天麻硫熏標(biāo)志物和硫熏藥材水提物的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

康傳志 呂朝耕 王紅陽(yáng) 王升 王鐵霖 孫嘉惠 萬(wàn)修福 周利 郭蘭萍

摘要 目的：評(píng)價(jià)確證天麻硫熏標(biāo)志物（p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite）和硫熏天麻水提物的細(xì)胞毒性。方法：采用CCK-8試驗(yàn)方法，考察天麻硫熏標(biāo)志物和水提物不同劑量下人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞、人正常肝細(xì)胞和大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，計(jì)算相應(yīng)的細(xì)胞活力，并根據(jù)相對(duì)增殖率進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)。結(jié)果：硫熏標(biāo)志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite對(duì)于人體2種細(xì)胞的生長(zhǎng)均表現(xiàn)出良好的促進(jìn)作用，且參照《美國(guó)藥典》的毒性分級(jí)法，得出該標(biāo)志物對(duì)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞的安全劑量范圍為0～1 000 μmol/L。另外發(fā)現(xiàn)，硫熏天麻水提物對(duì)人體正常細(xì)胞的細(xì)胞活力影響不大，與硫熏前的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），并得出該標(biāo)志物對(duì)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞的安全劑量范圍為0～2.5 μg/mL。結(jié)論：在正常的濃度范圍內(nèi)，硫熏標(biāo)志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite和硫熏天麻提取物均無細(xì)胞毒性，對(duì)細(xì)胞活力的影響不大。

關(guān)鍵詞 天麻;硫熏標(biāo)志物;p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite;水提物;細(xì)胞毒性

Cytotoxicity Evaluation of Sulfur Fumigation Gastrodia Rhizoma Markers and Water Extracts

Kang Chuanzhi，Lyu Chaogeng，Wang Sheng，Wang Tielin，Sun Jiahui，Wang Hongyang，Zhou Li，Guo Lanping

（State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs，National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China）

Abstract Objective：To evaluate the cytotoxicity of the water extract and p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite in sulfur-fumigated Gastrodia Rhizoma.Methods：The CCK-8 test method was used to investigate the growth of human renal cortical proximal tubular epithelial cells，human normal hepatocytes and rat adrenal pheochromocytoma cells at different doses of sulfur-fumigated markers and water extracts for Gastrodia Rhizoma.And the vitality and cytotoxicity ratings based on relative proliferation rates was also evaluated.Results：The p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite had a good promoting effect on the growth of both human cells，and the toxicity of the United States Pharmacopoeia was used to obtain the marker for rat adrenal pheochromocytoma cells.The safe dose range was from 0 to 1000 μmol/L.In addition，it was found that the water extract of sulfur-fumigated Gastrodia Rhizoma had little effect on the cell viability of normal human cells，and there was no significant difference（P>0.05）before and after of sulfur-fumigating Gastrodia Rhizoma，and the safe dose range of the marker on rat adrenal pheochromocytoma cells was 0～2.5 μg/mL.Conclusion：In the normal concentration range，the p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite and water extract of sulfur-fumigated Gastrodia Rhizoma were not cytotoxic，and had little effect on cell viability.

Key Words Gastrodia Rhizoma; Chemical markers of sulfur fumigation; p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite; Water extract; Cytotoxicity

中圖分類號(hào)：R282.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.004

硫磺熏蒸（以下簡(jiǎn)稱“硫熏”）加工方法作為傳統(tǒng)的中藥材養(yǎng)護(hù)方法，具有快速干燥、漂白、防霉、防蟲和延長(zhǎng)貯藏期等作用，已廣泛應(yīng)用到中藥材的初加工和倉(cāng)儲(chǔ)等環(huán)節(jié)[1-3]。當(dāng)前中藥材硫熏濫用現(xiàn)象極為普遍，尤其是在產(chǎn)地加工和貯藏保管等環(huán)節(jié)。但大量研究已證實(shí)硫熏不僅會(huì)影響藥材質(zhì)量，殘留過量的二氧化硫還會(huì)危害人體健康，尤其是藥材進(jìn)入人體后，對(duì)肝和腎臟等重要代謝器官的影響較大[4-9]。課題組前期在對(duì)硫熏天麻質(zhì)量評(píng)價(jià)的研究中發(fā)現(xiàn)并獲得了硫熏標(biāo)志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite（p-HS），作為評(píng)價(jià)天麻硫熏質(zhì)量控制的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[10-11]，但對(duì)該硫熏標(biāo)志物的安全性問題還不得而知。另外，大部分中藥材的服用方式以煎煮為主，因此對(duì)硫熏天麻藥材煎煮后的提取物進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)也是很有必要的。

因此，本研究選取了人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞（HK-2）人正常肝細(xì)胞（L-02）和大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC-12）作為研究評(píng)價(jià)對(duì)象，考察了p-HS標(biāo)志物和硫熏天麻水提物不同劑量對(duì)人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞（HK-2）、人正常肝細(xì)胞（L-02）和大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC-12）的影響，觀察各劑量下HK-2細(xì)胞、L-02細(xì)胞和PC-12細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，并根據(jù)PC-12細(xì)胞相對(duì)增殖率（Relative Growth Rate，RGR）對(duì)硫熏產(chǎn)物p-HS和硫熏藥材提取物進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)，為中藥材硫磺熏蒸安全性評(píng)價(jià)提供參考，也為中藥材二氧化硫限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（HERAEUS公司，德國(guó)，型號(hào)：BB16）;倒置顯微鏡（Olympus公司，日本，型號(hào)：XSZ-D）;全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（thermo公司，芬蘭，型號(hào)：Multiskan Go-1510）;超低溫冰箱（三洋公司，日本，型號(hào)：MDF-U5412）;96孔培養(yǎng)板（Corning公司，美國(guó)，型號(hào)：Corning3599）;臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào)：TGL-16C）;電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司，型號(hào)：AL104）;電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司，型號(hào)：DK-98-ⅡA）。

1.2 試劑 CCK-8試劑（碧云天公司，中國(guó)，批號(hào)：C0038）;DMEM（Gibco BRL公司，美國(guó)，批號(hào)：12400024）;新生牛血清（杭州四季青生物工程有限公司，批號(hào)：22011-8615）;胰蛋白酶（Amresco公司，美國(guó)，批號(hào)：0785-5G）;二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司，美國(guó)，批號(hào)：D4540-1L）;注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號(hào)：H13020657）;注射用硫酸鏈霉素（大連美羅藥廠，批號(hào)：H21021674）;PBS（Amresco公司，美國(guó)，批號(hào)：DZ0231）。

1.3 分析樣品 天麻新鮮樣品于2017年11月采自貴州省大方縣的烏天麻，經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心郭蘭萍研究員鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia elata Bl.的新鮮塊莖，樣本存放于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心。天麻硫熏標(biāo)志物p-HS由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心分離制備獲得[10]。人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞（HK-2，編號(hào)：BNCC338012）;人正常肝細(xì)胞（L-02，編號(hào)：BNCC100012）;大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC-12，編號(hào)：BNCC 337663），以上3種細(xì)胞購(gòu)于上海宸功生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 天麻藥材硫熏處理方法 取新鮮的天麻樣品適量，洗凈晾干表面的水分，切成薄片后，分成2組，一組為空白對(duì)照組，另外一組按照硫磺與藥材用量比1∶40，硫熏1 h的硫熏工藝進(jìn)行硫熏處理。取出后置于50 ℃烘干，放置于4 ℃保存，備用。

2.2 天麻水提物和p-HS標(biāo)志物母液制備 天麻p-HS標(biāo)志物母液配制：取p-HS 1.88 mg（即0.01 mmol）溶于含有1‰ DMSO的10 mL培養(yǎng)液，混勻后于4 ℃冰箱中保存。天麻水提物：分別取硫熏前后的干燥天麻藥材100 g，先浸泡30 min，取出后進(jìn)行煎煮，分2次進(jìn)行，第1次加10倍量的水，煎煮40 min，第2次加6倍量水，煎煮20 min，濾過，合并濾液，室內(nèi)減壓回收溶劑或凍干得到4份待測(cè)樣品。其中，天麻（TM）、硫熏天麻（TM-S）水提物的質(zhì)量分別為20.84 g和17.09 g。根據(jù)水提物和藥材質(zhì)量比值，計(jì)算得到2份樣品的提取率分別為20.32%和16.99%。

2.3 樣品劑量設(shè)置 天麻p-HS標(biāo)志物：根據(jù)細(xì)胞抑制率情況以r=10，設(shè)置5個(gè)濃度梯度，分別為0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L和1 000 μmol/L，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及狀態(tài)。天麻提取液：根據(jù)HK-2和L-02細(xì)胞抑制率情況，設(shè)置5個(gè)濃度梯度，分別為1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL、1 000 μg/mL、2 000 μg/mL，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及狀態(tài)。根據(jù)PC-12細(xì)胞的抑制率情況，將濃度梯度設(shè)置為0.1 μg/mL，0.5 μg/mL，2.5 μg/mL，12.5 μg/mL，62.5 μg/mL。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)方法 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.5 CCK-8試驗(yàn)方法 分別將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2、L-02和PC-12細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，制成細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μL，邊緣孔用無菌PBS填充。置5% CO2，37 ℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的p-HS，設(shè)置6個(gè)濃度梯度，同時(shí)設(shè)置不加藥的陰性平行對(duì)照組。每孔100 μL，設(shè)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后避光加入CCK-8溶液10 μL，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450 nm處測(cè)量各孔的吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力，并將處理組與對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2.6 細(xì)胞相對(duì)增殖率（RGR，%）及細(xì)胞抑制率（%）的計(jì)算 相對(duì)增殖率（RGR，%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度均值/對(duì)照組吸光度均值）×100%;細(xì)胞抑制率（%）=1-相對(duì)增殖率（%）。

2.7 細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)RGR值，參照《美國(guó)藥典》毒性分級(jí)法[12]評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：1）RGR值≥100%為0級(jí);2）75%≤RGR值<100%為Ⅰ級(jí);3）50%≤RGR值<75%為Ⅱ級(jí);4）25%≤RGR值<50%為Ⅲ級(jí);5）1%≤RGR值<25%為Ⅳ級(jí);6）0≤RGR值<1%為Ⅴ級(jí)。

3 結(jié)果

3.1 p-HS對(duì)HK-2、L-02和PC-12細(xì)胞活性的影響 給予人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞（HK-2）和人正常肝細(xì)胞（L-02）不同劑量的p-HS（0.1 μmol/L，1 μmol/L，10 μmol/L，100 μmol/L，1 000 μmol/L）處理后，均可不同程度的促進(jìn)HK-2和L-02細(xì)胞的生長(zhǎng)。結(jié)果見表1和圖1。

CCK-8法檢測(cè)HK-2和L-02細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖活性研究顯示：與正常對(duì)照組比較，p-HS藥物對(duì)HK-2和L-02細(xì)胞均具有不同程度的促進(jìn)作用，且隨劑量濃度的增加促進(jìn)作用加強(qiáng)，當(dāng)濃度為100 μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖率最高分別達(dá)到34.14%和32.04%。同時(shí)具有濃度依賴關(guān)系，但當(dāng)藥物濃度達(dá)到1 000 μmol/L時(shí)，p-HS對(duì)HK-2和L-02細(xì)胞的促進(jìn)作用隨即減弱。

給予大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC-12）不同劑量的p-HS均可不同程度的抑制PC-12細(xì)胞的生長(zhǎng)。CCK-8法檢測(cè)PC-12細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖活性研究顯示：與正常對(duì)照組比較，p-HS藥物對(duì)PC-12細(xì)胞均具有不同程度的毒性作用，且隨劑量濃度的增加抑制作用加強(qiáng)，具有濃度依賴關(guān)系。

3.2 p-HS對(duì)HK-2、L-02和PC-12細(xì)胞毒性等級(jí)評(píng)定 給予不同劑量的p-HS均可不同程度影響HK-2、L-02和PC-12細(xì)胞的增殖，本研究計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率對(duì)p-HS藥物進(jìn)行細(xì)胞毒性等級(jí)評(píng)定。一般來說，RGR>50%為合格，RGR<50%為不合格。

根據(jù)評(píng)定結(jié)果，以PC-12細(xì)胞為例。見圖1。在所有設(shè)置的濃度范圍內(nèi)，正常組的毒性等級(jí)為0級(jí)，0.1 μmol/L組和1 μmol/L組的細(xì)胞毒性等級(jí)為Ⅰ級(jí)，剩余3組的毒性等級(jí)為Ⅱ級(jí)。按照RGR>50%的標(biāo)準(zhǔn)，得到p-HS對(duì)PC-12細(xì)胞的安全劑量范圍為0～1 000 μmol/L。另外，按照上述評(píng)價(jià)方法，p-HS對(duì)HK-2和L-02細(xì)胞的安全劑量范圍同樣為0～1 000 μmol/L。綜上所述，在合理的使用范圍內(nèi)，p-HS化合物對(duì)HK-2、L-02和PC-12細(xì)胞的生長(zhǎng)是較為安全的。

3.3 天麻水提物對(duì)HK-2、L-02和PC-12細(xì)胞活性影響 分別給予HK-2、L-02和PC-12 3種細(xì)胞不同劑量的TM和TM-S樣品處理，結(jié)果得到2組樣品均可不同程度的抑制HK-2、L-02和PC-12細(xì)胞的生長(zhǎng)。與正常對(duì)照組比較，上述2組樣品對(duì)HK-2、L-02和PC-12均具有不同程度的抑制作用，且隨劑量濃度的增加抑制作用加強(qiáng)，具有濃度依賴關(guān)系。見圖2A、2C、2E。

比較硫熏前后天麻提取物的細(xì)胞活性發(fā)現(xiàn)，硫熏后的天麻藥材提取物對(duì)HK-2細(xì)胞的抑制率明顯低于硫熏前的，說明硫熏后的天麻藥材水提物在一定程度上更有利于HK-2細(xì)胞的生長(zhǎng)。對(duì)于L-02細(xì)胞來說，硫熏后的天麻不同劑量的提取物對(duì)L-02細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用高于硫熏前的樣品，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明硫熏前后的天麻藥材水提物在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)HK-2細(xì)胞的抑制作用基本一致。通過對(duì)HK-2和L-02細(xì)胞活性分析，發(fā)現(xiàn)硫熏后的天麻提取物對(duì)人體正常HK-2和L-02細(xì)胞生長(zhǎng)的影響雖然呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，但整體來看，硫熏處理對(duì)人體正常細(xì)胞的生長(zhǎng)影響不大。

另外，對(duì)PC-12細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖活性研究顯示，與正常對(duì)照組比較，2組樣品對(duì)PC-12均具有不同程度的抑制作用，且隨劑量濃度的增加促進(jìn)作用加強(qiáng)。而且，硫熏后的天麻提取物對(duì)非正常PC-12細(xì)胞的抑制作用減弱，與硫熏前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但還是表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。

3.4 天麻水提物對(duì)HK-2、L-02和PC-12細(xì)胞毒性分析 給予HK-2、L-02和PC-12細(xì)胞不同劑量的TM、TM-S、NX、NX-S樣品處理，發(fā)現(xiàn)2組樣品均可不同程度影響HK-2、L-02和PC-12細(xì)胞的增殖，且隨著濃度增加增殖作用減弱。計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率（GRG）對(duì)硫熏前后天麻提取物進(jìn)行細(xì)胞毒性等級(jí)評(píng)定。一般來說，RGR>50%認(rèn)為安全，即0級(jí)、Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)視為安全范圍。

對(duì)HK-2細(xì)胞來說（圖2B），TM組的細(xì)胞安全劑量范圍為0～100 μg/mL，TM-S組的安全劑量范圍為0～1 000 μg/mL，說明在相同濃度下，硫熏后的天麻水提物對(duì)HK-2細(xì)胞毒性更小，安全劑量范圍更寬。對(duì)L-02細(xì)胞來說（圖2D），TM組的細(xì)胞安全劑量范圍為0～1 000 μg/mL，TM-S組的安全劑量范圍均為0～100 μg/mL。但從1 000 μg/mL劑量組看，硫熏前后天麻水提物對(duì)L-02細(xì)胞毒性基本相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從PC-12細(xì)胞來看（圖2F），TM和TM-S2組的安全劑量范圍均為0～2.5 μg/mL，說明硫熏前后天麻藥材提取物對(duì)PC-12細(xì)胞增殖的影響相對(duì)一致。以上表明，硫熏天麻提取物對(duì)不同細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒性各有差異，既有促進(jìn)作用，又有抑制作用，但總體上硫熏前后藥材提取物對(duì)細(xì)胞毒性影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)論

4.1 明確了天麻硫熏標(biāo)志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite細(xì)胞毒性 課題組前期的研究中發(fā)現(xiàn)并分離得到了天麻硫熏標(biāo)志物p-HS，該成分可作為評(píng)價(jià)天麻硫熏與否的專屬性質(zhì)量控制指標(biāo)。為了明確該標(biāo)志物對(duì)人體是否具有細(xì)胞毒性，文章考察了不同劑量p-HS對(duì)人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞（HK-2）、人正常肝細(xì)胞（L-02）和大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC-12）的活力的影響。分析認(rèn)為當(dāng)濃度范圍在0～100 μmol/L時(shí)，p-HS對(duì)HK-2細(xì)胞和L-02細(xì)胞均具有不同程度的促進(jìn)作用，且隨劑量濃度的增加促進(jìn)作用加強(qiáng)。當(dāng)處理濃度達(dá)到1 000 μmol/L時(shí)，p-HS成分對(duì)HK-2和L-02細(xì)胞的促進(jìn)作用隨即減弱，但還是對(duì)細(xì)胞活力表現(xiàn)出促進(jìn)作用。這在一定程度上說明該成分對(duì)于人體的肝細(xì)胞和腎細(xì)胞生長(zhǎng)均表現(xiàn)出良好的促進(jìn)作用。此外，對(duì)PC-12細(xì)胞毒性研究發(fā)現(xiàn)，p-HS藥物對(duì)PC-12細(xì)胞均具有不同程度的抑制作用，且隨劑量濃度的增加抑制作用逐漸增強(qiáng)。參照《美國(guó)藥典》的毒性分級(jí)法，得到p-HS對(duì)PC-12細(xì)胞的安全劑量范圍為0～1 000 μmol/L，也就是說在該濃度范圍內(nèi)，p-HS單體成分不存在細(xì)胞毒性。以上研究說明硫熏天麻藥材中的主要硫熏標(biāo)志物p-HS不會(huì)危害人體健康，甚至對(duì)人體肝細(xì)胞和腎細(xì)胞活力表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用。

4.2 探明了硫熏天麻提取物的細(xì)胞毒性 中藥湯劑是最為常用的一種制劑形式，在臨床應(yīng)用中也最為廣泛[13]。為進(jìn)一步探討硫熏中藥材水提物的安全性，按照作者前期研究中得到的最佳硫熏工藝（硫磺與藥材比為1∶40，熏蒸1 h）對(duì)天麻進(jìn)行硫熏處理后，研究其水提物對(duì)人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞（HK-2）、人正常肝細(xì)胞（L-02）和大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC-12）的細(xì)胞活性和毒性的影響。結(jié)果顯示，硫熏天麻提取物對(duì)人體正常HK-2和L-02細(xì)胞生長(zhǎng)的影響雖然呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，但整體來看，硫熏處理的藥材水提物對(duì)人體正常細(xì)胞的生長(zhǎng)影響不大，與硫熏前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。此外，比較硫熏前的，硫熏天麻提取物對(duì)非正常PC-12細(xì)胞的抑制作用減弱，但整體還是表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。細(xì)胞毒性研究發(fā)現(xiàn)，在相同濃度下，硫熏后的天麻水提物對(duì)HK-2細(xì)胞毒性更小，說明硫熏在一定程度上并未對(duì)HK-2細(xì)胞產(chǎn)生危害。對(duì)L-02細(xì)胞來說，硫熏前后天麻水提物對(duì)L-02細(xì)胞毒性的安全劑量范圍基本相近，并無明顯差異，表明該硫熏工藝條件下，天麻水提物并沒有對(duì)L-02細(xì)胞毒性產(chǎn)生較大影響。另外，硫熏前后天麻提取物對(duì)PC-12細(xì)胞的安全劑量范圍為0～2.5 μg/mL，認(rèn)為硫熏并沒有改變天麻藥材提取物對(duì)PC-12細(xì)胞毒性的安全劑量。

綜上所述，按照前期提出的最佳硫熏工藝，在正常的濃度范圍內(nèi)，硫熏天麻提取物不會(huì)對(duì)HK-2、L-02和PC-12細(xì)胞活力產(chǎn)生顯著影響?？梢哉f，按照硫磺與藥材比為1∶40，熏蒸1 h的硫熏工藝進(jìn)行熏蒸，在保證藥材質(zhì)量的同時(shí)，其硫熏天麻藥材提取物對(duì)HK-2、L-02和PC-12無明顯的細(xì)胞毒性，能夠較好地保證藥材質(zhì)量安全。

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（2019-10-15收稿 責(zé)任編輯：王明）

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFC1700701）;國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81891014）;財(cái)政部中央本級(jí)專項(xiàng)（2060302）;國(guó)家發(fā)改委標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目（ZYBZH-C-HLJ-17，ZYBZH-C-GD-07）;現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)項(xiàng)目（CARS-21）;中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（ZZXT201806）作者簡(jiǎn)介：康傳志（1989.11—），男，博士，助理研究員，研究方向：中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)與生態(tài)種植，E-mail：kangchuanzhi1103@163.com通信作者：郭蘭萍（1969.08—），女，博士，研究員，研究方向：中藥資源生態(tài)學(xué)，E-mail：glp01@126.com