緩釋砂硒對綠甘藍富硒作用及生長的影響

張化雨 徐廣平 龐哲 張立榮 馬麗霞

摘?要：砂硒因沙子具有透氣保水的特性，同時硒釋放相對緩慢，能提供穩(wěn)定的硒來源，是比較理想的富硒蔬果培養(yǎng)基質(zhì)。為了探討緩釋砂硒對綠甘藍富硒作用和生長的影響，該研究設置對照組（CK），實驗組緩釋砂硒（CT）、雞糞和砂硒1∶1混合（CT1）、雞糞和砂硒1∶2混合（CT2） 和雞糞（CT3）5個處理。結(jié)果表明：CT、CT1和CT2處理的綠甘藍硒含量比CK分別增加45%、61%和64%，逐步回歸分析表明綠甘藍硒含量和土壤硒含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）;CT2處理的效果最好，綠甘藍的產(chǎn)量增加45%，葉片厚度增加22.78%，水分利用效率提高56.66%。土壤錳含量和硒含量共同解釋了綠甘藍生物量變化的72%，而土壤鋅含量解釋綠甘藍水分利用效率變化的66%。這表明砂硒添加后，通過增加土壤硒含量提高綠甘藍硒含量，砂硒和雞糞配比更有效地提高了綠甘藍硒含量并促進其生長。

關(guān)鍵詞：緩釋砂硒，綠甘藍，錳和鋅，土壤微生物，生物量

Abstract：Natural sand selenium（Se）is a readily available product which is air permeable and watertight. It is a kind of good matrix for producing Se enrichment plant. In order to test the efficiency of sand Se in cultivating green cabbage and provide Se as a nutrition source，we set five groups of experiments：CK （control group without fertilization），CT （natural sand Se），CT1 （chicken manure∶Sand Se=1∶1），CT2 （chicken manure∶sand Se=1∶2），CT3 （chicken manure）. The results showed that sand Se addition significantly increased ?Se content of green cabbage by 45%，61% and 64%. Compared with the CK and CT3 groups，the yield，leaf thickness and water use efficiency of the green cabbage in CT2 increased significantly by 45%，22.78% and 56.66%，respectively. Soil manganese and zinc content accounted for 72% variation of the green cabbage biomass and soil zinc accounted for 66% variation of the water use efficiency. These indicate that sand Se，particularly when mixed with chicken manure，not only can provide Se as a nutrition but also is beneficial to green cabbage yield.

Key words：slow-released sand selenium，green cabbage，Mn and Zn，soil microbe，biomass

硒是人體必需的微量元素之一，在維持人體正常生理過程和提高人體免疫力方面發(fā)揮著重要的作用 （曾靜和羅海吉，2003;姜超強等，2015;梁若玉等，2017;王磊和陽繼輝，2017）。人體缺硒會導致多種疾病，如克山病和大骨節(jié)病，甚至癌癥等（譚見安和朱文郁，1991;郭亞南等，2017）。人體可吸收的硒包括無機硒（硒酸鈉和亞硒酸鈉）和有機硒。目前發(fā)現(xiàn)無機硒強化劑的吸收和利用很不理想，其生物有效性低，毒性較大，更嚴重的是無機硒中毒量與需要量之間范圍小，因而被嚴格限制其使用量（劉華山，2009;曾慶良等，2018）。利用植物生長過程中吸收無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒相對安全（果秀敏等，2003;周鑫斌等，2017）。這一方法目前多用根施硒肥或者葉面噴施無機硒來實現(xiàn)（王寧寧等，1994; 張弛等，2002;劉華山，2009），但這些措施不僅提高了生產(chǎn)成本，而且還存在潛在的環(huán)境風險，很難獲得硒含量穩(wěn)定的產(chǎn)品（張聯(lián)合等，2006;周鑫斌等，2017）。

砂硒具有透氣保水特性，同時硒釋放相對緩慢，能提供穩(wěn)定且含量保證的硒，是較理想的富硒蔬果培養(yǎng)基質(zhì)。但砂硒栽培蔬菜富硒效果如何目前還不十分清楚。綠甘藍是日常非常普遍的蔬菜，富含維生素C，營養(yǎng)價值高，適合作為日常食補蔬菜。如何用天然富硒基質(zhì)培育出日常食用且硒含量穩(wěn)定的富硒蔬菜成為近年來硒產(chǎn)品開發(fā)的熱點。因此，本研究提出以下問題：（1）砂硒添加是否能提高綠甘藍硒含量和產(chǎn)量;（2）砂硒添加影響綠甘藍硒含量和產(chǎn)量的因素是什么。這兩個問題的解決能揭示緩釋砂硒對綠甘藍富硒作用和生長的影響，為富硒綠甘藍的生產(chǎn)提供科學依據(jù)。

1?材料與方法

1.1 樣地和實驗設計

2017年4月10日在北京市第一○一中學溫室內(nèi)的生態(tài)試驗田開展實驗。在試驗田內(nèi)空曠平坦的種植場地，隨機選取5塊樣地，設置寬50 cm、行距30 cm、長10 m的區(qū)域，每塊區(qū)域隨機移栽育好苗的綠甘藍，間距30 cm。 共5個處理，各3個重復，分別為對照組CK、實驗組（CT、CT1、CT2和CT3）。使用砂硒及有機肥雞糞量見表1。

1.2 材料

土壤：選用北京市第一○一中學生態(tài)園內(nèi)土壤，pH值7.5，硒含量0.14 mg·kg-1。雞糞肥：生產(chǎn)商為河北高碑店市華舟有機肥制造有限公司，硒含量0.17 mg·kg-1;緩釋砂硒：硒含量0.5 mg·kg-1，北京仁創(chuàng)科技有限公司提供，來自于內(nèi)蒙古奈曼旗的富硒砂，掃描電鏡顯示其外部（圖1：左）及內(nèi)部（圖1：右）具有透氣保水的結(jié)構(gòu)（圖1）。

1.3 實驗過程

1.3.1 催芽?2017年4月20日選取170粒飽滿的綠甘藍種子，并在催芽前進行溫水浸種消毒。待水溫降至室溫，并等到種子吸水飽滿后取出種子，將準備好的培養(yǎng)皿上放上一張厚度適當?shù)募埥恚埥泶驖癫⒖氐舳嘤嗟乃?，在上面放上消過毒的種子，將其放在培養(yǎng)箱中25～26 ℃進行催芽。在催芽過程中，保持紙巾和芽的濕潤，2 d左右觀察到芽有白根露出即可。

1.3.2 播種和育苗?2017年4月25日將催過芽的種子播種在小花盆中，當4～5片真葉長出時挑選大小基本相等的幼苗進行移栽。

1.3.3 土壤理化性質(zhì)測定?每個處理取50 g土樣，風干后送到北京市農(nóng)科院測定土壤理化性質(zhì)。利用水∶土=1∶5測定土壤pH，利用凱氏定氮法測定土壤全氮含量。用比色法測定土壤速效磷含量。用火焰光度計法測定土壤全鉀。根據(jù)DTPA（一種螯合劑）浸提法，用原子吸收分光光度計，以乙炔-空氣火焰測定浸提液中速效鋅、錳、鐵的含量。另一部分樣品送至中國農(nóng)科院檢測中心測定硒含量，選取環(huán)保部發(fā)布的硒測定標準，釆用氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測定樣品中的總硒含量。利用環(huán)刀法測定土壤容重和含水量。土壤微生物數(shù)量的測定按照《土壤微生物分析方法手冊》（許光輝和鄭洪元，1986）進行，利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和高氏1號培養(yǎng)基培養(yǎng)土壤細菌和放線菌。具體在7月25日取植株根系附近的土壤，每組分別稱取1 g土樣，加入9 mL無菌蒸餾水，攪拌均勻后靜置15 min，使用移液器取上層清液1 mL進行梯度稀釋，分別稀釋為10-1～10-7，用血球計數(shù)板在顯微鏡下觀察，挑選適合濃度。接種10-2、10-3、10-4進行放線菌的培養(yǎng)觀察，接種10-5、10-6、10-7進行細菌的培養(yǎng)觀察。稀釋后將稀釋液分別接種到配好的培養(yǎng)基中，其中細菌培養(yǎng)基包括牛肉膏 3.0 g、蛋白胨 10.0 g、NaCl 5.0 g 、瓊脂 15 g、水 1 000 mL，pH 7.4～7.6;放線菌培養(yǎng)基包括KNO3 0.1 g、K2HPO4 0.05 g、MgSO4· 7H2O 0.05 g、NaCl 0.05 g、FeSO4· 7H2O 0.001 g。接種完畢后放入恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，細菌采取30 ℃避光恒溫培養(yǎng)，放線菌采取28 ℃避光恒溫培養(yǎng)，定期觀察培養(yǎng)基上的菌落個數(shù)和大小并進行記錄。

1.3.4 綠甘藍指標測定?葉片的測定：在苗期，利用直尺測量綠甘藍的葉長和葉寬，定期數(shù)葉片數(shù)并觀察葉片顏色;在綠甘藍移栽成活后，通過直尺測定每片葉子的葉長和葉寬用來計算出葉面積;選取綠甘藍最大的葉子，利用游標卡尺測量葉片厚度;選擇晴朗的天氣，在9：00—11：00，光飽和光強下（1 000 μmol·m-2·s-1），用美國Ciras-Ⅲ型便攜式光合儀，測定綠甘藍光合速率（Pn），蒸騰速率（E），氣孔導度（Gs），水分利用效率=光合速率（Pn）/蒸騰速率（E）;綠甘藍葉綠素含量的測定：取綠甘藍成熟葉，擦凈表面的污物，并在葉子上打孔，稱量選取的葉子的重量為0.2 g，再用配置好80%的丙酮溶液（分析純，北京化工廠生產(chǎn)，含量≥99.5°）浸提1～2 d直至葉子變白后開始進行下一步的實驗。用80%的丙酮溶液和蒸餾水各洗3遍比色皿后將浸提液倒入其中用UV-1 700c（MC150703001，上海美析儀器有限公司）型紫外可見分光光度計進行測量，在646、663、470 nm分別測量其吸光度，之后根據(jù)公式計算葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量，其計算公式分別為Ca=12.21A663-2.81A646;Cb=20.13A646-5.03A663;CT=Ca+Cb=17.32A646-7.18A663;Cx.c=（1 000A470-3.27 Ca-104Cb）/229。

緊實度的測定：綠甘藍包葉后利用直尺定期測定綠甘藍包葉直徑。生物量測定：在綠甘藍成熟后，將整株挖起，沖洗干凈，將沖洗干凈的地上和地下部分用吸水紙吸干，先稱鮮重，后在105 ℃下殺青30 min，然后調(diào)至65 ℃，烘干至恒重，分別稱取地上和地下部分的干重，最后根據(jù)稱量的數(shù)據(jù)計算生物量和根冠比。葉片橫切面液泡大小和細胞數(shù)量的測定：取測過葉片厚度的成熟綠甘藍葉片，在貼近葉脈右側(cè)距離葉基2 cm處剪寬0.5 cm、長1 cm的葉片放入固定液中（正丁醇：國藥集團化學試劑有限公司10005218;無水乙醇：國藥集團化學試劑有限公司100092683;番紅固綠（植物）染液：武漢谷歌生物科技有限公司G103;中性樹膠國藥集團化學試劑有限公司10004160），在中國科學院青藏高原研究所做成石蠟切片。把做好的切片放進組織切片掃描儀（型號：Pannoramic MIDI，廠家：3D HISTECH，匈牙利），儀器自動對焦開始掃描。在10X圖片中截取相同面積，數(shù)細胞數(shù)量，并測量液泡最大和最小直徑。每個處理做4個重復，共20個圖片。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理及圖表繪制運用Excel 2007軟件，描述性統(tǒng)計分析運用SPSS18.0軟件，采用單因子（One-way ANOVA）進行方差分析，選擇Tukey多重比較檢驗處理對被測定指標的差異，以P<0.05作為差異顯著的標準。利用逐步回歸的方法，分析測定的土壤理化性質(zhì)對綠甘藍硒含量、生物量、蒸騰速率和葉片厚度等的影響。

2?結(jié)果與分析

2.1 砂硒對綠甘藍的影響

從表2可以看出，緩釋砂硒各處理導致了部分土壤和植物指標發(fā)生顯著變化，顯著改變了土壤硒含量、微生物菌落數(shù)、容重、速效磷、速效鐵、速效錳和鋅、綠甘藍硒含量、生物量、葉片厚度、蒸騰速率、水分利用效率和光合色素濃度。

與CK相比，CT、 CT1和CT2分別顯著地提高了綠甘藍葉片硒含量的45%、61%和64%（圖2：A）。逐步回歸分析顯示綠甘藍硒含量主要是由土壤硒含量決定的（表3）。結(jié)果表明添加砂硒，同時添加雞糞肥更有利于綠甘藍硒的硒累積，與CK相比，CT2顯著增加了綠甘藍生物量（圖2：B）。

與CK相比，CT2顯著降低植物葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量（圖3：A，B，C）。實驗結(jié)果表明砂硒或砂硒混合雞糞肥都不同程度地改變了植物的葉片厚度，其中CT2顯著增加葉片厚度的22.78%（圖3：D）。從植物的形態(tài)指標上看，施雞糞肥并沒有顯著改變綠甘藍的葉面積和葉厚度（P>0.05），但砂硒顯著改變了綠甘藍的葉片厚度。利用逐步回歸的方法，未發(fā)現(xiàn)所測定的土壤理化性質(zhì)對甘藍葉片厚度有直接的影響（P>0.05）。葉片橫切掃描結(jié)果顯示，與CK相比，CT、CT1、CT2和CT3均顯著提高綠甘藍葉片單位面積內(nèi)液泡大小，但是只有砂硒與雞糞混合和單獨添加雞糞時綠甘藍細胞數(shù)量才顯著增加（表4）。

測定綠甘藍的蒸騰速率和水分利用效率結(jié)果顯示，CT2顯著降低了綠甘藍葉片蒸騰速率的34.74%，提高了水分利用效率的56.66%（圖3：E，F(xiàn)）。逐步回歸分析結(jié)果表明土壤鋅含量解釋了綠甘藍蒸騰速率變化的66%（表3）。

2.2 砂硒對土壤的影響

與CK相比，施砂硒、施雞糞混合砂硒1∶1和1∶2分別提高綠甘藍硒含量的45%、61%和64%（圖4：A）。說明砂硒添加起到增加土壤硒含量的作用。與CK相比，砂硒添加不同程度上降低了土壤容重。這是因為砂硒具有保水透氣特性，所以砂硒添加降低了土壤緊實度和土壤容重，增加了土壤的孔隙度。實驗各處理均對土壤含水量沒有顯著影響（P>0.05）。

與CK、CT和CT1相比，CT2和CT3均顯著提高土壤速效鐵、速效磷和鋅的含量，CT2與CK相比有效鐵含量提高了58.97%、速效磷提高了20.91%，有效鋅含量提高了16%。這表明雞糞添加和砂硒添加都有可能增加土壤有效鐵、速效磷和速效鋅的含量（圖5：A，B，C）。與CK相比，CT2土壤速效錳含量顯著增加（圖5：D），表明砂硒和雞糞混合添加是促進土壤速效錳增加的主要原因。相對于CK，CT、CT1、CT2和CT3都提高了土壤微生物的菌落數(shù)（圖6），其中CT和CT2提高的最多。表明單位面積內(nèi)砂硒越多土壤微生物菌落數(shù)越多，這可能與砂硒比較好的透氣保水性有關(guān)。

3?討論與結(jié)論

3.1 砂硒對綠甘藍硒含量和地上生物量的影響

我們的實驗結(jié)果表明添加砂硒能夠提高綠甘藍硒含量，但同時添加雞糞肥則更有利于綠甘藍硒的累積。很多硒酸鈉或亞硒酸鈉直接添加的實驗結(jié)果也都表現(xiàn)出無機硒添加提高了植物的硒含量（吳永堯等，1998;劉海燕，2015）。但這些研究也同時發(fā)現(xiàn)稍高含量的無機硒添加就會對植物有毒害作用，降低植物生物量，甚至導致植物死亡（吳永堯等，1998;劉海燕，2015）。例如吳永堯等（1998）發(fā)現(xiàn)僅僅培養(yǎng)1 d即可見0.5 mg·kg-1硒處理的水稻幼苗葉緣卷曲，1.0 mg·kg-1硒以上的處理則幼苗接近死亡。本研究中，CT（0.52 mg·kg-1硒）、CT1（0.25 mg·kg-1硒）和單純雞糞添加均沒有影響綠甘藍的地上生物量，而砂硒和雞糞混合2∶1卻顯著升高綠甘藍生物量。這表明砂硒與雞糞2∶1能有效提高綠甘藍的產(chǎn)量。張弛等（2002）發(fā)現(xiàn)適量的硒添加油菜根系氧化還原能力和蛋白質(zhì)含量提高而過氧化物丙二醛的含量降低，顯著促進油菜生長發(fā)育、維持旺盛的生長活力、增強抗逆性、提高植物硒含量和促進油菜增產(chǎn)。我們的逐步回歸分析結(jié)果顯示土壤硒含量和錳含量解釋綠甘藍生物量變化的72%，這可能是因為錳是植物光合作用必須的元素，硒是植物新陳代謝必須元素，因此硒添加可能通過促進綠甘藍新陳代謝或者通過提高土壤錳含量從而促進光合作用，間接提高綠甘藍生物量（Chen et al.，2018）。

人體可攝入的硒包括無機硒（硒酸鈉和亞硒酸鈉）和有機硒。從2000年開始國際上已禁用無機硒。酵母硒、麥芽硒、納米硒人體吸收和代謝率低，人體吸收率為40%～60%，且剩余為無機硒殘留（王俊等，2003）。目前備受青睞的為天然有機植物活性硒，即從富硒土壤中吸收硒元素的食品，經(jīng)過生長過程中的光合作用和體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化作用，在體內(nèi)以硒代氨基酸形態(tài)存在，人體吸收率在99%以上，既滿足了人體硒元素需要（劉新偉等，2015），又解決了硒的吸收和代謝率偏低難題。因此，真正的富硒食品應是富硒土壤中栽培生產(chǎn)出的有機硒，且通過土壤-植物-（動物）-人的食物鏈方式補硒是安全有效的途徑（王俊等，2003）。

3.2 砂硒對綠甘藍形態(tài)指標的影響

本研究結(jié)果顯示單純砂硒添加降低綠甘藍光合色素含量。這與硒添加對油菜和小麥葉綠素的影響相反。王寧寧等（1994）和張弛等（2002）發(fā)現(xiàn)種植小麥添加亞硒酸鈉或栽培油菜添加亞硒酸鈉均導致植物葉片光合色素含量升高。但劉華山（2009）研究認為不同水平的亞硒酸鈉添加對葉綠素降低的影響是暫時的，一般可能最初葉綠素含量略有下降，但是隨著生長的繼續(xù)進行，各處理水平葉綠素含量會趨于同一值。我們的實驗結(jié)果部分解釋了為什么單純砂硒添加并沒有提高綠甘藍生物量。在我們的實驗砂硒混合雞糞2∶1有助于綠甘藍葉片厚度增加。普遍認為植物葉片的厚度是由于葉片細胞本身的生長以及植物體內(nèi)的水分含量引起的。植物水分充足時，植物葉片變厚，缺水時則葉片變?。懺薜龋?015）。我們實驗結(jié)果并沒有發(fā)現(xiàn)施雞糞或砂硒影響土壤含水量，也未發(fā)現(xiàn)所測定的土壤理化性質(zhì)對綠甘藍葉片厚度有直接的影響。葉片橫切掃描結(jié)果顯示砂硒添加顯著提高綠甘藍葉片單位面積內(nèi)液泡大小，但是只有砂硒配比雞糞和單獨添加雞糞時綠甘藍細胞數(shù)量才顯著增加。因此，本研究綠甘藍葉片厚度的增加是因為細胞大小和細胞數(shù)量增加導致的（Hunder et al.，1981;Lindorf，1994）。

本研究結(jié)果表明砂硒混合雞糞2∶1降低了綠甘藍蒸騰速率并能有效提高葉片水分利用效率。魏孝榮等 （2005）發(fā)現(xiàn)鋅添加能顯著提高玉米葉片蒸騰速率達36%，而洋甘藍和花椰菜缺鋅都降低了其蒸騰速率（張福鎖，1991）。鋅在植物氣孔開閉中作用機理可能在于碳酸酐酶中含有鋅，而碳酸酐酶能夠調(diào)節(jié)CO2的供應（張福鎖，1991）。增加鋅能夠提高植物體內(nèi)該酶的活性，有利于增加保衛(wèi)細胞內(nèi)的HCO-3含量，促進氣孔開放。但我們的結(jié)果顯示CT2土壤鋅含量最高卻蒸騰速率最低，這表明在水分條件不缺，土壤鋅充足時還有其他機制調(diào)控著植物的蒸騰速率以此來確保植物有較高的水分利用效率（張福鎖，1991）。

總之，緩釋砂硒添加（砂硒、雞糞肥∶砂硒=1∶1，雞糞肥∶砂硒=1∶2）使綠甘藍的硒含量分別增加了45%、61%和64%，綠甘藍硒含量和土壤硒含量顯著正相關(guān)（P<0.05）;添加緩釋砂硒后，降低了土壤容重，增加了土壤微生物菌落數(shù)量，提高土壤硒含量，改善土壤理化性質(zhì)，進而提高綠甘藍硒含量，尤其砂硒和雞糞肥配比更有效地提高了綠甘藍硒含量并促進其生長。這表明砂硒添加不僅提高綠甘藍硒含量，而且可以改善土壤條件，進一步促進綠甘藍產(chǎn)量提高，值得在農(nóng)業(yè)上大面積推廣。

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