用HPLC法測定咽舒樂顆粒中綠原酸的含量

郝旭 劉明智 楊虹娟

摘要：目的：建立咽舒樂顆粒中綠原酸含量的測定。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為Agilent 5TC-C18（2）（250mm×4.6mm，5μm），以乙腈-0.4%磷酸（10：90）為流動相;流速1.0ml/min;檢測波長為327nm;柱溫為25℃。結(jié)果：綠原酸線性范圍為2.076～41.52ug/ml，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R = 0.99998，平均加樣回收率為102.36 %（n= 6），RSD= 0.65 %。結(jié)論：該法穩(wěn)定、快速、簡便、準(zhǔn)確，有可重復(fù)性，可用于咽舒樂顆粒中綠原酸的含量測定。

關(guān)鍵詞：咽舒樂顆粒;高效液相色譜法;綠原酸

Abstract：Objective：To establish a method for determining the content of chlorogenic acid in Yan shule granules .Methods：High performance liquid chromatography（HPLC）was adopted by using? Agilent 5TC-C18（2）column（250mm×4.6mm，5μm）.The mobile phase was methanol-water（10：90） The flow rate was 1.0mL/min，the detection wavelength was 327nm and the column temperature was 25℃.Results：Linear range of chlorogenic acid was between 2.076～41.52ug/ml and showed good linear relationship，which R = 0.99998. The average recovery rate was 102.36%（n=6），RSD=0.65%.Conclusion：This method，rapid，convenient，acctrate，reproducible，and could be used for determination of chlorogenic acid in Yan shule granules.

Keywords：Yan shule granules; HPLC;chlorogenic acid

咽舒樂顆粒主要由金蕎麥、桔梗、沙參、石斛、忍冬藤等中藥組合而成。是萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院邱美和主任的經(jīng)驗方，并多年應(yīng)用于臨床的批文制劑。本方是以中醫(yī)理論全面分析急慢性咽喉炎的病因，病機(jī)后，并結(jié)合了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)識及中藥藥理研究成果而組成的一復(fù)方制劑。主要用于補(bǔ)腎，健脾，潤肺，養(yǎng)血，活血生津，解毒，除煩，利咽，用于急慢性咽喉炎。其中忍冬藤有清熱解毒消腫的功效[1]。有文獻(xiàn)報道采用高效液相色譜法對咽舒樂顆粒中忍冬藤的有效成分綠原酸進(jìn)行含量測定[2]。目前，咽舒樂顆粒的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《江西省食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑》GZJ-0293-（1）-2006，檢驗內(nèi)容包括“性狀、鑒別、檢查”等，目前還沒有含量測定的項目。為了使其更好的應(yīng)用于臨床，對其質(zhì)量把控，提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗選取咽舒樂顆粒中忍冬藤的主成分綠原酸為定量的指標(biāo)，采用HPLC法測定綠原酸含量的方法研究。

1. 儀器、藥品與試劑：

Agilent 1200型高效液相色譜儀：配1200四元低壓梯度泵系列，Agilent1200化學(xué)工作站，DAD二極管陣列檢測器。

綠原酸對照品來源（中國藥品生物制品檢定所提供，80℃減壓干燥至恒重），批號：110753-201415? 含量以96.2%計。水為超純水，乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純。

2. 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5TC-C18（250mm×4.6mm，5μm），流動相：以乙腈-0.4%磷酸（10：90），臨用前以0.45μm微孔濾膜過濾并經(jīng)超聲脫氣處理;檢測的波長327nm;流速為1.0ml/min;柱溫為25℃;進(jìn)樣量為10μl。理論板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于1000。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備

取綠原酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

避光操作，取裝量差異項下的內(nèi)容物，研細(xì)，取約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.45μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗

取對照品溶液、供試品溶液及空白溶劑，按2.1項下色譜條件測定，比較供試品溶液色譜、對照品色譜及空白溶劑色譜，結(jié)果供試品中綠原酸色譜峰有較好的色譜分離。

2.3.2 線性關(guān)系的考察

精密稱取綠原酸對照品10.79mg，置100ml棕色量瓶中，加50%甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為綠原酸對照品母液，（10℃以下保存）;取母液再逐級稀釋成2.076μg/ml、10.38μg/ml、20.76μg/ml、31.14μg/ml、41.52μg/ml的溶液，精密吸取上述對照品溶液及綠原酸對照品母液10μL注入液相色譜儀，以峰面積響應(yīng)值Y為縱坐標(biāo)，對照品濃度x為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為Y= 30.328x -0.0053，R = 0.99998，說明綠原酸在2.076～41.52μg/ml之間有較好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗

精密吸取綠原酸對照品溶液（20.76μg/ml），按2.1項下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定綠原酸峰面積RSD值為0.24%。表明精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗

取同批樣品（批號20160106），照2.3項下平行制備供試品溶液6份，照2.1項下色譜條件測定。結(jié)果綠原酸RSD為0.51%，表明此方法的重復(fù)性良好。

2.3.5加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的本品（批號20160106）6份，各約0.5g，置具塞錐形瓶中，分別精密添加對照品溶液（綠原酸對照品：10.38μg/ml）25ml，按2.1項下方法試驗并算出回收率，結(jié)果見表1。

2.3.6 穩(wěn)定性

精密吸取供試品溶液（批號20160106），分別在0、2、4、6、8、12h進(jìn)樣，按2.1項下色譜條件測定綠原酸的峰面積積分值，結(jié)果，綠原酸在12小時內(nèi)峰面積無明顯變化，RSD為0.16%（n=6），表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7樣品含量測定

取本品3批，照2.1項下方法試驗，測定結(jié)果見表2。

根據(jù)結(jié)果，擬定本品每袋含忍冬藤以綠原酸（C16H18O9）計，不得少于0.82mg。

3. 討論

本文參照《中國藥典》2015年版一部[3]忍冬藤項下含量測定方法，選擇327nm作為檢測波長，選擇乙腈-0.4%磷酸（10：90）為流動相，在此流動相條件下，組分的峰型及分離度均理想，同時未見其他成分干擾。因綠原酸見光易分解，考察了避光條件下與未避光條件下操作，結(jié)果避光條件下測得含量更大。

本文考察了甲醇、50%甲醇、稀乙醇，結(jié)果50%甲醇提取效率更高。參照《中國藥典》2015年版一部忍冬藤項下含量測定方法，采用超聲提取法，考察了超聲提取20分鐘、30分鐘、40分鐘，結(jié)果30分鐘已提取完全?？疾炝?0℃、25℃、30℃及35℃，結(jié)果25℃時峰面積最大。

本方法準(zhǔn)確、快速，操作簡便，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，可用于咽舒樂顆粒中綠原酸的含量測定。

參考文獻(xiàn)：

[1] 余德洋.云南習(xí)用忍冬藤藥材的化學(xué)成分研究[D].云南中醫(yī)學(xué)院，

[2] 姜華，郭敏，徐世紅，等.HPLC 法測定忍冬藤痛風(fēng)顆粒中綠原酸的含量[J].西部中醫(yī)藥.2017，30（4）：25-27.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2015年版 一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社.2015：129-130.