(guān)（HMA）動(dòng)物模型，用于研究人類不同疾病狀態(tài)和微生物宿主之間的關(guān)系[13]。目前，解析與疾病表型相關(guān)的腸道菌群改變與疾病核心病理機(jī)制因果關(guān)系的關(guān)鍵研究策略，分整體菌群移植和經(jīng)宏基因組學(xué)分析鑒定出的特異性菌屬（Strain）移植2種方式。第1種方式直接將糞便樣品制備成菌液或膠囊，然后通過灌胃或灌腸的給藥方式，將供體的整體菌群移植到Germfree小鼠體內(nèi)。第2種方式是將人源糞便樣品進(jìn)行宏基因組學(xué)測(cè)序，鑒定出疾病或證候相關(guān)的特異性菌屬，然后將純化的特異性菌屬通過灌胃的給藥方式注入Germfree小鼠體內(nèi)，最后通過表型鑒定建立腸道菌群和疾病證候的因果關(guān)系。

3.2相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)上述2種研究策略，F(xiàn)MT是揭示與特定藥物藥效學(xué)與腸道菌群改變相關(guān)性因果關(guān)聯(lián)的必需實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。見圖1。首先，通過臨床招募志愿者的方式收集糞便樣品并制備，然后采用宏基因組測(cè)序的方式鑒定出與疾病或證候相關(guān)的特異性菌屬。在測(cè)序的同時(shí)，對(duì)入組人群依據(jù)證候或疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分組，并收集相關(guān)基本信息、生化指標(biāo)和檢查結(jié)果。對(duì)樣品進(jìn)行菌液或膠囊制備后，挑選不同背景的SPF級(jí)小鼠，進(jìn)行無菌化處理后得到Germfree小鼠，隨后建立疾病或中醫(yī)證候模型。根據(jù)測(cè)序結(jié)果對(duì)Germfree模型小鼠經(jīng)口給予菌液或特異性菌屬，監(jiān)測(cè)Germfree小鼠不同組別的代謝表型。最后整合臨床信息、FMT動(dòng)物表型及宏基因組測(cè)序結(jié)果，進(jìn)一步闡釋腸道菌群與代謝性疾病的因果關(guān)系。

3.3關(guān)鍵技術(shù)

3.3.1糞便樣品供體的篩選FMT的研究之所以具有挑戰(zhàn)性，部分原因在于糞便的生物學(xué)復(fù)雜性[14]以及它在人與人之間的廣泛差異[15]。為了更好地完成FMT，我們提出了3項(xiàng)建議：1）研究人員應(yīng)該利用適應(yīng)性試驗(yàn)來克服供體糞便異質(zhì)性的挑戰(zhàn)，尋找差異性最大的糞便，盡可能的給觀察組提供最佳治療。2）盡可能齊全的收集供體人群的臨床信息，使研究人員能夠更好地評(píng)估糞便的異質(zhì)性。例如，供體的年齡、性別、種族、飲食、病史等信息。3）研究人員應(yīng)當(dāng)盡量使用當(dāng)?shù)鼗蛉珖募S便樣品庫，標(biāo)準(zhǔn)化的供體篩選、糞便收集和處理流程有助于提高研究結(jié)果的可比性和可重復(fù)性。

3.3.2菌液的處理傳統(tǒng)的FMT療法使用的是經(jīng)過醫(yī)學(xué)篩選的健康個(gè)體的新鮮糞便，但新鮮的糞便不會(huì)增加療效，還有感染受體的風(fēng)險(xiǎn)。另外，有研究表明新鮮、冷凍或凍干的FMT產(chǎn)品在治療反復(fù)發(fā)作的CDI時(shí)療效是相當(dāng)?shù)腫1618]。因此，使用冷凍和凍干產(chǎn)品不僅可以儲(chǔ)存樣本，還能增加使用的靈活性。Nathaniel D等人[19]發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于循環(huán)凍融和供體排便與移植制劑之間的延遲時(shí)間影響，氧氣暴露對(duì)糞便細(xì)菌群落減少的風(fēng)險(xiǎn)來說會(huì)更高。因此，我們建議最好是在厭氧艙中進(jìn)行樣品處理，以保護(hù)厭氧細(xì)菌。新鮮糞便通常應(yīng)在排便后6 h內(nèi)處理完[20]，在糞便未處理之前盡可能保存在無氧環(huán)境中，新鮮糞便保存在4 ℃下8 h就會(huì)減少微生物10%的多樣性[21]。

糞便樣品處理過程分為混懸、離心、過濾。在臨床應(yīng)用中多使用無菌鹽水（0.9%）來稀釋糞便材料，溶劑體積為3～5倍[2223]。然后，使用手工或?qū)Ｓ脭嚢铏C(jī)進(jìn)行均質(zhì)化，過濾和離心處理，以去除較大的顆粒，如未消化的食物。懸浮液倒入無菌容器中，密封保存，以待使用。此外，甘油可保護(hù)微生物細(xì)胞免受凍害，因此當(dāng)制備冷凍樣品時(shí)，冷凍前應(yīng)加入甘油至終濃度為10%，也有研究使用乙醇，但對(duì)乙醇的使用仍有爭(zhēng)議。有研究報(bào)道乙醇除了能殺死病原體外，還能嚴(yán)重改變共生菌群的組成，可能會(huì)消除噬菌體、真菌和非孢子細(xì)菌等關(guān)鍵元素[24]。最后，冷凍混懸液建議存儲(chǔ)在-80 ℃環(huán)境中[18]。

此外我們還可以使用自動(dòng)機(jī)械化處理，比如南京醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院采用基于GenFMTer的凈化系統(tǒng)作為處理糞便[2526]的自動(dòng)方法，實(shí)驗(yàn)室流程的標(biāo)準(zhǔn)化可以縮短處理時(shí)間，并避免技術(shù)人員接觸糞便物質(zhì)?；诶鋬黾S便的FMT方法對(duì)于糞便庫的開發(fā)是必不可少的，并且是FMT過程標(biāo)準(zhǔn)化并允許按需獲得糞便的最佳方式。統(tǒng)一、標(biāo)準(zhǔn)化的糞便處理過程，對(duì)腸道菌群研究和FMT的使用至關(guān)重要，可以提高FMT的治療效果和實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。

3.3.3FMT的過程及小鼠管理在小鼠實(shí)驗(yàn)中，對(duì)小鼠進(jìn)行FMT都采用灌胃的方式，然而每個(gè)研究灌胃的周期和頻率并不相同，需根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)。微生物群的組成、多樣性和代謝活動(dòng)受到多種環(huán)境因素的嚴(yán)重影響，包括飲食、水、光照、溫度、濕度、鋪墊材料、籠養(yǎng)條件、籠具更換頻率等，應(yīng)將這些實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行詳細(xì)的記錄并且應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制這些環(huán)境因素，以確保所有實(shí)驗(yàn)小鼠在實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)期間都處于相同的條件下。

3.4移植成功的標(biāo)準(zhǔn)及評(píng)價(jià)

FMT被認(rèn)為是確認(rèn)和證明腸道微生物研究中因果關(guān)系的黃金標(biāo)準(zhǔn)[2731]。然而，這些人源化模型中的宿主和微生物關(guān)系不一定可以反映人類中的真實(shí)關(guān)系，因?yàn)槟c道菌群被移植到不同物種的宿主中。FMT是否移植成功，尚無明確的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和體系。總的來說，目前的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是：通過對(duì)FMT后小鼠和人源供體的腸道菌群進(jìn)行基因測(cè)序分析，查看菌屬的豐度和物種是否具有相似性，鑒定FMT受體小鼠是否出現(xiàn)了與人源供體相似的特異性表型。為使FMT能更廣泛地應(yīng)用于中醫(yī)藥防治糖脂代謝病，可能需要一個(gè)更加精準(zhǔn)且合理的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

3.5FMT后代謝表型數(shù)據(jù)解釋中的常見問題

3.5.1移植后未出現(xiàn)表型轉(zhuǎn)移很多研究人員發(fā)現(xiàn)FMT實(shí)驗(yàn)在移植后未出現(xiàn)表型。例如，Kristine H.Allin等人[32]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)無法將糖尿病前期表型通過FMT轉(zhuǎn)移給小鼠，這可能有多種解釋。1）有些疾病的腸道微生物群的改變太過微妙，例如肥胖手術(shù)和二甲雙胍引起的改變[3334];2）關(guān)鍵菌群的移植程度可能太弱[23，35];3）由于小鼠和人類飲食差異、免疫應(yīng)答的宿主特異性和本地微生物群的競(jìng)爭(zhēng)等方面存在著相當(dāng)大的差異，導(dǎo)致表型相關(guān)的特異性菌群無法定植[36]。

3.5.2影響FMT代謝表型因素較多FMT的結(jié)果容易被各種因素影響和干擾。1）環(huán)境因素。小鼠腸道基因圖譜顯示環(huán)境因素對(duì)腸道菌群的影響比小鼠品系、飼料或性別更為明顯。[37]此外，小鼠的糞食性會(huì)使同籠小鼠腸道菌群出現(xiàn)逐漸均勻化[3839]。來自母體陰道、糞便和皮膚微生物群的微生物也會(huì)影響后代腸道菌群的組成[40]。2）飲食因素。MARIE等人通過飲食管理改變小鼠或人體內(nèi)的腸道菌群，進(jìn)而改變代謝表型[13]，這說明飲食是決定腸道菌群組成的重要因素。Chenhong Zhang等人[41]發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的組成與宿主的長(zhǎng)期飲食模式和健康表型密切相關(guān)，這提示我們?cè)谠u(píng)價(jià)腸道菌群組成時(shí)需要控制飲食變化。3）抗生素的影響?？股卣T導(dǎo)Germfree小鼠時(shí)，會(huì)導(dǎo)致Germfree小鼠出現(xiàn)耐藥菌的感染，如艱難梭菌[4243]，還會(huì)導(dǎo)致免疫力持久下降等不良后果[4445]。一些研究表明，廣譜抗生素預(yù)處理不能促進(jìn)外源微生物群的建立，甚至可能對(duì)外源的微生物群落產(chǎn)生有害影響[46]。研究報(bào)道采用包括兩性霉素B、萬古霉素，新霉素，甲硝唑，氨芐西林[47]在內(nèi)的更廣泛的抗生素方案可明顯改善移植效果。

4FMT在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀及展望

口服屬于中藥經(jīng)典的給藥方式之一，需要通過消化道對(duì)人體產(chǎn)生作用。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)不少中藥單藥和復(fù)方通過調(diào)節(jié)腸道菌群對(duì)一些疾病產(chǎn)生療效。在中藥單藥與腸道菌群的研究中，有研究報(bào)道黃連素灌胃可以顯著抑制非酒精性脂肪肝炎Babl/c模型小鼠中的乳酸菌和雙歧桿菌，并且可以改善肝內(nèi)脂肪性炎性反應(yīng)[48]。鄧志梅等人應(yīng)用黃連素聯(lián)合二甲雙胍對(duì)比單純胰島素治療100例2型糖尿病患者時(shí)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組的雙歧桿菌、擬桿菌和乳桿菌水平出現(xiàn)顯著降低[49]。在復(fù)方應(yīng)用方面，有研究人員針對(duì)450名患有2型糖尿病和高脂血癥的患者，采用專門設(shè)計(jì)的緩解高脂血癥和2型糖尿病的復(fù)方（AMC）作為觀察組并以二甲雙胍作為對(duì)照組進(jìn)行治療，結(jié)果顯示AMC和二甲雙胍均顯著改變了腸道菌群結(jié)構(gòu)并且改善了高血糖和高脂血癥的指標(biāo)，但是AMC改善胰島素抵抗（HOMAIR）和血漿三酰甘油的程度較對(duì)照組而言更為明顯[50]。另外，有研究結(jié)果顯示四君子湯、理中湯和補(bǔ)中益氣湯灌胃可以調(diào)節(jié)脾氣虛證大鼠模型的腸道菌群，并且改善脾氣虛的癥狀[51]。盡管很多研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥單體和復(fù)方改善癥狀與調(diào)節(jié)腸道菌群之間的相關(guān)性，但是對(duì)中藥通過腸道菌群影響臟腑和治療疾病的功能性研究仍然需要進(jìn)一步的探索和闡釋。

5討論

FMT在臨床應(yīng)用上歷史悠久。近年來，研究者通過動(dòng)物模型移植人源腸道菌群發(fā)現(xiàn)腸道菌群與多種疾病具有緊密聯(lián)系。運(yùn)用FMT不僅可以幫助確認(rèn)糖脂代謝病的表型與腸道菌群的因果關(guān)系，還能用于糖脂代謝病的治療。此外，通過FMT還可以挖掘中醫(yī)藥治療糖脂代謝病的新機(jī)制和新靶點(diǎn)，為研制新型藥物提供新的線索和思路。因此，動(dòng)物模型移植人源腸道菌群對(duì)于系統(tǒng)、深入揭示中醫(yī)藥防治糖脂代謝病的療效和分子機(jī)制具有重要科學(xué)意義。

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（2018-12-10收稿責(zé)任編輯：徐穎）