熒光原位雜交在布魯氏菌和牛結(jié)核分枝桿菌檢測中的應(yīng)用

孫明軍，王 萍，張喜悅，孫翔翔，孫世雄，魏 榮

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；

2.山東新希望六和集團有限公司，山東青島 266100）

熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是20 世紀80 年代末發(fā)展起來的一種原位雜交技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于動植物基因組結(jié)構(gòu)和癌癥基因檢測以及致病性微生物診斷等許多領(lǐng)域[1-3]。FISH 原理是，用熒光素標記的已知單鏈核酸為探針，依照堿基互補的原則，使其與待檢材料中未知的單鏈核酸進行雜交，通過熒光顯微鏡觀察雜交信號，來顯示目標片段的豐度和位置。由于具有操作簡便、快速、特異性高等特點，熒光原位雜交已成為細菌研究領(lǐng)域強有力的工具[4]。

病原分離鑒定是傳染病確診的金標方法。但對于布魯氏菌病和牛結(jié)核病（簡稱“兩病”）這兩個危害嚴重的人獸共患病來說，病原分離鑒定需要高等級生物安全防護設(shè)施，而且分離培養(yǎng)過程復(fù)雜而漫長，這制約了“兩病”的及時診斷。而熒光原位雜交技術(shù)經(jīng)樣品固定后可以滅活病原，因而杜絕了后續(xù)操作過程中人員感染的風(fēng)險，可在生物安全二級實驗室完成檢測，比傳統(tǒng)的病原分離鑒定更具優(yōu)勢。目前，“兩病”熒光原位雜交診斷技術(shù)還沒有在國內(nèi)實驗室應(yīng)用。該方法曾在人布魯氏菌病診斷上有些嘗試[5]，但對分枝桿菌來說，因細胞壁結(jié)構(gòu)特殊，阻礙了其在人和動物結(jié)核病診斷上的應(yīng)用。本研究選取已報道的布魯氏菌和結(jié)核分枝桿菌16s RNA 探針[6-8]，通過改進樣品處理方式、優(yōu)化雜交條件，進一步簡化操作步驟，同時利用本實驗室保存的菌株和組織樣品，對探針的特異性進行評價，最終建立了一個快速、準確的“兩病”熒光原位雜交診斷方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 熒光標記DNA 探針 細菌通用探針EUB338（5′-CTG CTGCCT CCC GTA GGA GT-3′），布魯氏菌探針Bru-996（5'-CCA CTA ACC GCG ACC GGG ATG-3'）和牛結(jié)核分枝桿菌探針MTB770（5'-CAC TAT TCA CAC GCG CGT-3'），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其中EUB338 和MTB770 兩端用熒光素FAM 標記，Bru-996 用Cy3 標記。

1.1.2 菌株和病料 本試驗使用的菌株以及肺臟、肝臟等組織病料，由人獸共患病監(jiān)測室保存，其中菌株包括：布魯氏菌S2、A19、Rev.1 疫苗株，布魯氏菌HN6、XJ-1 株，牛結(jié)核分枝桿菌XJ1306、XJ1307 株，以及禽結(jié)核分枝桿菌株、大腸桿菌O:157 株。

1.1.3 儀器設(shè)備 熒光顯微鏡（AxiovertA1，CarlZeiss）； 分 子 雜 交 爐（LF-IIIA， 寧 波 新芝）；激光共聚焦顯微鏡（FluoViewTMFV1000，Olympus）。

1.1.4 試劑 溶菌酶、消色肽酶：購自Sigma公司；甲酰胺、4%多聚甲醛、鯡魚精DNA、抗熒光淬滅封片劑、二甲苯等試劑：均由上海生工提供。預(yù)雜交液：900 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris（pH7.5）、0.01% SDS、20%甲酰胺、100 ng/mL 鯡魚精DNA以及終濃度為2 ng/μL 的熒光標記探針；洗滌液：225 mmol/L NaCl、5 mmol/L EDTA、0.01% SDS、20 mmol/L Tris（pH7.5）。

1.2 方法

1.2.1 樣品準備 將冷凍保存的布魯氏菌株接種于布魯氏菌液體培養(yǎng)基（BBL），37 ℃培養(yǎng)2 d；牛、禽結(jié)核分枝桿菌接種于羅氏培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)4 周；回收培養(yǎng)物，PBS 洗一遍，然后加入1%PFA 溶液，混勻，4 ℃冰箱過夜。以上操作須在生物安全三級實驗室進行，F(xiàn)PA 固定后的步驟可在生物安全二級實驗室進行。

1.2.2 雜交和鏡檢 將固定后的菌液用PBS 洗兩遍，然后涂布于載玻片上，風(fēng)干待檢。對布魯氏菌，依次在30%、70%、100%乙醇中處理5 min，然后置陰涼處自然風(fēng)干；加200 μL 雜交液，45 ℃雜交1.5～4 h；用44 ℃預(yù)熱的洗滌液洗滌20 min，雙蒸水沖洗后，滴加抗熒光淬滅封片劑，鏡檢。對牛結(jié)核分枝桿菌，把樣品在二甲苯中作用10～20 min后，依次在100%、70%、30%乙醇和PBS 緩沖液中處理5 min，用溶菌酶（1 mg/mL）和消色肽酶（30 U/mL）消化20 min，然后分別在PBS 以及30%、70%、100%乙醇中處理5 min，風(fēng)干；滴加雜交液，45 ℃雜交4 h，用37 ℃預(yù)熱的洗滌液洗滌20 min，最后封片鏡檢。對組織研磨液，短暫離心，取上清，PFA 固定后涂片。對痰液樣品，先涂片，再用PFA 固定，雜交過程與上相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 布魯氏菌

雜交前，對布魯氏菌無需特別處理，45 ℃雜交1.5 h 即出現(xiàn)紅色熒光信號，200 倍放大下觀察，清晰可見（圖1-A、B）。雜交3 h 可完全滿足檢測需要，延長時間至8 h 或12 h，信號強度不會明顯增加，因而布魯氏菌熒光原位雜交簡便、快速，可在4 h 內(nèi)完成。Bru-996 探針與布魯氏菌S2、A19、Rev.1 疫苗株和HN6、XJ-1 分離株，均產(chǎn)生雜交信號，在牛結(jié)核分枝桿菌、禽結(jié)核分枝桿菌和大腸桿菌中沒有觀察到熒光信號（表1），表明該探針具有較高的特異性。從5 個已知布魯氏菌病羊組織病料（2 個肝臟、2 個脾臟、1 個胎盤）中均成功檢測到布魯氏菌（圖1-C），證明該方法具有較高的敏感性。在高倍放大下觀察，布魯氏菌呈短桿菌，小于大腸桿菌（圖1-D）。

A. S2 疫苗株（Bru-996，20×10）；B. S2 疫苗株（EUB338，20×10）；C. 羊胎盤研磨液（Bru-996，100×10）；D. 大腸桿菌（EUB338，100×10）。圖1 布魯氏菌檢測結(jié)果

表1 不同種類菌株和探針雜交結(jié)果

2.2 牛結(jié)核分枝桿菌

牛結(jié)核分枝桿菌樣品雜交前，須用二甲苯和溶菌酶處理（也可使用消色肽酶，但非必須），二者缺一不可。二甲苯需處理至少20 min，溶菌酶需消化30 min，以充分去除表面的酸類物質(zhì)，從而獲得充分的通透性，便于探針進入并與RNA 雜交。45 ℃雜交4 h，可獲得最佳效果，縮短雜交時間會影響信號強度。因此，牛結(jié)核分枝桿菌的檢測時間較長，需6～8 h。從牛肺臟結(jié)核結(jié)節(jié)研磨液上清中，成功檢測到牛分枝桿菌（圖2-A），經(jīng)抗酸染色檢出較多的抗酸菌（圖2-B）。結(jié)核病陽性牛鼻腔拭子中，未檢出典型的牛結(jié)核分枝桿菌。

A. 牛肺臟結(jié)核結(jié)節(jié)研磨上清雜交結(jié)果（MTB770，100×10）；B. 牛肺臟結(jié)核結(jié)節(jié)組織抗酸染色（100×10）；箭頭指示為牛結(jié)核分枝桿菌。圖2 牛結(jié)核分枝桿菌熒光原位雜交和抗酸染色比較

3 討論

利用16s RNA 原位雜交進行細菌鑒定主要基于以下幾點：一是16s RNA 序列較為保守，是細菌系統(tǒng)進化和分類的經(jīng)典方法之一；二是16s RNA在細菌中的豐度較高（5 000～50 000 拷貝），雜交信號強、易于捕捉；三是細菌固定后可以保持原有形態(tài)，鏡檢時可將其形態(tài)特征作為判斷手段。核酸分析和形態(tài)學(xué)特征相結(jié)合保證了熒光原位雜交方法的特異性，因而可以作為細菌性傳染病確診的依據(jù)。

另外，與其他檢測方法相比，熒光原位雜交還具有以下優(yōu)勢：

（1）拭子、痰液、組織等樣品采集后，立即用FPA 固定，可以滅活病原，排除樣品采集、運輸、檢測過程中的生物安全風(fēng)險。

（2）傳統(tǒng)的病原分離鑒定需要在P3 實驗室內(nèi)進行，而且耗時耗力，而熒光原位雜交可在8 h內(nèi)完成鑒定，大大提高了工作效率。

（3）傳統(tǒng)的real-time PCR方法需要核酸提純，操作中易導(dǎo)致污染而出現(xiàn)假陽性，而熒光原位雜交可以忽略核酸污染，提高檢測的特異性。

（4）在牛結(jié)核病診斷上，比抗酸染色方法特異性高，因為抗酸染色無法區(qū)分牛結(jié)核分枝桿菌和其他非結(jié)核分枝桿菌（如副結(jié)核分枝桿菌、禽結(jié)核分枝桿菌和其他環(huán)境分枝桿菌）[9-10]，而熒光原位雜交使用的探針對結(jié)核分枝桿菌是特異性的，與其他分枝桿菌不會產(chǎn)生雜交信號。

熒光原位雜交在動物布魯氏菌病和牛結(jié)核病診斷應(yīng)用上還有一些局限。該方法需要昂貴的儀器，而大部分實驗室還不具備熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡，所以不利于普及。由于牛種、羊種、豬種等布魯氏菌的16s RNA 序列高度保守，設(shè)計和篩選種/亞種特異性的探針非常困難，目前只有布魯氏菌屬特異性探針。另外，該技術(shù)還不能實現(xiàn)高通量檢測，目前僅限于布魯氏菌病和牛結(jié)核病的實驗室診斷。

綜合來看，熒光原位雜交技術(shù)盡管有不足，但在布魯氏菌病和牛結(jié)核病等人獸共患病的檢測和研究上仍然具有優(yōu)勢。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）已將16s RNA 檢測作為牛結(jié)核病診斷的依據(jù)，但在布魯氏菌檢測上，該方法的敏感性和特異性還需進一步驗證。針對不同布魯氏菌種屬鑒別困難的問題，下一步可以通過篩選其他RNA（包括mRNA）種特異片段來實現(xiàn)。另外，還需要根據(jù)布魯氏菌病和結(jié)核病的發(fā)病特征，確定最佳檢材，并建立實驗室檢測標準操作程序，以規(guī)范和推廣該方法。