水體銅污染對苦草生長及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h1>
2019-09-10 07:22:44高桂青王香蓮盧龍等
廣西植物 2019年2期
高桂青 王香蓮 盧龍 等
摘?要：該文以苦草（Vallisneria natans）為材料，研究了不同濃度銅污染水體對其葉/根長、生物量、光合色素含量、體內(nèi)重金屬含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響。結(jié)果表明：隨著水體銅濃度的增加，苦草的葉長、根長、生物量均顯著下降;光合色素含量逐漸下降，其中葉綠素a比葉綠素b下降明顯，類胡蘿卜素下降幅度最小;葉片銅含量隨銅濃度的增加顯著上升（P<0.05），各處理組根銅含量沒有顯著性差異，在水中銅低于0.5 mg·L-1的環(huán)境中苦草具有正常的光合活性。除0.5 mg·L-1處理組外，最大熒光（Fm）、最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、潛在光化學(xué)效率（Fv/Fo）、光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）與有效量子產(chǎn)量[Y（Ⅱ）]均比對照組顯著降低（P<0.05），而非光化學(xué)淬滅效率（qN）、調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量[Y（NPQ）]、非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量[Y（NO）]均呈上升趨勢，其中Fv/Fo對銅污染反應(yīng)最為靈敏。綜合各參數(shù)變化情況，隨著水體銅濃度的增加，苦草生長受到抑制，葉片利用光能的效率下降，PSⅡ反應(yīng)中心的電子傳遞受到明顯的抑制;苦草通過自身調(diào)節(jié)以熱的形式將過剩光能耗散，以減輕PSⅡ反應(yīng)中心受傷害的程度;苦草是銅超富集植物，其可作為低濃度銅污染水體生態(tài)修復(fù)的備選物種。
關(guān)鍵詞：苦草，銅污染，生物量，光合色素，熒光特性
Abstract：Vallisneria natans was selected as test materials and cultured in different concentrations of Cu polluted water. The lengths of leaves and roots，biomass，photosynthetic pigment，heavy metal content and chlorophyll fluorescence parameters of V. natans were observed. The results showed that the lengths of leaves and roots，biomass of V. natans were significantly decreased with the increase of Cu concentration. The leaves gradually lost chlorosis，the chlorophyll a decreased more than the chlorophyll b，and carotenoids had the smallest decline. Cu content in the leaves of V. natans increased significantly（P<0.05） with the increase of Cu concentration，and there was no significant difference in Cu content of roots between treatment groups. V. natans has normal photosynthetic activity when Cu was less than 0.5 mg·L-1 in water. Except for the 0.5 mg·L-1 treatment group，F(xiàn)m， Fv/Fm，F(xiàn)v/Fo，qP and Y（Ⅱ） were significantly lower than the control group （P<0.05），while qN，Y（NPQ） and Y（NO） showed an upward trend，in which Fv/Fo was the most sensitive to Cu pollution. In summary，the growth of V. natans was inhibited with the increase of Cu concentration，the efficiency of utilizing light energy of leaves was decreased，and the electron transfer of PS Ⅱ reaction center was obviously inhibited. V. natans consumed excess light energy in the form of heat through self-regulation，to reduce the extent of damage to PS Ⅱ reaction center. V. natans was a Cu hyperaccumulator which can be used an alternative species for ecological restoration of low-Cu-polluted water.
Key words：Vallisneria natans，Cu pollution，biomass，photosynthetic pigment，fluorescence characteristics
近年來，由于礦產(chǎn)開發(fā)及工業(yè)廢水的濫排濫放，水體中的重金屬污染問題日益突出（Ji et al.，2018）。重金屬不能自然降解或被微生物所分解，而是通過食物鏈的生物放大作用富集生物體并損害動物和人類健康（徐勤松等，2003）。銅（Cu）是植物生長的必需微量元素（Fernandes & Henriques，1991），在許多和細(xì)胞代謝相關(guān)的酶和光合作用中起著不可替代的作用（Nagajyotic et al.，2010）。但過量Cu會對植物造成極大的毒性（Shahid et al.，2016），抑制光合作用的進(jìn)行，降低酶的活性等。沉水植物作為水生態(tài)系統(tǒng)中的重要初級生產(chǎn)力，對于維持水生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性、生物地球化學(xué)循環(huán)和清水穩(wěn)態(tài)具有重要作用（宋玉芝等，2011）。許多沉水植物能夠富集水體和底泥中的Cu（潘義宏等，2010;Xue et al.，2010;謝佩君等，2016），且不同類型的沉水植物對Cu具有不同的耐受性和富集能力（Upadhyay et al.，2014;Wang et al.，2014;簡敏菲等，2016）。目前國內(nèi)外學(xué)者一直關(guān)注重金屬脅迫下沉水植物體內(nèi)重金屬的積累（梁珊等，2016;Ahmad et al.，2016）、生理生化的影響（徐勤松等，2006;Wang et al.，2012）、亞顯微結(jié)構(gòu)變化（計(jì)汪棟等，2007;趙秀俠等，2017）等，對于重金屬脅迫下苦草等沉水植物的光合熒光特性較缺乏研究。
1980年Schreiber教授發(fā)明脈沖振幅調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x，在探測逆境對植物光合作用的影響等方面具有快速、簡便、靈敏、可靠等特性?；诠夂献饔美碚?，葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)不會破壞細(xì)胞，不會對植物造成傷害，被認(rèn)為是研究植物光合作用與環(huán)境脅迫之間關(guān)系的有效探針（李伶等，2010;晉利和李曉亮，2015）。水下調(diào)制熒光儀（Diving-pam）可以原位測定沉水植物的光合作用（Yu et al.，2010;Hussner et al.，2011）。
苦草（Vallisneria natans）為水鱉科苦草屬多年生沉水草本植物，具有較高的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值（王艷麗等，2006），再生能力強(qiáng)，廣泛應(yīng)用于水體生態(tài)修復(fù)工程（顧燕飛等，2017;Wang et al.，2009），對重金屬具有較強(qiáng)的吸收積累能力（Wang et al.，2012;Xing et al.，2013）。本研究通過不同濃度銅污染水體對苦草葉長、根長、生物量、光合色素含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響，探討苦草受脅迫后的生長狀態(tài)和光合系統(tǒng)響應(yīng)的內(nèi)在機(jī)制，以期為銅污染水體的生態(tài)修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。
1?材料與方法
1.1 材料
本研究以苦草為材料，于2017年6月初采自鄱陽湖南磯山自然保護(hù)區(qū)。將采集到的苦草去除死葉和死根，選擇長勢一致的植株，修剪為葉片長度為15 cm，根長為3 cm，輕輕洗去葉表面附著物和根部泥土。
1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
試驗(yàn)在南昌工程學(xué)院生態(tài)園內(nèi)完成。將從鄱陽湖采集到的底泥鋪于塑料方盒（長34.0 cm、寬22.5 cm、高10 cm），底泥厚8 cm，每盒均勻種植苦草12株，然后將塑料方盒放入玻璃缸（長40 cm、寬40 cm、高50 cm）內(nèi)，向缸中加入經(jīng)過晾曬的自來水至40 cm高度。預(yù)培養(yǎng)1周后，加入不同濃度的CuSO4溶液進(jìn)行處理，結(jié)合前期預(yù)處理，5種處理分別設(shè)置為0 mg·L-1對照組，0.5 mg·L-1處理組，1.0 mg·L-1處理組，1.5 mg·L-1處理組和2.0 mg·L-1處理組，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。在脅迫處理1周后，測定各參數(shù)。
1.3 測定指標(biāo)及方法
采用水下調(diào)制熒光儀（Diving-pam）和數(shù)據(jù)采集軟件Wincontrol原位測定苦草葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。每一處理組隨機(jī)取3株，用暗葉夾夾住葉片（離頂端3 cm左右），經(jīng)暗適應(yīng)20 min 后，打開葉夾，開啟檢測光，得到最小熒光（Fo），最大熒光（Fm）。PSⅡ反應(yīng)中心的最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、潛在光化學(xué)效率（Fv/Fo）、光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）、非光化學(xué)淬滅系數(shù)（qN）、有效量子產(chǎn)量[Y（Ⅱ）]、調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量[Y（NPQ）]和非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量[Y（NO）]由系統(tǒng)選定模式自動生成。
將采集的苦草用自來水將表面附著物和泥清洗干凈，用直尺測量其葉片和根的最大長度，用天平稱量鮮重，于空氣中自然風(fēng)干后稱其干重;采用丙酮萃取法測定光合色素含量（李合生，2010）;將葉片和根于烘箱中烘至恒重，用粉碎機(jī)研磨后過100目篩，采用三酸消化法（HNO3 -HF-HClO4），定容后用ICP-AES測定銅含量。
1.4 數(shù)據(jù)處理與分析
試驗(yàn)結(jié)果為3次試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的處理和制圖釆用Excel 2017軟件;用SPSS19.0軟件對不同濃度銅污染下反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較分析，P<0.05表示差異顯著;并進(jìn)行銅濃度與熒光參數(shù)的Pearson相關(guān)性分析。
2?結(jié)果與分析
2.1 銅污染對苦草生長的影響
根據(jù)試驗(yàn)所設(shè)置的5個不同濃度梯度，測定苦草的葉長、根長和生物量，分別統(tǒng)計(jì)其變化特征及相關(guān)顯著性，結(jié)果如圖1所示。銅明顯抑制了苦草的生長，葉長、根長、鮮重和干重均顯著低于對照組。2.0 mg·L-1處理組苦草葉和根的長度最低，分別為對照組的82.47%和61.10%。0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1處理組根的鮮重?zé)o顯著性差異。2.0 mg·L-1處理組苦草葉和根的鮮重最低，分別為對照組的67.73%和53.37%;干重分別為對照組的71.31%和53.37%。
2.2 銅污染對苦草葉片光合色素的影響
隨著水體銅濃度的升高，苦草葉片的葉綠素總量（Ct）、葉綠素a（Ca）、葉綠素b（Cb）、類胡蘿卜素（Cc）和葉綠素a/葉綠素b（Ca/Cb）變化趨勢一致，整體均成下降趨勢，葉片逐漸褪綠。Ct和Ca下降顯著（P<0.05），對照組和0.5 mg·L-1處理組的Cb差異不顯著（P>0.05）。葉綠素a比葉綠素b下降幅度大，其對銅脅迫更為敏感。Cc下降幅度較小，類胡蘿卜素/葉綠素總量（Cc/Ct）先降低后增加，說明Cc對脅迫不敏感。Ct、Ca、Cb、Cc、Ca/Cb與銅濃度的相關(guān)系數(shù)r分別為-0.970**，-0.969**，-0.952**，-0.864**，-0.870**，均呈極顯著負(fù)相關(guān)。
2.3 銅在苦草體內(nèi)的富集
苦草葉片中銅的富集量隨著水體銅濃度的增加而增加，處理組與對照組之間存在顯著性差異（P<0.05）。2.0 mg·L-1處理組葉片銅含量達(dá)到（5.74±1.07）mg·g-1，約為0.5 mg·L-1處理組的3.037倍;根中銅含量在各處理組間無顯著性差異（P>0.05）。
2.4 銅對苦草葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
根據(jù)實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的5個不同濃度梯度，測定苦草葉片的Fo、Fm、Fv/Fm、Fv/Fo、qP、qN、Y（Ⅱ）、Y（NO）和Y（NPQ），分別統(tǒng)計(jì)其變化特征及相關(guān)顯著性，結(jié)果如圖4、圖5、圖6所示。
最小熒光Fo指葉片經(jīng)過充分暗適應(yīng)后，光系統(tǒng)Ⅱ的反應(yīng)中心全部開放時(shí)的葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量。處理組的Fo分別為對照組的1.003、1.024、1.042、1.175倍，但差異不顯著。Fo與銅濃度呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為0.555*。處理組的Fm均小于對照組，且隨銅濃度的增加下降顯著（P<0.05）。除0.5 mg·L-1處理組與對照組差異不顯著，其它處理組的Fv/Fm均下降顯著，2.0 mg·L-1處理組僅為對照組的46.68%。Fv/Fo變化趨勢與Fv/Fm相似。當(dāng)銅濃度低于0.5 mg·L-1 時(shí)，對葉片PSⅡ反應(yīng)中心捕獲光能的效率影響不顯著。Fm、Fv/Fm、Fv/Fo與銅濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為-0.914**、-0.964**、-0.958**。
隨著銅濃度的增加，qP與qN呈相反的變化趨勢。qP下降顯著（P<0.05），2.0 mg·L-1處理組僅為對照組的54.90%;qN呈上升趨勢，2.0 mg·L-1處理組達(dá)到最大值0.608，高出對照141.3%，說明當(dāng)苦草受到銅脅迫時(shí)，為維護(hù)自身生長需要，會將越來越多天線色素吸收的光能以熱能形式耗散掉用于進(jìn)行自我保護(hù)（劉濤等，2017;錢永強(qiáng)等，2011;吳昊等，2016）。qP與銅濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為-0.982**;qN與銅濃度呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為0.894**。
有效量子產(chǎn)量Y（Ⅱ）隨著銅濃度的增加，下降顯著（P<0.05）。Y（Ⅱ）與銅濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為-0.927**。這表明苦草葉片的實(shí)際光合效率隨著銅濃度的增加而降低。隨著脅迫強(qiáng)度的增大，Y（NO）緩慢上升，Y（NPQ）也整體成上升趨勢。2.0 mg·L-1處理組Y（NO）和Y（NPQ）分別是對照組的1.66倍、4.02倍，Y（NO）和Y（NPQ）與銅濃度呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.896**、0.858**。
3?討論
重金屬脅迫對植物生長具有強(qiáng)烈的抑制作用，嚴(yán)重時(shí)會完全停止生長，出現(xiàn)不開花，不結(jié)果等現(xiàn)象（簡敏菲等，2017）。本研究表明，水體銅污染對苦草生長有顯著的抑制作用，2.0 mg·L-1處理組部分葉片脫落，生物量明顯減小，但仍能生存。而陳萍萍等（2013）認(rèn)為1.0 mg·L-1的銅對苦草生長有促進(jìn)作用，這是因?yàn)槠浞N植苦草株數(shù)比本研究大很多所致?？嗖輰︺~的富集量較大，葉片銅含量可達(dá)到（5.74±1.07）mg·g-1，屬于Cu超富集植物（Xing et al.，2013），其可以作為低濃度銅污染水體生態(tài)修復(fù)的備選物種。
重金屬對植物光合作用的影響主要是通過破壞葉綠體膜和類囊體膜的超微結(jié)構(gòu)，抑制葉綠素的合成，阻斷PSⅡ的電子傳遞，以及破壞卡爾文循環(huán)的關(guān)鍵酶等方式來降低光合效率（Seregin & Ivanov，2001）。本研究中隨著銅濃度的增加，光合色素含量顯著下降，葉片逐漸褪綠，且老葉最先褪綠，這與竹葉眼子菜遭受Cu脅迫的變化規(guī)律相一致（計(jì)汪棟等，2007）。其中Ca比Cb下降更快，Ca對Cu更敏感。Ca/Cb緩慢降低，說明類囊體的垛疊程度逐漸降低，葉片的光抑制增加（郭書奎和趙可夫，2001）。隨著銅濃度增加，葉綠素含量降低，主要原因可能是銅進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)，與葉綠體蛋白上的巰基結(jié)合（Assche & Clijsters，1990）或取代其中的Fe2+、Zn2+、Mg2+（張金彪和黃維南，2007），破壞葉綠體結(jié)構(gòu);同時(shí)，隨著銅在植物體內(nèi)的累積，它與細(xì)胞中合成葉綠素的某些酶（原葉綠素酸酯還原酶和膽色素原脫氨酶）結(jié)合（Asgharipour et al.，2011），使酶活性受阻，葉綠素合成受到抑制。
葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)已被公認(rèn)為植物抗逆研究的良好指標(biāo)之一，在正常條件下生長的植物各熒光參數(shù)比較穩(wěn)定，不會出現(xiàn)較大的波動（Roháek，2002）。重金屬對沉水植物光合作用的影響程度可以通過測定熒光值的變化來反映（李磊和黃小平，2009）。Fo的大小與PSⅡ原始激發(fā)色素密度以及反應(yīng)所處類囊體結(jié)構(gòu)狀態(tài)及葉綠素含量有關(guān)，而與光化學(xué)反應(yīng)無關(guān)（陳正勇等，2011）。在本研究中Fo略有增加，可能是銅會激發(fā)色素密度升高和內(nèi)囊體膜的改變，以適應(yīng)環(huán)境變化。Fv/Fm表示當(dāng)所有光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心處于開放態(tài)時(shí)的最大量子產(chǎn)量，該指標(biāo)可以從量子水平反映理論上植物光合能力可以達(dá)到的最大程度，脅迫條件下該參數(shù)顯著下降（許大全等，2013）。水體0.5 mg·L-1銅對苦草葉片的潛在最大光合能力影響微弱，造成的脅迫較輕。Fv/Fo常用于度量光系統(tǒng)Ⅱ的潛在活性，其對光合效率的變化很敏感。研究表明，銅、 鎘、 鉻和鋅可以在水裂解端位點(diǎn)捕捉電子流，銅很有可能通過影響水裂解端的電子流而影響PSⅡ的活性（Mallick & Mohn，2003）。
在本研究中Fv/Fo 的變化大于其他指標(biāo)，說明銅對水裂解端的影響遠(yuǎn)大于其他指標(biāo)，這與李伶等（2010）對浮萍的研究結(jié)果相類似。
光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）是將捕獲的光子能量用于光化學(xué)反應(yīng)的能力指標(biāo)，本研究中處理組的qP均低于對照組，說明銅抑制了苦草葉片光系統(tǒng)氧化側(cè)向PSⅡ反應(yīng)中心的電子流動，PSⅡ的電子傳遞活性變小，導(dǎo)致光合速率下降（邱嵐等，2018），以熱或其他形式耗散的光能增加。非光化學(xué)猝滅系數(shù)（qN）的升高意味著重金屬限制了PSⅡ的電子傳遞，導(dǎo)致還原型輔酶Ⅱ和ATP合成的下降（Janssen et al.，1992），PSⅡ吸收的光能以潛在熱形式耗散的能力增強(qiáng)，對苦草本身有保護(hù)作用。
PSⅡ反應(yīng)中心吸收的光量子主要通過光合電子傳遞、葉綠素?zé)晒饧盁嵘⑹齻€途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)化與耗散（甘龍等，2017），在脅迫環(huán)境下三者的比例會發(fā)生變化。本研究中隨著銅濃度的增加，Y（Ⅱ）所占比例最小，這與過量的Cd會直接抑制光合電子傳遞的速率，從而降低光化學(xué)途徑轉(zhuǎn)化能量的比例相類似（秦天才等，1994）。Y（Ⅱ）的下降必然會造成Y（NPQ）和Y（NO）的升高，且Y（NPQ）的上升幅度高于Y（NO），說明葉片中銅的積累對苦草造成了傷害，迫使其通過調(diào)節(jié)自身來抵御外界環(huán)境所帶來的傷害，且脅迫強(qiáng)度越大，苦草的響應(yīng)越大。這與重度脅迫下植物對光能的利用減弱，并以增加調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量的方式來消耗過多的熱量來保護(hù)自身（吳昊等，2016）相穩(wěn)合。
4?結(jié)論
（1）水體銅污染對苦草的生長、光合素含量有明顯的抑制作用，且銅對葉綠素a的破壞作用強(qiáng)于葉綠素b。（2）銅會抑制苦草PSⅡ反應(yīng)中心的光合活性，限制電子傳遞;其可通過自身調(diào)節(jié)以熱的形式將過剩光能耗散，減輕PSⅡ中心受傷害的程度。（3）苦草對銅有較強(qiáng)的富集能力，在銅濃度低于0.5 mg·L-1的水環(huán)境中苦草具有正常的光合活性，2.0 mg·L-1超出了苦草的忍受范圍，可推測將苦草用于低濃度銅污染水體的生態(tài)修復(fù)，濃度閾值尚需更多研究來進(jìn)一步論證。
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高桂青 王香蓮 盧龍 等
摘?要：該文以苦草（Vallisneria natans）為材料，研究了不同濃度銅污染水體對其葉/根長、生物量、光合色素含量、體內(nèi)重金屬含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響。結(jié)果表明：隨著水體銅濃度的增加，苦草的葉長、根長、生物量均顯著下降;光合色素含量逐漸下降，其中葉綠素a比葉綠素b下降明顯，類胡蘿卜素下降幅度最小;葉片銅含量隨銅濃度的增加顯著上升（P<0.05），各處理組根銅含量沒有顯著性差異，在水中銅低于0.5 mg·L-1的環(huán)境中苦草具有正常的光合活性。除0.5 mg·L-1處理組外，最大熒光（Fm）、最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、潛在光化學(xué)效率（Fv/Fo）、光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）與有效量子產(chǎn)量[Y（Ⅱ）]均比對照組顯著降低（P<0.05），而非光化學(xué)淬滅效率（qN）、調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量[Y（NPQ）]、非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量[Y（NO）]均呈上升趨勢，其中Fv/Fo對銅污染反應(yīng)最為靈敏。綜合各參數(shù)變化情況，隨著水體銅濃度的增加，苦草生長受到抑制，葉片利用光能的效率下降，PSⅡ反應(yīng)中心的電子傳遞受到明顯的抑制;苦草通過自身調(diào)節(jié)以熱的形式將過剩光能耗散，以減輕PSⅡ反應(yīng)中心受傷害的程度;苦草是銅超富集植物，其可作為低濃度銅污染水體生態(tài)修復(fù)的備選物種。
關(guān)鍵詞：苦草，銅污染，生物量，光合色素，熒光特性
Abstract：Vallisneria natans was selected as test materials and cultured in different concentrations of Cu polluted water. The lengths of leaves and roots，biomass，photosynthetic pigment，heavy metal content and chlorophyll fluorescence parameters of V. natans were observed. The results showed that the lengths of leaves and roots，biomass of V. natans were significantly decreased with the increase of Cu concentration. The leaves gradually lost chlorosis，the chlorophyll a decreased more than the chlorophyll b，and carotenoids had the smallest decline. Cu content in the leaves of V. natans increased significantly（P<0.05） with the increase of Cu concentration，and there was no significant difference in Cu content of roots between treatment groups. V. natans has normal photosynthetic activity when Cu was less than 0.5 mg·L-1 in water. Except for the 0.5 mg·L-1 treatment group，F(xiàn)m， Fv/Fm，F(xiàn)v/Fo，qP and Y（Ⅱ） were significantly lower than the control group （P<0.05），while qN，Y（NPQ） and Y（NO） showed an upward trend，in which Fv/Fo was the most sensitive to Cu pollution. In summary，the growth of V. natans was inhibited with the increase of Cu concentration，the efficiency of utilizing light energy of leaves was decreased，and the electron transfer of PS Ⅱ reaction center was obviously inhibited. V. natans consumed excess light energy in the form of heat through self-regulation，to reduce the extent of damage to PS Ⅱ reaction center. V. natans was a Cu hyperaccumulator which can be used an alternative species for ecological restoration of low-Cu-polluted water.
Key words：Vallisneria natans，Cu pollution，biomass，photosynthetic pigment，fluorescence characteristics
近年來，由于礦產(chǎn)開發(fā)及工業(yè)廢水的濫排濫放，水體中的重金屬污染問題日益突出（Ji et al.，2018）。重金屬不能自然降解或被微生物所分解，而是通過食物鏈的生物放大作用富集生物體并損害動物和人類健康（徐勤松等，2003）。銅（Cu）是植物生長的必需微量元素（Fernandes & Henriques，1991），在許多和細(xì)胞代謝相關(guān)的酶和光合作用中起著不可替代的作用（Nagajyotic et al.，2010）。但過量Cu會對植物造成極大的毒性（Shahid et al.，2016），抑制光合作用的進(jìn)行，降低酶的活性等。沉水植物作為水生態(tài)系統(tǒng)中的重要初級生產(chǎn)力，對于維持水生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性、生物地球化學(xué)循環(huán)和清水穩(wěn)態(tài)具有重要作用（宋玉芝等，2011）。許多沉水植物能夠富集水體和底泥中的Cu（潘義宏等，2010;Xue et al.，2010;謝佩君等，2016），且不同類型的沉水植物對Cu具有不同的耐受性和富集能力（Upadhyay et al.，2014;Wang et al.，2014;簡敏菲等，2016）。目前國內(nèi)外學(xué)者一直關(guān)注重金屬脅迫下沉水植物體內(nèi)重金屬的積累（梁珊等，2016;Ahmad et al.，2016）、生理生化的影響（徐勤松等，2006;Wang et al.，2012）、亞顯微結(jié)構(gòu)變化（計(jì)汪棟等，2007;趙秀俠等，2017）等，對于重金屬脅迫下苦草等沉水植物的光合熒光特性較缺乏研究。
1980年Schreiber教授發(fā)明脈沖振幅調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x，在探測逆境對植物光合作用的影響等方面具有快速、簡便、靈敏、可靠等特性?；诠夂献饔美碚?，葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)不會破壞細(xì)胞，不會對植物造成傷害，被認(rèn)為是研究植物光合作用與環(huán)境脅迫之間關(guān)系的有效探針（李伶等，2010;晉利和李曉亮，2015）。水下調(diào)制熒光儀（Diving-pam）可以原位測定沉水植物的光合作用（Yu et al.，2010;Hussner et al.，2011）。
苦草（Vallisneria natans）為水鱉科苦草屬多年生沉水草本植物，具有較高的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值（王艷麗等，2006），再生能力強(qiáng)，廣泛應(yīng)用于水體生態(tài)修復(fù)工程（顧燕飛等，2017;Wang et al.，2009），對重金屬具有較強(qiáng)的吸收積累能力（Wang et al.，2012;Xing et al.，2013）。本研究通過不同濃度銅污染水體對苦草葉長、根長、生物量、光合色素含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響，探討苦草受脅迫后的生長狀態(tài)和光合系統(tǒng)響應(yīng)的內(nèi)在機(jī)制，以期為銅污染水體的生態(tài)修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。
1?材料與方法
1.1 材料
本研究以苦草為材料，于2017年6月初采自鄱陽湖南磯山自然保護(hù)區(qū)。將采集到的苦草去除死葉和死根，選擇長勢一致的植株，修剪為葉片長度為15 cm，根長為3 cm，輕輕洗去葉表面附著物和根部泥土。
1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
試驗(yàn)在南昌工程學(xué)院生態(tài)園內(nèi)完成。將從鄱陽湖采集到的底泥鋪于塑料方盒（長34.0 cm、寬22.5 cm、高10 cm），底泥厚8 cm，每盒均勻種植苦草12株，然后將塑料方盒放入玻璃缸（長40 cm、寬40 cm、高50 cm）內(nèi)，向缸中加入經(jīng)過晾曬的自來水至40 cm高度。預(yù)培養(yǎng)1周后，加入不同濃度的CuSO4溶液進(jìn)行處理，結(jié)合前期預(yù)處理，5種處理分別設(shè)置為0 mg·L-1對照組，0.5 mg·L-1處理組，1.0 mg·L-1處理組，1.5 mg·L-1處理組和2.0 mg·L-1處理組，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。在脅迫處理1周后，測定各參數(shù)。
1.3 測定指標(biāo)及方法
采用水下調(diào)制熒光儀（Diving-pam）和數(shù)據(jù)采集軟件Wincontrol原位測定苦草葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。每一處理組隨機(jī)取3株，用暗葉夾夾住葉片（離頂端3 cm左右），經(jīng)暗適應(yīng)20 min 后，打開葉夾，開啟檢測光，得到最小熒光（Fo），最大熒光（Fm）。PSⅡ反應(yīng)中心的最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、潛在光化學(xué)效率（Fv/Fo）、光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）、非光化學(xué)淬滅系數(shù)（qN）、有效量子產(chǎn)量[Y（Ⅱ）]、調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量[Y（NPQ）]和非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量[Y（NO）]由系統(tǒng)選定模式自動生成。
將采集的苦草用自來水將表面附著物和泥清洗干凈，用直尺測量其葉片和根的最大長度，用天平稱量鮮重，于空氣中自然風(fēng)干后稱其干重;采用丙酮萃取法測定光合色素含量（李合生，2010）;將葉片和根于烘箱中烘至恒重，用粉碎機(jī)研磨后過100目篩，采用三酸消化法（HNO3 -HF-HClO4），定容后用ICP-AES測定銅含量。
1.4 數(shù)據(jù)處理與分析
試驗(yàn)結(jié)果為3次試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的處理和制圖釆用Excel 2017軟件;用SPSS19.0軟件對不同濃度銅污染下反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較分析，P<0.05表示差異顯著;并進(jìn)行銅濃度與熒光參數(shù)的Pearson相關(guān)性分析。
2?結(jié)果與分析
2.1 銅污染對苦草生長的影響
根據(jù)試驗(yàn)所設(shè)置的5個不同濃度梯度，測定苦草的葉長、根長和生物量，分別統(tǒng)計(jì)其變化特征及相關(guān)顯著性，結(jié)果如圖1所示。銅明顯抑制了苦草的生長，葉長、根長、鮮重和干重均顯著低于對照組。2.0 mg·L-1處理組苦草葉和根的長度最低，分別為對照組的82.47%和61.10%。0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1處理組根的鮮重?zé)o顯著性差異。2.0 mg·L-1處理組苦草葉和根的鮮重最低，分別為對照組的67.73%和53.37%;干重分別為對照組的71.31%和53.37%。
2.2 銅污染對苦草葉片光合色素的影響
隨著水體銅濃度的升高，苦草葉片的葉綠素總量（Ct）、葉綠素a（Ca）、葉綠素b（Cb）、類胡蘿卜素（Cc）和葉綠素a/葉綠素b（Ca/Cb）變化趨勢一致，整體均成下降趨勢，葉片逐漸褪綠。Ct和Ca下降顯著（P<0.05），對照組和0.5 mg·L-1處理組的Cb差異不顯著（P>0.05）。葉綠素a比葉綠素b下降幅度大，其對銅脅迫更為敏感。Cc下降幅度較小，類胡蘿卜素/葉綠素總量（Cc/Ct）先降低后增加，說明Cc對脅迫不敏感。Ct、Ca、Cb、Cc、Ca/Cb與銅濃度的相關(guān)系數(shù)r分別為-0.970**，-0.969**，-0.952**，-0.864**，-0.870**，均呈極顯著負(fù)相關(guān)。
2.3 銅在苦草體內(nèi)的富集
苦草葉片中銅的富集量隨著水體銅濃度的增加而增加，處理組與對照組之間存在顯著性差異（P<0.05）。2.0 mg·L-1處理組葉片銅含量達(dá)到（5.74±1.07）mg·g-1，約為0.5 mg·L-1處理組的3.037倍;根中銅含量在各處理組間無顯著性差異（P>0.05）。
2.4 銅對苦草葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
根據(jù)實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的5個不同濃度梯度，測定苦草葉片的Fo、Fm、Fv/Fm、Fv/Fo、qP、qN、Y（Ⅱ）、Y（NO）和Y（NPQ），分別統(tǒng)計(jì)其變化特征及相關(guān)顯著性，結(jié)果如圖4、圖5、圖6所示。
最小熒光Fo指葉片經(jīng)過充分暗適應(yīng)后，光系統(tǒng)Ⅱ的反應(yīng)中心全部開放時(shí)的葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量。處理組的Fo分別為對照組的1.003、1.024、1.042、1.175倍，但差異不顯著。Fo與銅濃度呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為0.555*。處理組的Fm均小于對照組，且隨銅濃度的增加下降顯著（P<0.05）。除0.5 mg·L-1處理組與對照組差異不顯著，其它處理組的Fv/Fm均下降顯著，2.0 mg·L-1處理組僅為對照組的46.68%。Fv/Fo變化趨勢與Fv/Fm相似。當(dāng)銅濃度低于0.5 mg·L-1 時(shí)，對葉片PSⅡ反應(yīng)中心捕獲光能的效率影響不顯著。Fm、Fv/Fm、Fv/Fo與銅濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為-0.914**、-0.964**、-0.958**。
隨著銅濃度的增加，qP與qN呈相反的變化趨勢。qP下降顯著（P<0.05），2.0 mg·L-1處理組僅為對照組的54.90%;qN呈上升趨勢，2.0 mg·L-1處理組達(dá)到最大值0.608，高出對照141.3%，說明當(dāng)苦草受到銅脅迫時(shí)，為維護(hù)自身生長需要，會將越來越多天線色素吸收的光能以熱能形式耗散掉用于進(jìn)行自我保護(hù)（劉濤等，2017;錢永強(qiáng)等，2011;吳昊等，2016）。qP與銅濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為-0.982**;qN與銅濃度呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為0.894**。
有效量子產(chǎn)量Y（Ⅱ）隨著銅濃度的增加，下降顯著（P<0.05）。Y（Ⅱ）與銅濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為-0.927**。這表明苦草葉片的實(shí)際光合效率隨著銅濃度的增加而降低。隨著脅迫強(qiáng)度的增大，Y（NO）緩慢上升，Y（NPQ）也整體成上升趨勢。2.0 mg·L-1處理組Y（NO）和Y（NPQ）分別是對照組的1.66倍、4.02倍，Y（NO）和Y（NPQ）與銅濃度呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.896**、0.858**。
3?討論
重金屬脅迫對植物生長具有強(qiáng)烈的抑制作用，嚴(yán)重時(shí)會完全停止生長，出現(xiàn)不開花，不結(jié)果等現(xiàn)象（簡敏菲等，2017）。本研究表明，水體銅污染對苦草生長有顯著的抑制作用，2.0 mg·L-1處理組部分葉片脫落，生物量明顯減小，但仍能生存。而陳萍萍等（2013）認(rèn)為1.0 mg·L-1的銅對苦草生長有促進(jìn)作用，這是因?yàn)槠浞N植苦草株數(shù)比本研究大很多所致?？嗖輰︺~的富集量較大，葉片銅含量可達(dá)到（5.74±1.07）mg·g-1，屬于Cu超富集植物（Xing et al.，2013），其可以作為低濃度銅污染水體生態(tài)修復(fù)的備選物種。
重金屬對植物光合作用的影響主要是通過破壞葉綠體膜和類囊體膜的超微結(jié)構(gòu)，抑制葉綠素的合成，阻斷PSⅡ的電子傳遞，以及破壞卡爾文循環(huán)的關(guān)鍵酶等方式來降低光合效率（Seregin & Ivanov，2001）。本研究中隨著銅濃度的增加，光合色素含量顯著下降，葉片逐漸褪綠，且老葉最先褪綠，這與竹葉眼子菜遭受Cu脅迫的變化規(guī)律相一致（計(jì)汪棟等，2007）。其中Ca比Cb下降更快，Ca對Cu更敏感。Ca/Cb緩慢降低，說明類囊體的垛疊程度逐漸降低，葉片的光抑制增加（郭書奎和趙可夫，2001）。隨著銅濃度增加，葉綠素含量降低，主要原因可能是銅進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)，與葉綠體蛋白上的巰基結(jié)合（Assche & Clijsters，1990）或取代其中的Fe2+、Zn2+、Mg2+（張金彪和黃維南，2007），破壞葉綠體結(jié)構(gòu);同時(shí)，隨著銅在植物體內(nèi)的累積，它與細(xì)胞中合成葉綠素的某些酶（原葉綠素酸酯還原酶和膽色素原脫氨酶）結(jié)合（Asgharipour et al.，2011），使酶活性受阻，葉綠素合成受到抑制。
葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)已被公認(rèn)為植物抗逆研究的良好指標(biāo)之一，在正常條件下生長的植物各熒光參數(shù)比較穩(wěn)定，不會出現(xiàn)較大的波動（Roháek，2002）。重金屬對沉水植物光合作用的影響程度可以通過測定熒光值的變化來反映（李磊和黃小平，2009）。Fo的大小與PSⅡ原始激發(fā)色素密度以及反應(yīng)所處類囊體結(jié)構(gòu)狀態(tài)及葉綠素含量有關(guān)，而與光化學(xué)反應(yīng)無關(guān)（陳正勇等，2011）。在本研究中Fo略有增加，可能是銅會激發(fā)色素密度升高和內(nèi)囊體膜的改變，以適應(yīng)環(huán)境變化。Fv/Fm表示當(dāng)所有光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心處于開放態(tài)時(shí)的最大量子產(chǎn)量，該指標(biāo)可以從量子水平反映理論上植物光合能力可以達(dá)到的最大程度，脅迫條件下該參數(shù)顯著下降（許大全等，2013）。水體0.5 mg·L-1銅對苦草葉片的潛在最大光合能力影響微弱，造成的脅迫較輕。Fv/Fo常用于度量光系統(tǒng)Ⅱ的潛在活性，其對光合效率的變化很敏感。研究表明，銅、 鎘、 鉻和鋅可以在水裂解端位點(diǎn)捕捉電子流，銅很有可能通過影響水裂解端的電子流而影響PSⅡ的活性（Mallick & Mohn，2003）。
在本研究中Fv/Fo 的變化大于其他指標(biāo)，說明銅對水裂解端的影響遠(yuǎn)大于其他指標(biāo)，這與李伶等（2010）對浮萍的研究結(jié)果相類似。
光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）是將捕獲的光子能量用于光化學(xué)反應(yīng)的能力指標(biāo)，本研究中處理組的qP均低于對照組，說明銅抑制了苦草葉片光系統(tǒng)氧化側(cè)向PSⅡ反應(yīng)中心的電子流動，PSⅡ的電子傳遞活性變小，導(dǎo)致光合速率下降（邱嵐等，2018），以熱或其他形式耗散的光能增加。非光化學(xué)猝滅系數(shù)（qN）的升高意味著重金屬限制了PSⅡ的電子傳遞，導(dǎo)致還原型輔酶Ⅱ和ATP合成的下降（Janssen et al.，1992），PSⅡ吸收的光能以潛在熱形式耗散的能力增強(qiáng)，對苦草本身有保護(hù)作用。
PSⅡ反應(yīng)中心吸收的光量子主要通過光合電子傳遞、葉綠素?zé)晒饧盁嵘⑹齻€途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)化與耗散（甘龍等，2017），在脅迫環(huán)境下三者的比例會發(fā)生變化。本研究中隨著銅濃度的增加，Y（Ⅱ）所占比例最小，這與過量的Cd會直接抑制光合電子傳遞的速率，從而降低光化學(xué)途徑轉(zhuǎn)化能量的比例相類似（秦天才等，1994）。Y（Ⅱ）的下降必然會造成Y（NPQ）和Y（NO）的升高，且Y（NPQ）的上升幅度高于Y（NO），說明葉片中銅的積累對苦草造成了傷害，迫使其通過調(diào)節(jié)自身來抵御外界環(huán)境所帶來的傷害，且脅迫強(qiáng)度越大，苦草的響應(yīng)越大。這與重度脅迫下植物對光能的利用減弱，并以增加調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量的方式來消耗過多的熱量來保護(hù)自身（吳昊等，2016）相穩(wěn)合。
4?結(jié)論
（1）水體銅污染對苦草的生長、光合素含量有明顯的抑制作用，且銅對葉綠素a的破壞作用強(qiáng)于葉綠素b。（2）銅會抑制苦草PSⅡ反應(yīng)中心的光合活性，限制電子傳遞;其可通過自身調(diào)節(jié)以熱的形式將過剩光能耗散，減輕PSⅡ中心受傷害的程度。（3）苦草對銅有較強(qiáng)的富集能力，在銅濃度低于0.5 mg·L-1的水環(huán)境中苦草具有正常的光合活性，2.0 mg·L-1超出了苦草的忍受范圍，可推測將苦草用于低濃度銅污染水體的生態(tài)修復(fù)，濃度閾值尚需更多研究來進(jìn)一步論證。
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