兩株灰黃霉素產(chǎn)生菌的18S rDNA和ITS序列測定與分析

陸嬌嬌 暢瑛 李波 施碧紅

摘?要：灰黃霉素產(chǎn)生菌原始菌株4541和突變株D-756在形態(tài)與生理生化上具有很大差異。為了解兩菌株的遺傳背景差異，明確其系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，該研究分別克隆并測定了突變株D-756與出發(fā)菌株4541的ITS和18S rDNA基因序列，進行同源性分析并分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由ITS序列構(gòu)建的進化樹顯示，突變株D-756及野生株4541與Genebank中的另外3株灰黃青霉、1株蕁麻青霉菌株聚為一簇;由18S rDNA序列構(gòu)建的進化樹中突變株D-756、出發(fā)菌株4541與Genebank中的3株灰黃青霉菌株也聚為一支。研究結(jié)果表明，在分子水平上出發(fā)菌株4541及其突變株D-756屬于灰黃青霉種。

關(guān)鍵詞：灰黃青霉;ITS序列;18S rDNA;系統(tǒng)發(fā)育樹

中圖分類號：Q754?文獻標志碼：A?文章編號：0253-2301（2019）10-002

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.10.002

Abstract： There were significant differences in morphology， physiology and biochemistry between the original strain 4541 and the mutant strain D-756 of griseofulvin producing strains. In order to understand the genetic background differences between the two strains and make clear their phylogenetic relationships， the ITS and 18S rDNA gene sequences of the mutant strain D-756 and the original strain 4541 were cloned and determined in this study. Then， the homology analysis was conducted and the phylogenetic trees were constructed respectively. The evolutionary tree constructed from the ITS sequence showed that the mutant strain D-756 and the wild strain 4541 were clustered together with the other 3 strains of Penicillium griseofulvum and 1 strain of Penicillium urticae in Genebank. The mutant strain D-756 and the original strain 4541 in the evolutionary tree constructed by 18S rDNA sequence were also clustered with the other 3 strains of Penicillium griseofulvum in Genbank into one branch. The results showed that the original strain 4541 and the mutant strain D-756 belonged to penicillium griseofulvum at the molecular level.

Key words： Penicillium griseofulvum; ITS sequence; 18S rDNA; Phylogenetic tree

灰黃霉素是一種有效的聚酮類抗真菌抗生素，可用于治療皮膚癬菌引起的淺層真菌感染，在農(nóng)業(yè)上也用于防治多種植物病原菌，灰黃霉素還能在體外抑制肝炎病毒的復制[1-2]。近年來發(fā)現(xiàn)灰黃霉素可抑制癌細胞中心體聚集，從而形成多級紡錘體，導致癌細胞分裂抑制而死亡[3]。鑒于灰黃霉素的醫(yī)用和農(nóng)用價值，人們對灰黃霉素高產(chǎn)菌株的選育工作一直持續(xù)進行。本研究采用的D-756是吳松剛等[1]用野生菌展青霉Penicillium patulum 4541經(jīng)13輪復合誘變獲得的灰黃霉素高產(chǎn)突變株。突變株D-756與出發(fā)野生菌株4541相比，孢子形態(tài)由野生菌的綠色變?yōu)榘咨尹S霉素的合成能力也大幅提高[4-5]。但目前就兩者的遺傳背景差異知之甚少，明確誘變系譜中菌株的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系是進行后續(xù)遺傳研究的基礎。

傳統(tǒng)的真菌分類主要以形態(tài)學觀察結(jié)合生理生化特征分析為主，但真菌的種類繁多復雜，種屬間的形態(tài)學差異不明顯，生理生化性狀也會發(fā)生交叉重疊，且容易因溫度、濕度、土壤等生活環(huán)境的改變而變得不穩(wěn)定，因此傳統(tǒng)的方法進行種屬間鑒定時有出現(xiàn)同名異物或異物同名的情況[6]。隨著真菌分類學的發(fā)展，一些影響較大或在早期的文獻中普遍的種名，因種的概念的變化，現(xiàn)已成為其他種的異名，如展青霉Penicillium patulum、蕁麻青霉Penicillium urticae現(xiàn)均是灰黃青霉Penicillium griseofulvum Dierckx的異名[6]。在關(guān)于灰黃霉素早期的研究報道中，有不少來自展青霉或蕁麻青霉的報道，包括本研究的菌株D-756和4541也存有這種情況[1，4-5]?，F(xiàn)代分子鑒定技術(shù)為傳統(tǒng)真菌分類方法提供了有力補充。ITS和18S r DNA分子鑒定具有快速、準確、微量、方便的優(yōu)點，能夠從分子水平為真菌的分類、鑒定提供重要依據(jù)和豐富的遺傳信息，已廣泛用于真菌屬種間的系統(tǒng)學研究[7]。本研究利用2對真菌通用引物ITS-1、ITS-4和S1、S2分別擴增了突變株D-756及其野生出發(fā)菌株4541的ITS和18S rDNA序列，并進行測序分析，測得的序列提交GenBank，并分別基于ITS和18S rDNA序列進行GenBank數(shù)據(jù)庫同源性檢索比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，以了解兩株灰黃霉素產(chǎn)生菌的親緣關(guān)系，為進一步明確其歸屬、確認這兩株菌的分類地位以及為后續(xù)的遺傳研究提供信息數(shù)據(jù)。

1?材料與方法

1.1?菌株來源

灰黃霉素產(chǎn)生菌原始菌株4541和突變株D-756由福建師范大學吳松剛教授提供;大腸桿菌JM109為本實驗室保存。

1.2?主要試劑藥品

LA Taq DNA聚合酶、Ex Taq DNA 聚合酶、SolutionI連接酶、pMD18-T Vector購于TaKaRa公司;Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、氨芐青霉素購于生工生物工程技術(shù)服務（上海）有限公司;真菌ITS基因通用引物ITS1和ITS4及18S rDNA通用引物由生工生物工程技術(shù)服務（上海）有限公司合成。

1.3?主要培養(yǎng)基

察氏培養(yǎng)基：蔗糖30 g·L-1、氯化鉀0.5 g·L-1、硝酸鈉3 g·L-1、磷酸二氫鉀1 g·L-1、硫酸亞鐵0.01 g·L-1、硫酸鎂0.5 g·L-1、瓊脂20 g·L-1。LB液體培養(yǎng)基（LB固體培養(yǎng)基加入1.5%瓊脂）：胰蛋白胨 10 g·L-1、酵母粉5 g·L-1、NaCl 10 g·L-1，pH 7.2。種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基參照文獻[4]。

1.4?引物設計

1.4.1?真菌ITS通用引物?真菌ITS通用引物設計如下：

ITS-1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;

ITS-4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

1.4.2?18S rDNA通用引物?18S rDNA通用引物設計如下：

S1：5′-CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3′;

S2：5′-CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT-3′。

1.5?試驗方法

1.5.1?兩菌株灰黃霉素合成能力的比較?突變株D-756和原始出發(fā)株4541經(jīng)過14 d搖瓶發(fā)酵后，采用比色法分別測定兩株菌發(fā)酵液的灰黃霉素效價[8]。

1.5.2?基因組DNA提取?分別收集突變株D-756和出發(fā)菌株4541的菌體，用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取總DNA。

1.5.3?ITS和18S rDNA片段的PCR擴增?分別以提取的菌株D-756和4541的基因組DNA為模板，采用真菌ITS的通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增。PCR擴增體系（50 μL）為：10×Ex PCR buffer 5 μL、dNTP Mix （2.5 mmol·L-1） 4 μL、引物ITS1 2 μL、引物ITS4 2 μL、模板DNA 1 μL、Ex Taq 酶0.5 μL、ddH2O 35.5 μL。PCR條件：95℃預變性5 min，94℃變性40 s，55℃退火35 s，72℃延伸45 s，進行30次循環(huán)后，72℃延伸10 min，4℃保存。

以基因組DNA為模板，采用真菌18S rDNA的通用引物S1和S2進行PCR擴增。PCR擴增體系（50 μL）為：10×LA PCR buffer 5 μL、dNTP Mix （2.5 mmol·L-1） 4 μL、S1上游引物2 μL、S2下游引物2 μL、模板DNA 1 μL、LA Taq 酶0.5 μL，ddH2O 35.5 μL。PCR條件：95℃預變性5 min，94℃變性40 s，55℃退火35 s，72℃延伸2 min，進行30次循環(huán)后， 72℃延伸10 min，4℃保存。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，用DNA膠回收試劑盒回收目的產(chǎn)物。

1.5.4?ITS、18S rDNA序列的測定?將上述膠回收純化的PCR產(chǎn)物與載體pMD 18-T連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，菌落PCR鑒定陽性克隆。PCR體系（20 μL）：10×LA PCR buffer 2 μL、dNTP Mix （2.5 mmol·L-1） 1.6 μL、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、LA Taq 酶0.2 μL、ddH2O 14.6 μL。挑取陽性克隆過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)液用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒DNA送至生工生物工程技術(shù)服務（上海）有限公司測序。

1.5.5?系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建?測序獲得的結(jié)果提交Genbank獲取登錄號，并在NCBI中進行blast檢索同源序列，選取相似度高的序列，用Clustal X（1.83）軟件進行多序列比對后，采用MEGA 6.0軟件以鄰近相接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，自展數(shù)為1000。

2?結(jié)果與分析

2.1?D-756和4541的灰黃霉素效價

突變株D-756是由野生出發(fā)菌株4541經(jīng)13輪誘變育種篩選出的灰黃霉素高產(chǎn)突變株，兩者除菌落形態(tài)上由野生型的灰綠色變成突變型的白色外[1]，其灰黃霉素的合成能力也有了大幅度的提高。分別將菌株

D-756和4541進行搖瓶發(fā)酵14 d，用比色法測定灰黃霉素效價，參照標準曲線（圖1），獲得D-756和4541的灰黃霉素平均效價分別為13788 U·mL-1和180 U·mL-1，突變株D-756的灰黃霉素效價是出發(fā)菌株的76倍。

2.2?ITS基因序列片段的PCR擴增

不同真菌的ITS長度不一樣，一般在500～800 bp[9]。以提取的基因組DNA為模板PCR擴增的ITS片段如圖2所示，目的條帶的位置大約在550 bp處，與預期相符且條帶明亮清晰無雜帶。

2.3?18S rDNA基因序列片段的PCR擴增

真菌的18S rDNA基因大小約為1.8 kb[10]，由PCR擴增的18S rDNA片段如圖3所示，目的條帶的位置約在1710 bp處，大小符合預期，且條帶明亮清晰，可用來構(gòu)建重組質(zhì)粒。

2.4?ITS及18S rDNA序列的測定

將上述ITS及18S rDNA的PCR產(chǎn)物純化后，克隆到pMD18-T載體后測序。出發(fā)菌4541和突變株D-756的ITS序列均為545 bp（登錄號：MK843252、MN046363）。經(jīng)Bioedit軟件序列比對，發(fā)現(xiàn)兩者的ITS序列完全相同，這說明突變株D-756雖然是4541經(jīng)13輪復合誘變而來，但其ITS區(qū)域高度保守;菌株4541和D-756的18S rDNA序列長度分別為1711 bp（登錄號：MN044711）和1710 bp（登錄號：MK841479），序列比對結(jié)果表明，兩菌株的18S rDNA序列9個堿基位點差異，說明4541經(jīng)過13輪誘變處理，其18S rDNA序列有少數(shù)位點發(fā)生突變，但兩者的序列相似性仍大于99%。

2.5?ITS序列和18S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

基于ITS序列的檢索分析，選取同源性較高的包括青霉屬、曲霉屬、新薩托菌屬等屬的20條序列（相似性在90.51%～100.00%），并以1株Monascus eremophilus為外類群，由MEGA 6.0構(gòu)建ITS系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），圖4結(jié)果顯示菌株4541和D-756與Genbank中的另外3株灰黃青霉菌株P(guān).griseofulvum（AF034452.1、NR103692.1、GU566212.1）及1株蕁麻青霉P.urticae（AF514301）聚為一簇，并且與這些序列的相似性均≥99%。Landeweert[11]等提出ITS鑒定原則，供試菌株的ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列檢索比對，序列相似性≥99%，可以鑒定為相同種。

基于18S rDNA序列檢索分析，選取了同源性較高的19條序列（相似性在96.49%～99.76%）（包括青霉屬、曲霉屬、副球孢子菌屬等），以1株P(guān)aracoccidioides brasiliensis為外類群，構(gòu)建18S rDNA進化樹（圖5），結(jié)果表明菌株4541和D-756與Genbank中的另外3株灰黃青霉菌株（JN886804.1、EF607282.1、JN886803.1）聚為一簇，其序列間相似性均≥99%。由圖4～5可以看出，出發(fā)菌株4541和突變菌株D-756與Genebank中的灰黃青霉其他菌株均聚為一簇，說明他們屬于灰黃青霉種。

3?結(jié)論與討論

微生物分類方法有很多種，依據(jù)的分類標準也有所不同，真菌的分類主要依靠營養(yǎng)體以及子實體的形態(tài)特征來判斷，但是這兩個特征很容易受環(huán)境的影響發(fā)生改變[12]。并且，隨著越來越多的真菌種類被人們發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的形態(tài)學分類方法已經(jīng)不能精確地進行種屬分類鑒定。如今，分子生物學的飛速發(fā)展，可以在分子水平上確定物種的分類和進化關(guān)系，是對傳統(tǒng)微生物分類方法的有力補充。ITS區(qū)域是真菌非編碼區(qū)，包括ITS1和ITS2兩部分，承受的選擇壓力較小，具有較豐富的位點變異信息。18S rDNA是真核生物的核糖體小亞基RNA的編碼DNA，在進化上十分保守。18S rDNA和ITS都可以作為真菌種屬鑒定的分子標記，目前在國內(nèi)外應用廣泛。

灰黃青霉P.griseofulvum 4541（早期文獻為展青霉P.patulum 4541）及其誘變獲得的高產(chǎn)突變株D-756在形態(tài)上有顯著差異，出發(fā)菌株4541的孢子呈灰綠色，突變株D-756的孢子為白色[1，5]。此外突變菌株D-756較出發(fā)菌株4541而言，灰黃霉素的產(chǎn)量大幅提升（提高76倍）。為探究兩菌株的分子水平差異，本研究分別克隆并測定了菌株4541和D-756的ITS及18S rDNA序列，結(jié)果顯示兩者的ITS序列完全相同，其18S rDNA序列相似性亦大于99%。

將菌株4541和D-756的ITS及18S rDNA序列分別與GenBank數(shù)據(jù)庫中的同源性較高的相應序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)菌株4541和D-756均與GenBank中其他灰黃青霉P.griseofulvum及蕁麻青霉P.urticae聚為一簇，且它們之間的序列相似性大于99%，說明菌株4541和D-756都屬于灰黃青霉種，在分子水平上進一步確定了原始菌株4541及其突變株D-756的分類地位以及它們之間進化關(guān)系。該結(jié)果也論證了國內(nèi)外將早期報道的展青霉P.patulum、蕁麻青霉P.uritcae歸入灰黃青霉Penicillium griseofulvum異名的事實[7，2，13]。同時結(jié)果也表明，突變株D-756與原始菌株4541表型差異較大，可能是由于菌株在多代的誘變過程中為了適應生存，相關(guān)基因發(fā)生了改變，但確實是由原始菌株突變而來，不存在菌種污染，為后續(xù)全面的分子遺傳研究儲備信息數(shù)據(jù)。

在青霉屬真菌的開發(fā)應用過程中，由于歷史的條件限制，常把青霉與非青霉弄混淆，加之不同的研究者常賦予同一個菌不同的名字，青霉屬真菌的命名有些混亂[6]?；尹S霉素原始產(chǎn)生菌株4541及其突變株

D-756在早期文獻為展青霉Penicillium patulum[1，4-5]，在《中國真菌志》中已將蕁麻青霉Penicillium urticae、展青霉Penicillium patulum歸為灰黃青霉Penicillium griseofulvum的異名[6]。本研究結(jié)果與《中國真菌志》中的有關(guān)灰黃青霉分類闡述一致。研究結(jié)果也表明了基于ITS和18S rDNA序列的分子鑒定可以快速有效地進行種屬鑒定，是傳統(tǒng)真菌分類方法的有效補充。

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（責任編輯：林玲娜）