苯甲酰烏頭原堿對人肺癌A549細胞自噬和凋亡的影響

邵鑫 韓彬 蔣先虹 黎風 何梅 劉福

中圖分類號 R734.2;R96 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）20-2782-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.20.10

摘 要 目的：研究苯甲酰烏頭原堿（BAC）對人肺癌A549細胞自噬和凋亡的影響，探討其用于非小細胞肺癌治療的作用機制。方法：采用不同劑量的BAC（10、50、100、200、400 μmol/L）分別對A549細胞進行處理后，觀察細胞的形態(tài)變化，并采用CCK-8法測定細胞的增殖抑制率。將細胞分為對照組（不加藥物）和BAC低、高劑量組（200、400 μmol/L），分別加入相應(yīng)藥物處理后，采用流式細胞術(shù)測定細胞凋亡率，采用聚合酶鏈式反應(yīng)法和Western blotting測定細胞中凋亡相關(guān)因子B淋巴細胞瘤因子2（Bcl-2）、Bcl-2凋亡相關(guān)X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）和自噬相關(guān)因子Beclin1、LC3、P62的基因及蛋白表達水平。結(jié)果：采用不同劑量的BAC處理后，細胞出現(xiàn)皺縮、排列稀疏、溶解等現(xiàn)象，BAC 100、200、400 μmol/L劑量組細胞增殖抑制率顯著升高（P<0.05或P<0.01）。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，BAC低、高劑量組細胞凋亡率分別在藥物作用24、48 h時有不同程度的上升，且該促凋亡作用具有劑量、時間依賴趨勢。與對照組比較，BAC各劑量組細胞中Bcl-2、P62的mRNA和蛋白表達水平均有不同程度的降低，Bax、Caspase-3、Beclin1、LC3的mRNA和Bax、Active Caspase-3、P62、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表達水平均有不同程度的升高，其中BAC低劑量組Caspase-3的mRNA和Bcl-2、Active Caspase-3、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表達水平，以及BAC高劑量組各目標基因的mRNA和蛋白的表達水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），且上述影響均呈劑量依賴趨勢。結(jié)論：BAC可抑制A549細胞的增殖、促進其凋亡，并且能促進Beclin1、LC3（LC3Ⅱ/Ⅰ）、Bax、Caspase-3（Active Caspase-3）表達和抑制P62、Bcl-2等自噬/凋亡相關(guān)基因及蛋白的表達;其機制可能與BAC通過促進細胞發(fā)生過度自噬從而導(dǎo)致細胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞 苯甲酰烏頭原堿;非小細胞肺癌;A549細胞;增殖;自噬;凋亡

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of benzoyl aconitine （BAC） on autophagy and apoptosis of human lung cancer A549 cells， and to investigate its mechanism in anti-non-small cell lung cancer. METHODS： A549 cells were treated with different doses of BAC （10， 50， 100， 200， 400 μmol/L）， and then cell morphology was obtained; the proliferation inhibition rate of the cell was determined by CCK-8 assay. The cells were divided into control group （without drug）， BAC low-dose and high-dose groups （200， 400 μmol/L）. After treated with relevant drugs， the apoptosis rate of cells was determined by flow cytometry. The gene and protein expression of apoptosis-related factors Bcl-2， Bax， Caspase-3 as well as autophagy-related factors Beclin1， LC3， P62 were determined by RT-PCR and Western blotting assay. RESULTS： After treated with different doses of BAC， the cells were shrunken and sparsely arranged; inhibitory rate of cell proliferation was increased significantly in BAC 100， 200， 400 μmol/L groups （P<0.05 or P<0.01）. Results of flow cytometry showed that the apoptotic rates of cells were increased to different extents in BAC low-dose and high-dose groups after treated for 24 and 48 h， in a concentration and time-dependent manner. Compared with control group， mRNA and protein expression of Bcl-2 and P62 were decreased to different extents in BAC groups; mRNA expression of Bax， Caspase-3， Beclin1 and LC3 as well as protein expression of Bax， Active caspase-3， P62， Beclin1， LC3Ⅱ/Ⅰ were increased to different extent; there was statistical significance in mRNA expression of Caspase-3， and protein expression of Bcl-2， Active Caspase-3， Beclin1， LC3Ⅱ/Ⅰ and P62 in BAC low-dose group as well as all target mRNA and protein expression in BAC high-dose group （P<0.05 or P<0.01）， in dose-dependent manner. CONCLUSIONS： BAC can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of A549 cells， promote Beclin1， LC3（LC3Ⅱ/Ⅰ），Bax and Caspase-3 （Active Caspase-3） gene and their protein expression， but inhibit P62 and Bcl-2 gene and their protein expression. The mechanism may be related to BAC inducing apoptosis by promoting excessive autophagy of cells.

KEYWORDS? ?Benzoyl aconitine; Non-small cell lung cancer; A549 cells; Proliferation; Autophagy; Apoptosis

肺癌是全球發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）患者約占肺癌病例總數(shù)的80%，且其發(fā)病隱匿、預(yù)后不良，約75%的NSCLC患者被確診時已到晚期，總體5年生存率僅為20%[1-2]。自噬是細胞內(nèi)蛋白降解的主要途徑之一，是一種“自食”過程，其通過自噬-溶酶體途徑將細胞質(zhì)蛋白、復(fù)合物或細胞器吞入自噬體，然后使自噬體進入晚期內(nèi)體中，或者將自噬體轉(zhuǎn)運至溶酶體融合以產(chǎn)生自溶酶體，然后通過酸性水解酶釋放使自噬體降解[3-4]。有研究報道，誘導(dǎo)自噬可抑制人肺癌A549細胞的增殖、促進其凋亡[5-6]。

近年來的研究顯示，從植物藥中提取的許多天然單體成分已表現(xiàn)出抗腫瘤活性，而多種中藥配方及其提取物更已被證實對NSCLC具有可靠的治療效果[7-9]。烏頭類中藥在臨床應(yīng)用廣泛，具有抗炎、降血壓和抗腫瘤等活性，臨床上常用來治療風濕性關(guān)節(jié)炎、高血壓、腫瘤等多種疾病[10]。苯甲酰烏頭原堿（Benzoyl aconitine，BAC）是主要存在于制川烏、草烏和附子等中藥中的活性單體，其分子式為C32H45NO10，分子量為603.705（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1）。已有研究證實，BAC能有效抑制人胎盤絨膜癌BeWo細胞生長[11]，但其對NSCLC細胞增殖和凋亡的影響少見報道。因此，本課題組以人肺癌A549細胞為研究對象，考察BAC對該細胞增殖與凋亡的影響，并根據(jù)凋亡相關(guān)因子B淋巴細胞瘤因子2（Bcl-2）、Bcl-2凋亡相關(guān)X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）和自噬相關(guān)因子Beclin1、LC3、P62的基因及蛋白表達水平的變化，從自噬途徑探索BAC可能的抗腫瘤分子機制，為中藥活性單體用于NSCLC的治療提供新思路和新靶點。

1 材料

1.1 儀器

Heal Force型超凈工作臺、HF90型CO2培養(yǎng)箱（上海力新儀器有限公司）;MLS-3020型高壓蒸汽滅菌器（日本Sanyo公司）;DMi8型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;BDFACS AriaⅢ型流式細胞儀（美國Becton Dickinson公司）;Pultton P200+型超微量紫外分光光度計（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）;BL-150型電子天平（德國Sartorius公司）;7900 Real-Time型聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）儀（美國ABI公司）。

1.2 藥品與試劑

BAC對照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-17102610，純度：98.9%）;RPMI-1640培養(yǎng)基、青-鏈霉素（美國 Hyclone 公司）;胎牛血清、胰酶、二甲基亞砜（DMSO）（美國Gibco公司）;CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）;Bcl-2、Bax、Caspase-3、Beclin1、LC3、P62、β-肌動蛋白（β-actin）引物（生工生物工程上海股份有限公司）;Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）;Trizol試劑（北京索萊寶科技有限公司）;Transcription Kit Quanti Nova逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國Qiagen公司）;BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）;RIPA蛋白裂解液（上海碧云天生物科技有限公司）;兔抗人Bcl-2單克隆抗體、兔抗人Active Caspase-3單克隆抗體、兔抗人LC3單克隆抗體（杭州華安生物科技有限公司）;兔抗人Bax單克隆抗體、兔抗人Beclin1單克隆抗體、兔抗人P62單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司）;鼠抗人β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG二抗、HRP標記的羊抗鼠IgG二抗（成都ZenBioScience公司）;ECL化學(xué)發(fā)光液（合肥市Biosharp生物公司）;磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）、 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS- PAGE）凝膠、電泳液、轉(zhuǎn)膜液、PBST緩沖液、封閉液等試劑均為自行配制;水為超純水。

1.3 細胞

人肺癌A549細胞由川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風濕免疫研究所賈艾敏研究員饋贈，購自美國模式菌種收集中心（ATCC）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將A549細胞接種于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基（即完全培養(yǎng)基，下同），置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長至融合時，以胰酶消化后進行預(yù)培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)期時，進行后續(xù)試驗。

2.2 BAC對A549細胞形態(tài)的影響考察

取對數(shù)生長期細胞，加入含BAC分別為0（即不加藥物，對照組）、10、50、100、200、400 μmol/L（均以終濃度計，給藥劑量按預(yù)試驗結(jié)果制定，下同）的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基100 μL。各組細胞于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)是否出現(xiàn)皺縮、變小、排列疏松等情況，以判斷BAC是否對細胞產(chǎn)生促凋亡作用。每組設(shè)置3個復(fù)孔，試驗均重復(fù)3次。

2.3 BAC對A549細胞增殖的影響考察

采用CCK-8法檢測細胞增殖率。取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化，以800 r/min離心5 min后，用完全培養(yǎng)基調(diào)整密度至5×104個/mL，接種100 μL于96孔板;另設(shè)空白組，加入等體積完全培養(yǎng)基（不加入細胞）。各組細胞于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁成形后棄去原培養(yǎng)基，加入含BAC分別為0（對照組）、10、50、100、200、400 μmol/L（給藥劑量按預(yù)試驗結(jié)果制定）的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h;棄去原培養(yǎng)基，加入含10%CCK-8試劑的無血清培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后采用酶標儀于570 nm波長處測定各孔吸光度（OD）。按公式計算細胞增殖抑制率：增殖抑制率（%）=（對照組細胞OD值-給藥組細胞OD值）/（對照組細胞OD值-空白組OD值）×100%。同時，按同樣的操作方法，設(shè)置對照組（不含BAC）和BAC低、高劑量組（200、400 μmol/L;根據(jù)上述不同劑量組的增殖抑制率結(jié)果，并考慮藥物效果及細胞毒性制定，下同），同法培養(yǎng)24、48、72 h后，分別檢測各孔OD值并計算細胞增殖抑制率。每組設(shè)置3個復(fù)孔，試驗均重復(fù)3次。

2.4 BAC對A549細胞凋亡的影響考察

采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化，以800 r/min離心5 min后，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至1×105個/mL，接種2 mL于6孔板，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合率約為60%時棄去原培養(yǎng)液。將細胞分為對照組（不含BAC）和BAC低、高劑量組（200、400 μmol/L;劑量根據(jù)“2.3”項下考察結(jié)果制定，下同），加入含相應(yīng)濃度BAC的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基2 mL，繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48 h后，加入0.25%不含EDTA的胰酶消化。收集各組細胞，4 ℃下以800 r/min離心5 min;棄去上清，以PBS漂洗2次后，再以PBS 500 μL重懸細胞并計數(shù)。每組取1×106個細胞，先后加入AnnexinV-FITC、PI染色試劑各5 μL，混勻，在冰上避光孵育15 min后，在1 h內(nèi)采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。采用FlowJo V10軟件進行數(shù)據(jù)采集及處理。每組設(shè)置3個復(fù)孔，試驗均重復(fù)3次。

2.5 BAC對A549細胞中相關(guān)凋亡基因和自噬基因表達的影響考察

采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（RT- qPCR）法檢測各目標基因表達水平。取對數(shù)生長期細胞，按“2.4”項下方法分為對照組和BAC低、高劑量組（200、400 μmol/L），加入含相應(yīng)濃度BAC的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基 2 mL，同法培養(yǎng)48 h。采用Trizol試劑提取各組細胞總RNA，并以紫外分光光度法檢測RNA的濃度及純度。然后以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用PCR儀檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、Beclin1、P62、LC3基因的表達水平。按相應(yīng)試劑盒說明書操作（反應(yīng)體系共20 μL），擴增程序為：95 ℃預(yù)變性 2 min;95 ℃反應(yīng) 5 s，60 ℃退火及延伸 14 s，40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法[12]計算各目標基因mRNA的表達水平。每組設(shè)置3個復(fù)孔，試驗均重復(fù)3次。引物序列見表1。

2.6 BAC對A549細胞中相關(guān)凋亡蛋白和自噬蛋白表達的影響考察

采用Western blotting法檢測各目標蛋白表達水平。取對數(shù)生長期細胞，按“2.5”項下方法分組和給藥，提取總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量。取適量總蛋白，以PBS稀釋至相同濃度后，加入5×Loading buffer上樣緩沖液，在90 ℃金屬浴條件下變性10 min，于-20 ℃保存，待用。分別取上述變性蛋白樣品50 μg，以β-actin為內(nèi)參，在80 V條件下進行SDS-PAGE凝膠電泳90 min，以200 mA濕法轉(zhuǎn)膜80 min，放入含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液中室溫封閉1 h;然后分別加入β-actin、Bcl-2、Bax、Active Caspase-3、Beclin1、P62、LC3的相應(yīng)一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），于4 ℃孵育過夜;次日于常溫脫色搖床上繼續(xù)孵育1 h復(fù)溫，PBST緩沖液洗膜10 min×3次;然后根據(jù)一抗的種屬，兔源的Bcl-2、Bax、Active Caspase-3、Beclin1、P62、LC3加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗、鼠源的β-actin加入HRP標記的羊抗鼠IgG二抗（稀釋度均為1 ∶ 10 000），然后于室溫下脫色搖床孵育1 h;PBST洗膜10 min×3次，在凝膠成像儀中采用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色。采用Image J 1.52a軟件對蛋白條帶進行圖像分析，以β-actin為內(nèi)參計算相對灰度值，用來表示蛋白表達水平。每組設(shè)置3個復(fù)孔，試驗均重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理。計量資料以x±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 BAC對A549細胞形態(tài)的影響

鏡下可見，對照組細胞呈三角形、梭形或不規(guī)則形等，很少見到漂浮的細胞，細胞質(zhì)較為豐富，細胞核清晰可見;隨著BAC濃度增大，BAC各劑量組細胞開始出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，以BAC 200、400 μmol/L組尤為明顯，細胞排列稀疏、細胞間連接較松散，并出現(xiàn)漂浮細胞，貼壁細胞基本無完整的細胞核及細胞質(zhì)，多數(shù)細胞已開始溶解，詳見圖2。

3.2 BAC對A549細胞增殖的影響

與對照組比較，BAC 10、50 μmol/L劑量組細胞增殖抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義;BAC 100、200、400 μmol/L劑量組細胞增殖抑制率均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），且劑量越高，其對細胞增殖的抑制率越高，結(jié)果見表2。這表明BAC對細胞的增殖抑制作用呈劑量依賴趨勢。

與對照組比較，BAC低、高劑量組細胞增殖抑制率均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），且作用時間越長，其對細胞增殖的抑制率越高，結(jié)果見表3。這表明BAC對細胞的增殖抑制作用呈時間依賴趨勢。

3.3 BAC對A549細胞凋亡的影響

與對照組比較，BAC低、高劑量組細胞凋亡率均分別在藥物作用24、48 h時有不同程度的上升，且隨著BAC劑量增加和作用時間的延長，細胞凋亡率呈上升趨勢，提示該促凋亡作用具有劑量、時間依賴趨勢;其中，BAC低劑量組細胞的早期、晚期凋亡率（作用48 h時）以及BAC高劑量組細胞的早期、晚期凋亡率（作用24、48 h時）差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。流式細胞圖見圖3（注：圖中Q1象限代表機械性死亡細胞，Q2象限代表晚期凋亡細胞，Q3象限代表早期凋亡細胞，Q4象限代表活細胞），凋亡率檢測結(jié)果見表4。

3.4 BAC對A549細胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Beclin1、LC3、 P62 mRNA表達的影響

與對照組比較，BAC各劑量組細胞中Bcl-2、P62的mRNA表達水平均有不同程度的降低，Bax、Caspase-3、Beclin1、LC3的mRNA表達水平均有不同程度的升高，且隨BAC劑量的增加，上述基因mRNA表達水平的下降或上升越明顯，提示該影響作用具有劑量依賴趨勢;其中，BAC低劑量組Caspase-3的mRNA表達水平以及BAC高劑量組各目標基因的mRNA表達水平與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。各目標基因mRNA表達水平檢測結(jié)果見表5。

3.5 BAC對A549細胞中Bcl-2、Bax、Active Caspase-3、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表達的影響

與對照組比較，BAC各劑量組細胞中Bcl-2、P62蛋白表達水平均有不同程度的降低，Bax、Active Caspase-3、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ（LC3Ⅱ和LC3Ⅰ分別為LC3蛋白的兩種表現(xiàn)形式，此處即兩者蛋白表達水平之比，下同）蛋白表達水平均有不同程度的升高，且隨著BAC劑量的增加，上述蛋白表達水平的下降或上升越明顯，提示該影響作用具有劑量依賴趨勢;其中，除BAC低劑量組Bax蛋白外，其余各組目標蛋白表達水平與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。各目標蛋白表達水平檢測結(jié)果見圖4、表6。

4 討論

BAC為單酯型生物堿，主要存在于烏頭屬植物中[13]，具有抗腫瘤活性，可抑制人胎盤絨膜癌細胞和心肌細胞等的生長，促進細胞凋亡[11，14]。本研究結(jié)果顯示，BAC能顯著影響人肺癌A549細胞的正常生長形態(tài)，隨著BAC劑量的增加，A549 細胞開始出現(xiàn)皺縮、變小、溶解等現(xiàn)象。進一步通過CCK-8試驗證實，BAC能明顯抑制A549 細胞的增殖，且呈劑量和時間依賴趨勢，其中以 200、400 μmol/L劑量作用于細胞48 h后該抑制作用尤為明顯，細胞增殖抑制率分別達（28.96±4.90）%、（51.69±5.48）%以上。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，BAC能引起A549細胞的凋亡，且隨著藥物劑量的增加，細胞早期和晚期凋亡率均逐漸增加，且呈劑量和時間依賴趨勢。

自噬是不同于凋亡和壞死的一種細胞死亡方式，與細胞生長、凋亡、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)[15]。Beclin1為自噬的正調(diào)節(jié)因子，同時也是自噬起始的重要因子[16]。LC3是自噬的標志性因子，也為正調(diào)節(jié)因子，其存在LC3Ⅰ、LC3Ⅱ兩種形式，當自噬被激活時，LC3Ⅰ發(fā)生脂質(zhì)化形成LC3Ⅱ，因此LC3Ⅱ蛋白表達的增加可作為自噬激活的標志[17]。P62是一種在細胞質(zhì)中合成的位于細胞核的蛋白，當自噬被激活時，P62首先會與泛素化蛋白磷脂酰乙醇胺相結(jié)合，再與自噬體膜上的LC3Ⅱ結(jié)合形成復(fù)合物，進入到自噬體后最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體從而被清除，是評價自噬體降解的重要指標[18-19]。當自噬流被活化時，P62水平會下降;自噬流被抑制時，P62水平則會增加[20]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)不同劑量BAC（200、400 μmol/L）作用48 h后，A549細胞中Beclin1、LC3（LC3Ⅱ/Ⅰ）的mRNA及蛋白表達水平均有不同程度的升高，P62的mRNA及蛋白表達水平則均有不同程度的降低，且呈劑量依賴趨勢。這表明BAC可誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生自噬，并可能具有劑量相關(guān)性。

有研究表明，抑制自噬有利于NSCLC細胞成活、減少其凋亡，從而促進早期肺癌的發(fā)展，而誘導(dǎo)自噬則可導(dǎo)致NSCLC細胞凋亡增加[21-22]。自噬參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程并非是一個獨立作用，而需要與各通路相互作用，尤其與凋亡途徑的關(guān)系最為密切[23]。凋亡是由基因控制的一種細胞的程序性死亡，其病理生理的主要表現(xiàn)為細胞核皺縮、染色體聚集和凋亡小體的形成[24]。Bcl-2是與凋亡關(guān)系最密切的抗凋亡基因，Bax則是與Bcl-2作用相對抗的促凋亡基因，在細胞凋亡的兩種信號傳導(dǎo)途徑中，Bcl-2/Bax基因的比值是啟動凋亡的重要分子開關(guān)[25-26]。Bcl-2/Bax基因能夠通過線粒體途徑調(diào)節(jié)Caspase-3基因的活性，繼而調(diào)節(jié)細胞凋亡過程[27]。Caspase-3是細胞凋亡過程中主要的終末剪切酶和最重要的凋亡執(zhí)行者，Active Caspase-3蛋白是Caspase-3蛋白的活化形式，當?shù)蛲霭l(fā)生時，Caspase-3蛋白發(fā)生活化，增加的Active Caspase-3可特異性地切割DNA，促使染色質(zhì)凝固和核酸激活，導(dǎo)致細胞凋亡[28]。因此，Active Caspase-3蛋白表達水平是反映細胞發(fā)生凋亡的標志之一。本研究結(jié)果顯示，不同劑量BAC（200、400 μmol/L）作用48 h 后，A549細胞中Bax、Caspase-3（Active Caspase-3）的mRNA及其蛋白表達水平均有不同程度的升高，Bcl-2的mRNA及其蛋白表達水平均有不同程度的降低，且呈劑量依賴趨勢。這表明BAC可誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生凋亡，并可能具有劑量相關(guān)性。

綜上所述，BAC可抑制肺癌A549細胞的增殖、促進其凋亡，并且能促進Beclin1、LC3（LC3Ⅱ/Ⅰ）和抑制P62等自噬相關(guān)基因及蛋白的表達，促進Bax、Caspase-3（Active Caspase-3）和抑制Bcl-2等凋亡相關(guān)基因及蛋白的表達;其作用機制可能與BAC通過促進A549細胞發(fā)生過度自噬從而導(dǎo)致細胞凋亡有關(guān)。本研究可為肺癌尤其是NSCLC的臨床治療提供新的靶點和思路。后續(xù)本課題組將聯(lián)合應(yīng)用自噬促進劑或抑制劑從細胞和動物兩方面進行體內(nèi)外研究，進一步深入研究BAC對自噬和凋亡的調(diào)控機制。

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（收稿日期：2019-04-14 修回日期：2019-08-03）

（編輯：段思怡）