UPLC—ESI—Q—TOF—MS/MS分析槲皮苷在大鼠

覃小麗+孫慧園+楊武+李勇軍+鄭林+劉亭+黃勇

[摘要]該試驗(yàn)主要研究槲皮苷在大鼠腸道菌群中的代謝情況及其可能的生物轉(zhuǎn)化途徑，為中藥糖苷類成分的代謝機(jī)制奠定基礎(chǔ)。建立超高效液相色譜串聯(lián)電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定槲皮苷及其代謝產(chǎn)物的分析方法，流動(dòng)相為01%甲酸水01%甲酸乙腈，梯度洗脫，流速為03 mL·min-1，掃描方式為電噴霧負(fù)離子模式，將大鼠腸道菌群在體外與槲皮苷共同孵育使其發(fā)生代謝，采用此方法對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)合Metabolite ToolsTM，質(zhì)量虧損過(guò)濾（MDF）等技術(shù)，對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行篩查分析以及推測(cè)代謝產(chǎn)物化學(xué)式。結(jié)果顯示，槲皮苷發(fā)生脫糖、脫氧、乙?；确磻?yīng)，脫糖生成的苷元槲皮素進(jìn)一步發(fā)生羥基化、脫氧、還原、開環(huán)等反應(yīng)，得到槲皮素脫氧代謝產(chǎn)物山柰酚、槲皮素C2C3雙鍵加氫還原產(chǎn)物花旗松素、槲皮苷脫糖基產(chǎn)物槲皮素等。研究結(jié)果表明槲皮苷能夠在大鼠腸道菌群中發(fā)生代謝，增加了化合物的疏水性和化學(xué)多樣性。

[關(guān)鍵詞]槲皮苷； 腸道菌群； UPLCQTOFMS/MS； 代謝

Analysis of metabolites of quercitrin in rat intestinal flora by using

UPLCESIQTOFMS/MS

QIN Xiaoli1，2，4， SUN Huiyuan1，2 ， YANG Wu1，2 ， LI Yongjun3， ZHENG Lin1 ， LIU Ting1， HUANG Yong1*

（1 Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics， Guiyang 550004， China；

2 School of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China，

3 Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and Traditional Chinese Medicine，

Ministry of Education， Guiyang 550004， China，

4 National Engineering Research Center of Miao′s Medicines， Guiyang 550004， China）

[Abstract]To investigate the metabolism of quercitrin in rat intestinal flora and possible biological pathways， laying the foundation for the metabolic mechanism of traditional Chinese medicine glycosides ingredients UPLCQTOFMS/MS method was established to detect the quercitrin and its metabolites with 01% formic acid solution（A）01% formic acid acetonitrile（B） as the mobile phase for gradient elution at a flow rate of 03 mL·min-1 Electrospray negative ion mode was applied to analyze the metabolites of quercitrin in rat intestinal flora Metabolite ToolsTM， mass defect filter（MDF） and other technologies were used to screen， analyze the metabolites and infer the chemical formula of the metabolites The results showed that quercitrin would have degalactoside， deoxygenation and acetylation reactions， and the aglycone quercetin resulted from degalactoside would have further reactions such as hydroxylation， deoxygenation， reduction， and ring opening to achieve deoxygenation metabolite kaempferol， C2C3 double bonds hydrogenation and reduction product taxifolin， and degalactoside product quercetin The research results showed that quercitrin can be metabolized by rat intestinal flora， which could increase their hydrophobicity and chemical diversity

[Key words]quercitrin； intestinal flora； UPLCQTOFMS/MS； metabolism

中藥糖苷類成分是中藥中一類重要的活性成分，其突出的藥效活性受到廣泛關(guān)注，相關(guān)研究表明，糖苷類成分在腸道較難吸收，生物利用度低，在體內(nèi)難直接發(fā)揮作用[1]，然而卻能發(fā)揮藥效，這可能是腸道中存在大量的細(xì)菌[2]，使糖苷代謝成各種代謝產(chǎn)物，其代謝產(chǎn)物可能才是真正起藥理活性的成分，因此口服中藥糖苷類成分的活性與腸道菌群密不可分。而槲皮苷是由槲皮素和鼠李糖基組成的糖苷，具有中樞抑制、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛等作用[3]，在三七、銀杏葉、葒草花、頭花蓼等藥材中均含有此成分。目前國(guó)內(nèi)研究槲皮苷的藥理藥效[3]、吸收[46]等較多，但是關(guān)于槲皮苷在大鼠腸道菌群中的代謝情況尚不明確，因此本文采用UPLCQTOFMS/MS聯(lián)用技術(shù)，并在厭氧環(huán)境下研究槲皮苷在大鼠腸道菌群中的代謝規(guī)律，對(duì)槲皮苷及其類型的糖苷代謝機(jī)制具有十分重要的意義。

1材料

CDH6000BⅡ電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；SWCJ2FD超凈工作臺(tái)（蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司）；YXQLS18SI手提式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；厭氧產(chǎn)氣袋（AnaeroPackAnaero，MGC，日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社）；厭氧培養(yǎng)罐（PackRectangular Jars，日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社）；Agilent Technologies 1290 Infinity液相色譜系統(tǒng)（包括1290 Infinity二元泵，高性能自動(dòng)進(jìn)樣器，二級(jí)管陣列檢測(cè)器，柱溫箱）；ESIQTOFMS（布魯克道爾頓電噴霧四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，包括Metabolite ToolsTM，MDF技術(shù)等）；Allegra 64R低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter 公司）；MTN2800D氮吹濃縮裝置（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；EL204電子天平（梅特勒托利多儀器有限公司）。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)2014030401）和小牛浸膏（批號(hào)2014010800）購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司；硫酸銨（批號(hào)20120305）購(gòu)于重慶川江化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鉀（批號(hào)20130722）和碳酸鈉（批號(hào)20131206）購(gòu)于上?；瘜W(xué)試劑總廠；無(wú)水氯化鈣（批號(hào)2013101801）和硫酸鎂（批號(hào)20130522）購(gòu)于成都市科龍化工試劑廠；磷酸二氫鉀（批號(hào)120202）和氯化鈉（批號(hào)130927）購(gòu)于西隴化工股份有限公司；L半胱氨酸（批號(hào)100125）購(gòu)于上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；L抗壞血酸（批號(hào)402C036）購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨（批號(hào)130941）購(gòu)于上海博微生物科技有限公司；槲皮素對(duì)照品（批號(hào)1166101216）購(gòu)于中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心；槲皮苷（批號(hào)MB6680）和山柰酚（批號(hào)MB6888）對(duì)照品購(gòu)于大連美侖生物科技有限公司；花旗松素對(duì)照品（批號(hào) 111816201102）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲酸為色譜純（德國(guó)Merck 公司）；水為屈臣氏超純水；其他試劑均為分析純。

健康SD大鼠，雌雄兼用，體重（200～240） g，由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，編號(hào)SCXK（黔）20020001。動(dòng)物進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，雌雄分飼，由專人飼養(yǎng)管理，動(dòng)物室按常規(guī)定期消毒。

2方法

21色譜條件

Agilent Eclipse Plus C18 RRHD色譜柱（21 mm×100 mm，18 μm）；流動(dòng)相01%甲酸水（A）01%甲酸乙腈（B），梯度洗脫，0～10 min，95%～55%A，10～14 min，55%～5% A，14～15 min，5%～0%A，15～16 min，0%～95%A；柱溫45 ℃；流速03 mL·min-1，進(jìn)樣量2 μL。

22質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），掃描方式為負(fù)離子模式（ESI-，m/z 50～1 000）；毛細(xì)管電壓3 kV，錐孔電壓80 V；離子源溫度110 ℃，霧化氣溫度200 ℃，霧化氣（N2）壓力 12 bar，流速80 L·min-1；脫溶劑氣溫度300 ℃，霧化氣（N2）體積流量50 L·h-1，脫溶劑氣體積流量550 L·h-1。準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定采用甲酸鈉校正標(biāo)準(zhǔn)液，校正模式選用Enhanced Quadratic。數(shù)據(jù)分析：Data Analysis軟件，Metabolite ToolsTM 軟件（包括Metabolite Predict及Metabolite Detect），質(zhì)量虧損過(guò)濾（MDF）。

23厭氧培養(yǎng)液的制備[7]

A液375 mL（078% K2HPO4），B液375 mL[047% KH2PO4，118% NaCl，12% （NH4）2SO4，012% CaCl2，025% MgSO4·H2O]，C液50 mL 8% Na2CO3。05 g L半胱氨酸，2 mL 25% L抗壞血酸，1 g牛肉膏，1 g蛋白胨，1 g營(yíng)養(yǎng)瓊脂，加蒸餾水至1 L，鹽酸調(diào)pH 75～80。

24大鼠腸道菌液的制備[8]

將健康大鼠斷頸處死后，迅速開腹取其大腸段糞便，將新鮮糞便與生理鹽水按1∶4混合制成混懸液，5 000 r·min-1離心5 min，上清液即為大鼠腸道菌液。

25樣品的制備

251腸菌培養(yǎng)液取新鮮配制的腸道菌液2 mL于培養(yǎng)皿中，加入?yún)捬跖囵B(yǎng)液18 mL（已滅菌），混合均勻，即得20 mL腸菌培養(yǎng)液。將此腸菌培養(yǎng)液置于厭氧培養(yǎng)罐中，加入1個(gè)厭氧產(chǎn)氣袋后，迅速蓋上培養(yǎng)罐蓋以保證培養(yǎng)環(huán)境厭氧[910]，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使腸菌培養(yǎng)液中的腸道菌充分成長(zhǎng)。

252試驗(yàn)分組24 h后取出培養(yǎng)皿，將上述腸菌培養(yǎng)液平均分為2份，每份10 mL。實(shí)驗(yàn)分為3組，將槲皮苷加入10 mL腸菌培養(yǎng)液中得給藥組，10 mL腸菌培養(yǎng)液（不含槲皮苷）為空白組，將槲皮苷加入10 mL厭氧培養(yǎng)液（不含腸菌）為對(duì)照組。每個(gè)樣品平行操作3次。將上述培養(yǎng)皿迅速放入?yún)捬跖囵B(yǎng)罐中，放入1個(gè)厭氧產(chǎn)氣袋，以保證培養(yǎng)環(huán)境厭氧[910]，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。所用器具均經(jīng)高壓蒸汽121 ℃滅菌20 min。

26樣品處理方法

將25項(xiàng)下培養(yǎng)得到的樣品分別轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，每管中加入乙酸乙酯10 mL，渦混震搖3 min，提取3次，合并萃取液，5 000 r·min-1離心5 min，取上清液，在37 ℃下N2吹干，殘?jiān)? mL乙酸乙酯溶解后37 ℃下N2吹干，殘?jiān)?00 μL 50%甲醇溶解，15 000 r·min-1離心5 min，上清液UPLCQTOFMS/MS進(jìn)樣分析。

3結(jié)果

31代謝產(chǎn)物分析

在26項(xiàng)下，運(yùn)用Metabolite Tools軟件中的Metabolite Predict對(duì)槲皮苷進(jìn)行代謝產(chǎn)物預(yù)測(cè)，將生成的代謝產(chǎn)物MassList導(dǎo)入Metabolite Detect中得到槲皮苷大鼠腸道菌孵育樣品、大鼠空白腸道菌孵育樣品、槲皮苷厭氧培養(yǎng)液孵育樣品等的圖譜及差異圖譜，結(jié)果見(jiàn)圖1。

覃小麗等：UPLCESIQTOFMS/MS分析槲皮苷在大鼠腸道菌群中的代謝

32化合物鑒定

由Metabolite Detect軟件對(duì)樣品及空白圖譜處理后得到的差異圖譜可知，在大鼠腸道菌孵育樣品中找到9種化合物，即M0（m/z 447094 3），M1（m/z 317030 5），M2（m/z 303054 3），M3（m/z 305068 6），M4（m/z 431105 1），M5（m/z 489106 3），M6（m/z 489106 3），M7（m/z 301038 1），M8（m/z 301038 1），見(jiàn)表1。

321M0tR 61 min色譜峰的準(zhǔn)分子離子為m/z 447094 3[M-H]-，主要碎片離子峰為m/z 301037 9 [M-H-C6H10O4]-，與槲皮苷對(duì)照品相同，由此確定化合物M0為原型成分槲皮苷。

322M1tR 45 min色譜峰的準(zhǔn)分子離子為m/z 317030 5[M-H]-，由Smart Formula預(yù)測(cè)其化學(xué)式為C15H9O8，與原型化合物m/z 447094 3[M-H]-相比減少了130，為失去1個(gè)鼠李糖基生成槲皮素的衍生物，且其保留時(shí)間較槲皮素縮短，親水性增加，可能是槲皮素再羥化的結(jié)果，故推測(cè)M1為槲皮素的羥基化代謝產(chǎn)物，但本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)并不能說(shuō)明具體羥化位置，有待進(jìn)一步研究。

323M2tR 56 min色譜峰的準(zhǔn)分子離子為m/z 303054 3[M-H]-，主要碎片離子峰為m/z 285[M-H-H2O]-，與花旗松素對(duì)照品相同，確定tR 56 min的M2為槲皮素C2C3雙鍵加氫還原產(chǎn)物，即花旗松素。

324M3由Metabolite Detect軟件對(duì)樣品及空白圖譜處理后得到的差異圖譜中可知，tR 58 min色譜峰的準(zhǔn)分子離子為m/z 305068 6[M-H]-，m/z 183031 0 [M-H-C7H6O2]-，125024 9[M-H-C7H6O2-COO-CH2]-為主要碎片離子峰，由此推測(cè)tR 58 min的M3為苷元C2C3雙鍵加氫還原后OC2鍵開環(huán)產(chǎn)物。

325M4由Metabolite Detect軟件對(duì)樣品及空白圖譜處理后得到的差異圖譜可知，tR 68 min色譜峰的準(zhǔn)分子離子為m/z 431101 5[M-H]-，由Smart Formula預(yù)測(cè)其化學(xué)式為C21H19O10，且其保留時(shí)間較槲皮苷延長(zhǎng)，疏水性增加，由此推測(cè)tR 68 min的M4為槲皮苷脫羥基產(chǎn)物。

326M5和M6由Metabolite Detect軟件對(duì)樣品及空白圖譜處理后得到的差異圖譜可知，tR 72，76 min色譜峰的準(zhǔn)分子離子皆為m/z 489106 3[M-H]-，主要碎片離子峰為m/z 447094 7[M-H-C2H2O]-，301145 1[M-H-C2H2O-C6H10O4]-，由此推測(cè)tR 72，76 min的M5，M6為槲皮苷乙酰化代謝產(chǎn)物，具體的乙酰化位置有待進(jìn)一步研究。

327M7tR 80 min色譜峰的準(zhǔn)分子離子為m/z 301038 1[M-H]-，與M0相比減少了146，與槲皮素對(duì)照品相同，由此確定tR 80 min的M7為槲皮苷脫糖基后的苷元，即槲皮素。

328M8tR 92 min色譜峰的準(zhǔn)分子離子為m/z 285043 1[M-H]-，與M7相比減少了16，與山柰酚對(duì)照品相同，確定tR 92 min的M8為槲皮素3′脫氧代謝產(chǎn)物，即山柰酚。

33槲皮苷代謝產(chǎn)物及其可能的代謝途徑

根據(jù)上述分析，推測(cè)槲皮苷代謝產(chǎn)物及其可能的代謝途徑見(jiàn)圖2。

4討論

槲皮苷屬于中藥黃酮糖苷類。過(guò)去一直認(rèn)為黃酮類物質(zhì)槲皮苷及其衍生物很少被吸收，但近幾年有關(guān)研究顯示，槲皮苷及其衍生物進(jìn)入機(jī)體后，有一部分通過(guò)被動(dòng)吸收和主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)而被機(jī)體吸收利用[11]，但是槲皮苷在體內(nèi)并不是完全以原型成分吸

收入血，而是在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化器和酶系的多樣性作用下，受到大量的腸道菌群作用，影響其代謝轉(zhuǎn)化和機(jī)體的吸收利用[1213]。

傳統(tǒng)中藥的使用大多數(shù)是通過(guò)口服吸收而發(fā)揮作用，藥物在生物體內(nèi)作用不可避免與腸道菌群接觸。腸道是一個(gè)龐大而富有活力的細(xì)菌菌群棲息地，人和動(dòng)物腸內(nèi)菌叢數(shù)量和種類繁多，且99%是厭氧性細(xì)菌，其中以擬桿菌族、鏈狀細(xì)菌、消化鏈球菌、螺菌屬等專性厭氧菌和乳酸菌及雙歧桿菌占優(yōu)勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)在人腸內(nèi)細(xì)菌中的梭桿菌K60能夠使槲皮苷的糖苷鍵斷裂生成槲皮素，擬桿菌JY6和雙歧桿菌B9能夠使槲皮苷的B環(huán)開裂[14]。人體的腸道菌群分布特征與大鼠比較相似，并且本課題前期研究槲皮苷在人腸道菌群中的代謝情況也是主要以脫糖基反應(yīng)為主。因此，槲皮苷的糖苷鍵斷裂生成槲皮素可能與大鼠腸內(nèi)細(xì)菌中的梭桿菌K60有關(guān)，確認(rèn)有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)采用體外大鼠腸道菌群孵育法，能在較短時(shí)間內(nèi)得到大量的代謝產(chǎn)物，比較方便解決一些復(fù)雜藥物代謝研究的問(wèn)題，代謝環(huán)境易于控制，代謝體系比較純凈，在代謝物結(jié)構(gòu)鑒定方面具有較大的優(yōu)勢(shì)[15]。通過(guò)UPLCQTOFMS/MS聯(lián)用技術(shù)，運(yùn)用Metabolite Predict，Metabolite Detect對(duì)樣品中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)測(cè)并檢測(cè)分析，結(jié)合Mass Defect Filter技術(shù)進(jìn)一步有效提取代謝產(chǎn)物信息，排除基質(zhì)背景干擾，并應(yīng)用Data Analysis中Smart Formula功能推測(cè)代謝產(chǎn)物化學(xué)式。結(jié)果表明槲皮苷在大鼠腸道菌群中主要以脫糖基反應(yīng)為主，苷元槲皮素進(jìn)一步發(fā)生羥基化、脫氧、還原、開環(huán)一系列反應(yīng)，更容易吸收入血，提高藥效。研究中藥腸道代謝可以增加人們對(duì)中藥復(fù)雜成分在體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化途徑的理解，為闡明中藥復(fù)方相互作用規(guī)律、中藥現(xiàn)代制劑的開發(fā)以及為中藥及其復(fù)方制劑藥效物質(zhì)闡明奠定基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯曹陽(yáng)陽(yáng)]

[收稿日期]20160830

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81260688）；貴州省研究生卓越人才計(jì)劃項(xiàng)目（黔教研合ZYRC字[2014]012）；現(xiàn)代藥物研究開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目（黔教合協(xié)同創(chuàng)新字[2013]04）；民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用產(chǎn)學(xué)研基地建設(shè)項(xiàng)目（黔科合KY字[2013]122）；貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)對(duì)象專項(xiàng)（黔科合人字（2015）11號(hào)）

[通信作者]*黃勇，博士，教授，主要從事中藥活性物質(zhì)基礎(chǔ)及藥動(dòng)學(xué)研究與藥物新劑型、新技術(shù)研究，Tel：（0851）86908468，Email：mailofhy@126com

[作者簡(jiǎn)介]覃小麗，碩士研究生，主要從事活性物質(zhì)基礎(chǔ)與藥物新劑型研究， Email：2806247283@qqcom