Nox4在同型半胱氨酸介導的動脈粥樣硬化中作用的研究

李慧丹 趙文鴿 王學惠

摘要：同型半胱氨酸（Hcy）是心血管疾病的獨立危險因子之一。Hcy能夠誘導細胞活性氧（ROS）的生成增多引起內(nèi)皮損傷從而導致動脈粥樣硬化（AS）發(fā)生發(fā)展。內(nèi)皮細胞中ROS主要來源于Nox4（NADPH oxidases 4）。NLRP3在冠狀動脈粥樣硬化及主動脈硬化中高表達。NLRP3是AS中IL-1家族細胞因子產(chǎn)生的關鍵介質(zhì)，特別是當細胞內(nèi)產(chǎn)生的大量ROS，可導致caspase-1前體大量剪切成具有生物活性的caspase-1 P10片段，推動下游IL-1β和IL-18等炎癥因子的成熟及分泌，使內(nèi)皮細胞功能受損，引起細胞炎癥損傷及凋亡，正反饋加重血管損傷。本文主要探討Nox4在Hcy介導的內(nèi)皮細胞炎癥及凋亡的作用，Hcy導致的AS提供可能的機制。

關鍵詞：同型半胱氨酸;動脈粥樣硬化;Nox4;NLRP3

中圖分類號：R543.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.15.015

文章編號：1006-1959（2019）15-0045-03

Abstract：Homocysteine （Hcy） is one of the independent risk factors for cardiovascular disease. Hcy can induce the increase of cellular reactive oxygen species （ROS） to cause endothelial damage leading to the development of atherosclerosis （AS）. ROS in endothelial cells are mainly derived from Nox4 （NADPH oxidases 4）. NLRP3 is highly expressed in coronary atherosclerosis and aortic sclerosis. NLRP3 is a key mediator of IL-1 family cytokine production in AS， especially when a large amount of ROS produced in cells can cause a large amount of caspase-1 precursor to be cleaved into a biologically active caspase-1 P10 fragment，promote the maturation and secretion of downstream inflammatory factors such as IL-1β and IL-18， impair endothelial cell function， cause cell inflammatory damage and apoptosis， and positive feedback aggravates vascular injury. This study focuses on the role of Nox4 in Hcy-mediated endothelial cell inflammation and apoptosis， and Hcy-induced AS provides a possible mechanism.

Key words：Homocysteine;Atherosclerosis;Nox4;NLRP3

隨著社會進步以及人口老齡化，急性心血管事件的發(fā)生率在逐年增加，成為威脅人類健康的頭號殺手。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是體內(nèi)蛋氨酸代謝循環(huán)途徑中形成的一種含硫氨基酸，是蛋氨酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，機體不能自身合成，主要來源于蛋氨酸中間代謝，當機體內(nèi)維生素B12和葉酸的代謝功能紊亂和胱硫醚-β-合成酶的功能不全或功能缺陷，導致Hcy血癥及動脈粥樣硬化 （atherosclerosis，AS），臨床上主要靠口服葉酸及維生素B12降低體內(nèi)Hcy水平。各種臨床實驗及流行病學研究表明，Hcy是心血管疾病的獨立危險因子[1]。本文主要探討Nox4在Hcy介導的內(nèi)皮細胞炎癥及凋亡的作用，Hcy導致的AS提供可能的機制。

1同型半胱氨酸與動脈粥樣硬化

AS是缺血性心腦血管病的病理學基礎，多因素引起的血管慢性炎癥性疾病。Hcy是動脈粥樣硬化性心血管疾病的獨立危險因素。中度，甚至輕度的高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy）就能使AS的危險性增加。血漿Hcy水平升高原因有很多，包括：原位基因突變：CBS基因缺陷的純合體可以導致血漿中Hcy的水平升高，5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因缺陷是葉酸代謝中最常見的遺傳性疾病，突變后此酶的活性及功能明顯下降，最終導致血漿Hcy濃度的升高。另外有營養(yǎng)和飲食、年齡、性別因素等[2]。近些年來大量的動物實驗、流行病學調(diào)查及臨床試驗表明，血漿Hcy水平升高是心腦血管疾病及各種原因死亡風險增加的獨立危險因素[3]。

目前的研究已經(jīng)證實Hcy導致動脈粥樣硬化基本機制包括：Hcy可以對LDL進行氧化修飾后促進血管平滑肌細胞增殖和引起血管內(nèi)皮損傷;促進氧化自由基的形成，抑制NO的形成及釋放，使內(nèi)皮依賴的血管舒張反應明顯減弱;縮短血小板的存活期，提高其黏附性與聚集性，使血栓的發(fā)生率大大提高，容易造成冠狀動脈堵塞;Hcy使血栓素B合成增加，其縮血管和促進血小板聚集的作用均可加速動脈粥樣硬化和血栓疾病的發(fā)生[4]。

Hcy自身結構具有特殊性，結構中含有高活性巰基，自氧化致使產(chǎn)生炎癥反應，致使細胞內(nèi)可產(chǎn)生大量的ROS，及其下游一系列應激反應（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、氧化應激、甲基化等），破壞內(nèi)皮細胞間完整性及銜接性，致使巨噬細胞釋放炎癥因子，血栓素形成，最終可導致動脈斑塊形成[5]。

2 NLRP3炎癥小體在Hcy導致的動脈粥樣硬化中的作用

目前對AS的保守治療主要集中在降低血漿膽固醇水平，但這種治療只是為了降低所有患者未來心血管事件的風險[6]。然而，動脈粥樣硬化在變態(tài)反應性疾病中被越來越多地認為是一種慢性疾病，這為血管的新治療方法鋪平了道路[7]。最新的研究發(fā)證明用單克隆的IL-1β抗體治療可以降低心臟病發(fā)作患者復發(fā)心血管事件的風險。鑒于這一試驗的積極結果，通過對炎癥假說的起源和影響的回顧，探討NLRP3（NOD [nucleotide oligomerization domain]- LRR [leucinerich repeat]- PYD[pyrin domain]-containing protein 3）和白細胞介素-1家族細胞因子在AS形成中的影響[8]。NLRP3在冠狀動脈粥樣硬化及主動脈硬化中高表達，并且直接與疾病嚴重程度及多種臨床危險因素有關，包括吸煙、高血壓、糖尿病、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白、膽固醇[9]。

炎癥免疫反應是心血管疾病的重要發(fā)病機制，炎癥小體在炎癥免疫中處于核心地位，在機體許多炎癥性反應中都有著很重要的作用。所有NLR家族，主要通過釋放受體敏感配體結合蛋白（ACP）從其抑制物（ACK）中釋放ROS-敏感配體相互作用蛋白（ACP），使其產(chǎn)生的DAMPs（Danger associated molecular patterns）、IL家族、PAMPs（Pathogen-associated molecular patterns），介導細胞炎癥及凋亡[10]。ROS抑制劑能夠明顯降低Hcy誘導的足細胞NLRP3炎癥小體成分NLRP3、caspase-1、ASC（Apoptosis-associated speck-like protein containing CARD）的表達及NLRP3與caspase-1、NLRP3與ASC的共定位形成，且能夠顯著抑制Hcy介導的足細胞培養(yǎng)上清中IL-1β的表達和分泌，說明Hcy可引起血管內(nèi)皮細胞炎癥反應，激活炎癥小體及炎癥反應受體，其中NLRP3在該反應中起到非常重要的角色[11，12]。

用氧化酶抑制劑處理巨噬細胞，Hcy誘導巨噬細胞內(nèi)ROS水平的增加，NAC預處理后，ROS減少Hcy誘導的NLRP3炎癥小體成分的表達與共定位減少，細胞培養(yǎng)上清IL-1β、IL-18減少，從而調(diào)節(jié)炎癥反應機制，減輕炎癥損傷，抑制細胞凋亡及焦亡[13]。因此在近幾年Hcy的致病機制，探討NLRP3與Hcy的相關機制及信號通路逐漸成為目前研究的熱點。

3 Nox4在Hcy導致的AS中的作用

NADPH氧化酶（NADPH oxidases，Nox）是一特殊的產(chǎn)生ROS的酶類家族，它們通過催化電子從NADPH轉移到分子氧而產(chǎn)生O2-和H2O2[14]。目前已鑒定出7種亞型（Nox1-5，Duox1-2），其中Nox2為經(jīng)典的gp91phox，是中性粒細胞進行吞噬作用所必需的[15]。研究證實Nox與AS的發(fā)生、AS病灶的嚴重程度密切相關。各種內(nèi)源性危險因子刺激下，Nox活性增加，ROS產(chǎn)生過多，導致氧化損傷，ROS通過各種信號傳導途徑，參與血管壁細胞的各種病理生理過程，如血管平滑肌細胞增殖，影響血管內(nèi)皮的舒縮功能，激活的血管內(nèi)皮炎性免疫反應及一系列細胞功能改變等，從而參與AS的發(fā)生和發(fā)展[16]。

Hcy引起的內(nèi)皮損傷中，檢測Nox1、Nox2、Nox4、Nox5的表達量，Nox1、Nox5幾乎檢測不到，而主要檢測的到是Nox2和Nox4，但是加入Nox2的抑制劑，并不能引起內(nèi)皮損傷的改變，只有加入Nox4的抑制劑才能引起細胞炎癥因子的改變，說明在Hcy引起的內(nèi)皮損傷中，Nox4的表達扮演著非常重要的作用[17]。Nox2主要表達在細胞膜，它的激活受蛋白翻譯后機制的急性調(diào)控，比如漿細胞亞單位P44phox的磷酸化和Rac1向細胞膜的移位。高酯、高糖、血管緊張素、細胞因子、生長因子、機械刺激等都可激活Nox2。Nox2產(chǎn)生O2-并易于和NO作用使之失活[14]。最近對動物的研究表明，在不同的疾病模型中，ROS的產(chǎn)生通常是保護性的，盡管這種酶的致病作用也已經(jīng)被證實?；蜃C據(jù)表明，P22phox是NADPH氧化酶的重要組，實驗研究也證明了其生物活性的存在[18]。此外，在非特異性表達系統(tǒng)中，Nox4和Nox1的活性都是通過共同表達的P22phox被激活的。最早的研究認為，敲除p22phox亞基對NLRP3炎性小體激活起到抑制作用，而3種Nox復合物（Nox1、Nox2、Nox4）所特有的亞基缺乏的巨噬細胞對激活炎癥因子應答較差[19]，認為NLRP3的激活可能是p22phox依賴性的過程在或者Nox存在功能冗余。

Nox4調(diào)節(jié)特定的信號通路和細胞的功能，依賴于Nox4的表達水平、細胞的位置以及細胞類型。Nox4-/-基因敲除的小鼠，在血壓（全身和肺部）、心臟功能、內(nèi)皮依賴的血管舒縮功能、腦血流量和腎功能方面與野生型小鼠沒有差異。然而在眾多心血管疾病，如高血壓、動脈粥樣硬化、肺和心肌纖維化、心衰、應激和糖尿病中表達量增加。因此，在沒有疾病刺激的條件下，Nox4-/-沒有表現(xiàn)出異常，如在血壓方面[20]。Nox4是一種誘導型Nox，在面對各種刺激時，它的表達水平是一個動態(tài)反應過程，目前還沒有完全了解Nox4的病理及生理作用。

4 Nox4是否通過NLRP3信號通路參與Hcy誘導的內(nèi)皮細胞凋亡

NADPH復合物最初被發(fā)現(xiàn)負責在細胞呼吸爆發(fā)期間產(chǎn)生ROS，但現(xiàn)在已經(jīng)清楚地發(fā)現(xiàn)，在其他類型的細胞中，Nox衍生的ROS也參與了細胞信號傳遞。Nox1～4均有一個重要的功能亞基P22phox，其為重要的功能亞基，若加入P22phox抑制劑，幾乎檢測不到相應蛋白的表達，及下游限號同路的激活，特別NLRP3炎癥小體的激活，認為此激活過程是獨立于Nox4的P22phox依賴的過程[21]。

內(nèi)皮細胞的ROS主要來源于Nox4，任何來源的ROS均可以激活NLRP3炎癥小體，參與炎癥反應[1，20]。最早的研究鑒定激活NLRP3的ROS來源，加入ROS的抑制劑，可抑制NLRP3炎癥小體的激活，加入特異性的Nox的抑制劑，并不能很好的引起NLRP3蛋白表達水平的改變。隨著近年來關于Nox4研究的深入，對于Nox4的功能及其參與介導的信號通路，有了新的進展，讓我們開始重新探討Nox4在Hcy介導的內(nèi)皮損傷及凋亡中作用，以及Nox4是否通過NLRP3信號通路參與Hcy誘導的內(nèi)皮細胞的凋亡。有研究另外NLRP3蛋白沉默以后，Nox4蛋白表達水平也受到抑制，猜測NLRP3和Nox4之間可能存在著一種特殊交互作用，且caspase-1的抑制劑對Nox4蛋白表達影響不明顯[22]。在炎癥激活過程中，特別是Hcy誘導的內(nèi)皮細胞氧化應激及調(diào)亡過程中，Nox4的表達增加，參與了NLRP3炎癥小體復合物激活。Nox4在Hcy介導的內(nèi)皮損傷及凋亡中，扮演著非常重要的作用[9]。

5總結

Hcy是心血管疾病的獨立危險因素，其可以增強血管炎癥反應，加速動脈粥樣硬化的進程。血漿Hcy水平升高引起心血管疾病的發(fā)病機制尚不完善清楚，依然是目前研究的熱點。巨噬細胞中Hcy能夠激活 NLRP3炎癥小體，同時誘導IL-1β、IL-18的合成及胞外分泌，促進ASC、NLRP3和caspase-1的表達增多。在Hcy介導的內(nèi)皮細胞損傷模型中，Nox4可能起決定性作用，阻斷Nox4可能是抑制Hcy誘導的內(nèi)皮細胞氧化損傷的關鍵靶點，為HHcy血癥導致的血管內(nèi)皮損傷提供新的理論基礎。

參考文獻：

[1]Wen H，Gris D，Lei Y，et al.Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling[J].Nature immunology，2011，12（5）：408-415.

[2]Pushpakumar S，Kundu S.Endothelial dysfunction：the link between homocysteine and hydrogen sulfide[J].Current Medicinal Chemistry，2014，21（32）：3662-3672.

[3]劉鵬，高學良，原建華，等.H型高血壓患者血清同型半胱氨酸水平與冠狀動脈狹窄病變程度的關系[J].中華老年心腦血管病雜志，2017，19（3）：245-247.

[4]Lai WK，Kan MY.Homocysteine-Induced Endothelial Dysfunction[J].Ann Nutr Metab，2015，67（1）：1-12.

[5]Fu Y，Wang X，Kong W.Hyperhomocysteinaemia and vascular injury：advances in mechanisms and drug targets[J].British Journal of Pharmacology，2018，175（8）：1173-1189.

[6]Ference BA，Ginsberg HN，Graham I，et al.Low-density lipoproteins cause atherosclerotic cardiovascular disease.1.Evidence from genetic，epidemiologic，and clinical studies.A consensus statement from the European Atherosclerosis Society Consensus Panel[J].European Heart Journal，2017，38（32）：2459-2472.

[7]Libby P，Lichtman AH，Hansson GK.Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis：from mice to humans[J].Immunity，2013，38（6）：1092-1104.

[8]Grebe A，Hoss F，Latz E.NLRP3 Inflammasome and the IL-1 Pathway in Atherosclerosis[J].Circulation Research，2018，122（12）：1722-1740.

[9]譚紅梅.同型半胱氨酸激活NLRP3炎癥小體促進動脈粥樣硬化的作用研究[J].中國病理生理雜志，2015（10）：1813-1814.

[10]Tschopp J，Schroder K.NLRP3 inflammasome activation：The convergence of multiple signalling pathways on ROS production[J].Nature Reviews Immunology，2010，10（3）：210-215.

[11]Xi H，Zhang Y，Xu Y，et al.Caspase-1 Inflammasome Activation Mediates Homocysteine-Induced Pyrop-Apoptosis in Endothelial Cells[J].Circulation Research，2016，118（10）：1525-1539.

[12]Shao BZ，Cao Q，Liu C.Targeting NLRP3 Inflammasome in the Treatment of CNS Diseases[J].Frontiers in Molecular Neuroscience，2018（11）：320.

[13]Sun W，Pang Y，Liu Z，et al.Macrophage inflammasome mediates hyperhomocysteinemia-aggravated abdominal aortic aneurysm[J].Journal of Molecular and Cellular Cardiology，2015，81（2）：96-106.

[14]Ochoa CD，Wu RF，Terada LS.ROS signaling and ER stress in cardiovascular disease[J].Molecular Aspects of Medicine，2018，63（3）：18-29.

[15]Konior A，Schramm A，Czesnikiewicz-Guzik M，et al.NADPH oxidases in vascular pathology[J].Antioxidants&Redox Signaling，2014，20（17）：2794-2814.

[16]Montezano AC，Touyz RM.Oxidative stress，Noxs，and hypertension：Experimental evidence and clinical controversies[J].Annals of Medicine，2012，44（sup1）：S2-S16.

[17]Bao XM，Wu CF，Lu GP.Atorvastatin inhibits homocysteine-induced oxidative stress and apoptosis in endothelial progenitor cells involving Nox4 and p38MAPK[J].Atherosclerosis，2010，210（1）：114-121.

[18]Ma MW，Wang J，Dhandapani KM，et al.NADPH Oxidase 2 Regulates NLRP3 Inflammasome Activation in the Brain after Traumatic Brain Injury[J].Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2017（2017）：6057609.

[19]Van Bruggen R，Koker MY，Jansen M，et al.Human NLRP3 inflammasome activation is Nox1-4 independent[J].Blood，2010，115（26）：5398-5400.

[20]Takac I，Schroder K，Brandes RP.The Nox family of NADPH oxidases：friend or foe of the vascular system[J].Current Hypertension Reports，2012，14（1）：70-78.

[21]Van De Veerdonk FL，Smeekens SP，Joosten L AB，et al.Reactive oxygen species-independent activation of the IL-1 inflammasome in cells from patients with chronic granulomatous disease[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2010，107（7）：3030-3033.

[22]楊仁強，黃玲，馬曉欣，等.NLRP3炎癥小體介導血管緊張素Ⅱ誘導的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞炎癥因子IL-1β的表達[J].南方醫(yī)科大學學報，2016，36（6）：790-795.

收稿日期：2019-4-3;修回日期：2019-4-18

編輯/楊倩