口岸截獲豬肉腸的主要豬病病原核酸檢測

李碧鷹，高志強，汪 琳，肖國英，蒲 靜，高 靜，

趙相鵬2，尹 羿2，任 彤2，張 偉2

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100000；2.北京海關(guān)，北京 100026）

根據(jù)《中華人民共和國禁止攜帶、郵寄進境的動植物及其產(chǎn)品名錄》規(guī)定，（生或熟）肉類（含臟器類）及其制品，均屬于禁止攜帶、郵寄進境物。從境外攜帶的動物產(chǎn)品，由于其原料信息、制作工藝不明，存在散播動物疫病風險，一旦接觸易感動物，很有可能引起動物疫情。但近年來非法攜帶動物產(chǎn)品屢禁不止，給我國動物疫病防控帶來巨大風險。隨著豬肉及其制品國際貿(mào)易的發(fā)展以及進出境旅客的非法攜帶，豬病病原跨境傳播風險也隨之加劇。例如從2007 年開始，非洲豬瘟從撒哈拉沙漠以南傳遍整個東歐，2018 年又從高加索地區(qū)傳入亞洲多個國家，引起多國非洲豬瘟暴發(fā)和國際貿(mào)易限制。此外，近十多年來，頻發(fā)的食品安全問題使得世界各國對食品安全十分關(guān)注。而一些豬病病原還會引起公共衛(wèi)生問題，例如2009 年的H1N1 亞型豬流感，經(jīng)溯源表明其來源于豬群中流行的毒株[1]。

根據(jù)我國與其他國家的雙邊貿(mào)易協(xié)定規(guī)定，口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV），豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome disease virus，PRRSV），豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV），豬圓環(huán)病毒2 型（porcine circovirus type 2，PCV-2），豬流感病毒（swine influenza virus，SIV），豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV），偽狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV），豬細環(huán)病 毒1 型 和2 型（torque teno sus virus 1 and 2，TTSuV1 and TTSuV2）8 種病毒，被列為進出境可能通過豬肉傳播的檢疫對象。FMDV、CSFV 和PRRSV 為可嚴重危害養(yǎng)殖業(yè)的重大疫病，已被世界各國列為重點防控對象。而SIV、PRV、PCV-2、PPV 以及TTSuV1 和 TTSuV2 為分布范圍較廣的病原，從肉制品中檢出的可能性較高。為了解非法跨境攜帶豬肉腸傳播動物疫病的風險，從而為執(zhí)法部門的監(jiān)督管理提供數(shù)據(jù)支持，本文以北京口岸截獲的豬肉腸為研究對象，選取282 份樣品進行了8種豬病病原核酸的檢測分析。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品均為口岸截獲的豬肉腸核酸樣品，-80 ℃冰箱保存。按照豬肉腸接收時間將樣品分為“前段（2018 年11—12 月）、中段（2019 年1—2 月）和末段（2019 年3—4 月）”，從每個時間段樣品中隨機抽取94 份，共抽取282 份核酸樣品。樣品主要來自25 個國家的航班，其中歐洲16 個、非洲7 個、亞洲2 個，另有3 份樣品來源國未知。具體豬肉腸樣品來源信息見表1。

表1 豬肉腸樣品來源信息統(tǒng)計

1.2 設(shè)備與試劑

熒光PCR 儀、Roche 480：美國Roche 公司產(chǎn)品；AB QuantStudioTM5：美 國Thermo Fisher 公司產(chǎn)品；病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒：天根生化科技有限公司產(chǎn)品；引物、探針：生工生物工程股份有限公司合成；M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑：Promega 公司產(chǎn)品；Ex Taq?Hot Start Version、dNTP：TaKaRa 公司產(chǎn)品。

1.3 檢測方法

8 種病原的檢測方法主要是熒光PCR、熒光RT-PCR，均依據(jù)相關(guān)國際/國家標準或規(guī)范進行，具體見表2。

表2 8 種病原的檢測方法及依據(jù)

2 結(jié)果與分析

2.1 總體檢測情況

在282 份豬肉腸中，PCV-2、PPV、PRV 以及TTSuV1 均有檢出，其中TTSuV1 和PCV-2 檢出率最高，平均陽性檢出率分別為41.49%和40.43%，其次是PPV，檢出率為36.17%，PRV 檢出率較低，為3.90%，而FMDV、PRRSV、CSFV、SIV 以及TTSuV2 的檢出率為0，檢測結(jié)果均為核酸陰性。具體檢測結(jié)果見表3。

2.2 陽性樣品來源分布

由表3 可以看出，在已知來源的樣品中，來自20 個國家的樣品均檢出了病原，其中：檢出4種疫病病原核酸的國家有4 個，分別為俄羅斯、立陶宛、蒙古國和烏克蘭；檢出3 種的11 個，分別為白俄羅斯、保加利亞、波蘭、赤道幾內(nèi)亞、德國、法國、捷克、西班牙、匈牙利、意大利、贊比亞；檢出2 種的3 個，分別為津巴布韋、拉脫維亞、南非；檢出1 種的2 個，分別為比利時和羅馬尼亞。從陽性樣品來源分布可以看出，陽性樣品主要來自歐洲地區(qū)，共有15 個國家，其次是非洲地區(qū)，共有4 個國家，來自亞洲的最少，僅有1 個。

表3 豬肉腸陽性檢出情況

3 討論

本研究以北京口岸截獲的豬肉腸為目標，抽取282 份樣品進行了8 種豬病病原的核酸檢測，未檢出FMDV、PRRSV、CSFV 以及SIV 等動物疫病病原。檢出了PCV-2、PPV、PRV 以及TTSuV1病原核酸，其中TTSuV1 和PCV-2 檢出率均在40%以上，PPV 檢出率在35%以上，陽性率較高，表明這3 種病原隨非法攜帶的豬肉腸進入國內(nèi)的風險較高。

TTSuV 是一種小的無囊膜的單鏈環(huán)狀DNA 病毒，首次報道于1999 年，但追溯分析顯示在1985年該病原就可能在豬場傳播。此后，各國報道本病原在豬場的陽性率在24%～100%。PCR 檢測研究顯示，該病原可存在于豬的血清、血漿、精液、糞便、初乳以及鼻腔分泌物中[5]。目前還沒有在豬肉制品中檢測TTSuV1 的報道。本研究首次在豬肉腸中檢出了TTSuV1，并且在歐、亞、非國家截獲的豬肉腸中均有檢出，表明其分布范圍很廣。目前關(guān)于TTSuV 對豬的危害尚不清楚，因此需要進行監(jiān)測預警。

PCV-2 是一種嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的豬病病原，呈全球性分布，具有多種基因型，世界各國均有報道。PCV-2 通常分布于淋巴組織、骨髓以及心臟組織中，肌肉和各種臟器中均可能存在感染性病毒[6]。研究表明，該病毒對低pH 以及加熱有一定的抵抗力，未煮熟的豬肉、組織及其制品一旦進入豬飼料，病毒可經(jīng)胃腸道攝入而感染。肉腸的加工中，為保持其風味，其中的肉糜往往未徹底熟制，因此導致PCV-2 在肉腸中的檢出率較高。

PPV 呈世界性分布，是引起母豬繁殖障礙的首要病因，其對熱和酸堿度具有較強抵抗力，在56℃/48 h 或70℃/2 h 對病毒的感染性不會明顯改變，在pH3.0～ 9.0 環(huán)境中穩(wěn)定[6]。PPV 能夠在豬舍環(huán)境中存活數(shù)月之久，從而引起豬群的持續(xù)性感染傳播[6]。本檢測發(fā)現(xiàn)，PPV 陽性率達36.17%，表明該病毒抵抗力較強，可在豬肉腸中廣泛存在。

PRV 可引起豬等多種動物感染。近十多年來，隨著一些國家根除計劃的實施，很多發(fā)達國家的豬場，比如歐洲國家，都根除了PRV。本檢測檢出的PRV 陽性樣品主要見于俄羅斯、蒙古國及個別歐洲國家，因而該病毒的檢出率相對偏低。盡管如此，PRV 在全球大部分國家的野豬、雜交豬中仍廣泛存在。研究表明，PRV 可通過污染的肉制品傳播[6]，所以仍需加強境外攜帶豬肉腸的PRV檢測。

4 結(jié)論

本研究對北京口岸截獲的非法攜帶豬肉腸進行8 種主要豬病病原核酸檢測，檢出4 種病毒核酸陽性，其中包括兩種分布廣泛的重要病原PRV 和PCV-2，表明未經(jīng)口岸檢疫的非法攜帶豬肉腸存在傳播重要豬病的風險。因此需要繼續(xù)強化口岸動物檢疫工作，加大口岸旅客攜帶動物制品查驗的力度，降低重大疫病病原傳入的風險。