DUSP6通過(guò)負(fù)向調(diào)控ERK1/2通路抑制IBV的增值

王 歡 ，丁 鏟 ，劉定祥 ，廖 瑛

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 群體微生物中心，廣東 510642）

禽傳染性支氣管炎（avian infectious bronchitis，IB）是由禽傳染性支氣管炎病毒（Avian infectious bronchitis virus，IBV）引起的一種雞的急性、高度接觸性傳染性疾病，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。根據(jù)臨床癥狀不同IB可劃分為呼吸型、腎病變型、腺胃型等。IBV屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）、冠狀病毒屬（Coronavirus）的γ型冠狀病毒。病毒顆粒外有囊膜，內(nèi)含不分節(jié)段的單股正鏈RNA基因組，具有侵染性，長(zhǎng)為27.6 kb，有5'帽子結(jié)構(gòu)和3'polyA尾巴結(jié)構(gòu)。病毒基因組可轉(zhuǎn)錄出6條亞基因組mRNA，編碼nsp2～nsp16等15個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白、纖突蛋白（spike protein）、膜蛋白（membrane protein）、核衣殼蛋白（nucleocapsid protein）和小包膜蛋白（envelope protein）4種結(jié)構(gòu)蛋白以及3a、3b、5a和5b四種附屬蛋白。IBV感染宿主細(xì)胞，先以正鏈基因組為模板首先翻譯出包括蛋白酶、RNA依賴性RNA復(fù)制酶和RNA解旋酶在內(nèi)的nsp2～nsp16，再在復(fù)制酶的作用下，以基因組為模板轉(zhuǎn)錄負(fù)鏈RNA，進(jìn)而以負(fù)鏈RNA為模板復(fù)制和轉(zhuǎn)錄出正鏈基因組和6條亞基因組mRNA，mRNA翻譯結(jié)構(gòu)蛋白，最后組裝成成熟的病毒粒子。

病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的增殖受到多種胞內(nèi)分子的調(diào)控。促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是其中的一種，它涉及多種細(xì)胞過(guò)程，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、mRNA穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)翻譯和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生等[2]。病毒可以利用這些細(xì)胞過(guò)程來(lái)完成自身蛋白和核酸的復(fù)制。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，MAPK包括3條信號(hào)通路：ERK（extracellular signal-regulated protein kinases）1/2通路、JNK（c-Jun N-terminal kinase）通路和p38（p38 kinases）通路。ERK1/2通路由有絲分裂原和增殖刺激因子激活，而JNK和p38通路由環(huán)境壓力激活。越來(lái)越多的證據(jù)表明，病毒感染過(guò)程利用MAPK通路，幫助自身在宿主細(xì)胞中完成自身復(fù)制[3-5]。研究報(bào)道，腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）感染細(xì)胞可激活ERK1/2信號(hào)通路，引起免疫學(xué)損傷，有利于病毒復(fù)制[6]。

MAPK通路在許多細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，同樣其作用也受到其他分子的調(diào)節(jié)。雙特異性磷酸酶家族（dual specificity phosphatase，DUSPs），是蛋白酪氨酸磷酸酶的一個(gè)子類，有11個(gè)特征明顯的家族成員。目前已發(fā)現(xiàn)，該家族的大部分成員都參與負(fù)向調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，從而參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和應(yīng)激反應(yīng)[7]，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[8]。研究發(fā)現(xiàn)，IBV感染細(xì)胞后可通過(guò)DUSP1負(fù)向調(diào)控p38的活性，減少I(mǎi)L-6、IL-8的表達(dá)，從而抑制過(guò)度炎癥反應(yīng)[9]。DUSP6是MAPK磷酸酶家族的一員，可以針對(duì)酪氨酸或絲氨酸/蘇氨酸殘基去磷酸化并使ERK1/2失活[10-11]。

本研究發(fā)現(xiàn)IBV感染細(xì)胞引起ERK1/2的磷酸化，從而激活MEK/ERK1/2信號(hào)通路。在IBV病毒感染過(guò)程中，用MEK（MAPK/ERK kinase）1/2抑制劑U0126處理細(xì)胞，阻斷MEK/ERK信號(hào)通路，ERK1/2的磷酸化水平下調(diào)，同時(shí)抑制了病毒的復(fù)制。Northern blot 和Western blot結(jié)果顯示，IBV感染細(xì)胞引起DUSP6的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平上調(diào)。利用siRNA干擾DUSP6的表達(dá)，或者用藥物BCI抑制DUSP6活性，均能增強(qiáng)ERK1/2的磷酸化，并且抑制病毒增殖。

1 材料與方法

1.1 病毒和細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)所用的IBV-Beaudette毒株、IBV-N抗體以及Vero細(xì)胞均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉定祥教授贈(zèng)予。人肺癌細(xì)胞系（H1299）購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心（American type culture collection，ATCC）。Vero細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（fatal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM培養(yǎng)基，H1299細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，均置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。病毒通過(guò)Vero細(xì)胞擴(kuò)增，以0.1 MOI感染細(xì)胞24 h后，收取細(xì)胞和培養(yǎng)液，反復(fù)凍融3次，離心取上清，測(cè)定TCID50后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和抗體Trizol試劑購(gòu)自Life Technologies公司；氯仿、異丙醇、甲醛購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；乙醇購(gòu)自上海泰坦科技股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄酶AMV購(gòu)自Roche Diagnostics公司；Oligo dT由金唯智公司合成；地高辛標(biāo)記試劑盒、DIG Wash and Block Buffer Set、DIG easy Hyb、Anti-digoxigenin-AP Fab fragments和CDP-Star均購(gòu)自德國(guó)羅氏公司；溴化乙錠試劑購(gòu)自Bio-Rad中國(guó)公司；HybondTM-N+膜、硝酸纖維素膜購(gòu)自Amersham Biosciences公司；DEPC水、冰醋酸、檸檬酸鈉、三（羥甲基）氨基甲烷購(gòu)自生工生物（上海）股份有限公司；DUSP6、p-ERK1/2、ERK1/2抗體購(gòu)自CST公司；β-tubulin抗體購(gòu)自美國(guó)Eptiomics公司；抑制劑U0126和BCI購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；siRNA由上海吉瑪公司合成。

1.3 RNA提取將Vero和H1299細(xì)胞分別接種在10 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層時(shí)接種IBV，IBV感染細(xì)胞1 h后，更換新鮮維持液繼續(xù)培養(yǎng)。在指定的時(shí)間點(diǎn)（感染后第0、4、8、12、16、20、24、28 h），用10 mLPBS緩沖液清洗細(xì)胞，1 mL Trizol室溫裂解5 min。將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至干凈的EP管，加入五分之一體積的氯仿，振動(dòng)15 s后溫育3 min，然后以4℃、12 000×g離心15 min。取上清水相于干凈EP管中，加入等體積的異丙醇混合，置于-20℃冰箱靜置30 min，使RNA沉淀。然后以4℃、12 000×g離心15 min，棄上清，用1 mL 70%乙醇溶液洗滌RNA沉淀物2次，每次以4℃、7500×g離心15 min。棄上清后風(fēng)干沉淀，在70℃溶解于100 μL DEPC水中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 探針合成探針cDNA模板制備：混合2 μg RNA和10 μL oligo dT（10 pmol/μL），終體積10.5 μL。65℃變性10 min，冰浴冷卻；加入10 mmol/L dNTPs、20 IU RNA酶抑制劑、2 μL 10×反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液和50 IU反轉(zhuǎn)錄酶，終體積為20 μL，置于43℃反應(yīng)1 h，合成cDNA，再以65℃加熱10 min，終止反應(yīng)。以DUSP6為引物，探針制備：其序列為5'-CCGTCACGGTGACAGTGGCTTA-3'（正向）和5'-CTGCTGTGCGGGGACACGATT-3'（反向），通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得DUSP6探針。PCR反應(yīng)體系：32.25 μL ddH2O、5 μL PCR buffer、5 μLPCR DIG labeling mix、5 μL正向引物、5 μL反向引物、0.75 μL enzyme mix、2 μL模板cDNA，終體積為50 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)。72℃延伸7 min。探針制備完成后，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 Northern blot30 μg RNA 65℃變性10 min后加入RNA上樣緩沖液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳完成后使用半干轉(zhuǎn)儀恒壓20V轉(zhuǎn)膜30 min，轉(zhuǎn)膜后1200J紫外交聯(lián)2 min，然后將雜交膜使用1.4制備的探針68℃雜交過(guò)夜，雜交后洗膜并封閉30 min，封閉結(jié)束后用DIG抗體（Dilute anti-DIG-AP 1∶10000）孵育30 min，洗膜2次，每次5 min；然后利用CDP-Star系統(tǒng)和Tanon 5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)。

1.6 Western blot將Vero和H1299細(xì)胞分別接種在6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層時(shí)接種IBV，IBV感染細(xì)胞1 h后，換維持液繼續(xù)培養(yǎng)。在指定的時(shí)間點(diǎn)（感染后第0、4、8、12、16、20 h），分別用1 mL PBS緩沖液清洗細(xì)胞。每孔加入200 μL 2×蛋白裂解緩沖液裂解1 min后，收取細(xì)胞裂解液于干凈的EP管，100℃金屬浴8 min，12 000×g離心2 min后，取10 μL上清上樣跑膠。恒流250 mA轉(zhuǎn)印90 min，5%脫脂乳室溫封閉1 h后，分別孵育p-ERK、ERK、IBV-N、DUSP6和β-tubulin抗體，并孵育相應(yīng)種屬的二抗，顯影前避光配制ECL發(fā)光顯色液，NC膜在ECL發(fā)光顯色液中孵育30 s后用Tanon 5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)。

1.7 U0126抑制實(shí)驗(yàn)將Vero和H1299細(xì)胞分別接種在6孔板中。待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后接種IBV，IBV感染細(xì)胞1 h后，去除未結(jié)合的病毒，加入維持液繼續(xù)培養(yǎng)，并加入不同濃度的U0126或者BCI。感染后12 h用1 mL PBS緩沖液清洗細(xì)胞，每孔加入200 μL 2×蛋白裂解緩沖液，裂解5 min后收取細(xì)胞置于干凈的EP管。100℃金屬浴8 min，12 000×g離心2 min。樣品保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.8 siRNA干擾實(shí)驗(yàn)將H1299細(xì)胞按照5×105個(gè)/孔接種于6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到60%時(shí)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。取兩個(gè)EP管分別加入250 μL的Opti-MEM培養(yǎng)基，其中一個(gè)加入5 μL的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000，另一個(gè)EP管加入5 μL 20 mmol/L的siRNA，室溫靜置5 min。將上述兩管輕柔混勻，室溫靜置20 min，形成siRNA/Lipofectamine 2000復(fù)合物。預(yù)先鋪好細(xì)胞的6孔板用預(yù)冷的PBS清洗3遍，每孔加入1 mLOpti-MEM培養(yǎng)基，并將siRNA/Lipofectamine 2000復(fù)合物加入到6孔板中，混勻，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后棄上清，加入含1%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)32 h，收取蛋白樣品，采用Western blot檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況以確定干擾效果。

表1 siRNA序列Table1 siRNA sequences

2 結(jié)果

2.1 IBV感染引起ERK1/2的磷酸化許多病毒感染都會(huì)引起ERK1/2的磷酸化，該信號(hào)通路的激活在病毒的感染性復(fù)制中發(fā)揮一定的作用[12]。本實(shí)驗(yàn)以1 MOI的IBV分別感染Vero和H1299細(xì)胞，在感染后不同時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞裂解液，通過(guò)Western blot檢測(cè)細(xì)胞中ERK1/2的磷酸化水平（p-ERK1/2），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置模擬感染（無(wú)病毒感染）為對(duì)照組。如圖1所示，跟模擬感染組相比較，隨著感染時(shí)間變化，Vero和H1299細(xì)胞內(nèi)的ERK1/2蛋白表達(dá)量保持不變。然而，ERK1/2的磷酸化水平在感染后4 h開(kāi)始上調(diào)，并隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，分別在感染后16和20 h時(shí)達(dá)到頂峰。綜上，IBV感染能夠激活ERK1/2信號(hào)通路。

2.2 U0126抑制IBV-N蛋白的表達(dá)為了進(jìn)一步研究ERK1/2信號(hào)通路的激活在IBV感染過(guò)程中的作用，先利用藥物U0126處理受感染的細(xì)胞，再檢測(cè)病毒增殖情況。U0126是一種MEK/ERK通路特異性抑制劑，通過(guò)抑制MEK1/2的活性，抑制ERK1/2的磷酸化。本實(shí)驗(yàn)首先用IBV分別感染Vero細(xì)胞和H1299細(xì)胞，以10 μmol/L或15 μmol/L U0126處理的感染后的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，以溶劑DMSO處理的感染后細(xì)胞為對(duì)照組，并以模擬感染(無(wú)病毒感染)為負(fù)對(duì)照組。感染后12 h時(shí)收取蛋白樣品，采用Western blot檢測(cè)ERK1/2的磷酸化水平以及IBV-N蛋白表達(dá)情況。如圖2所示，與負(fù)對(duì)照組相比，對(duì)照組的ERK1/2磷酸化水平明顯上調(diào)；而與對(duì)照組相比，在U0126處理組中，ERK1/2的磷酸化水平下調(diào)，即ERK1/2的激活受到U0126的顯著抑制，且U0126實(shí)驗(yàn)組中IBV-N蛋白表達(dá)量比對(duì)照組的表達(dá)量明顯減少，這種減少情況在H1299細(xì)胞中尤其明顯。綜上，U0126能顯著抑制ERK1/2的磷酸化，同時(shí)也抑制IBV-N蛋白的表達(dá)，表明ERK1/2的磷酸化有促進(jìn)IBV復(fù)制的作用。

圖1 IBV感染激活ERK1/2信號(hào)通路Fig.1 IBV infection activated ERK1/2 pathway

圖2 U0126抑制ERK1/2信號(hào)通路，抑制了IBV的增殖Fig.2 U0126 inhibits ERK1/2 phosphorylation and IBV proliferation

2.3 IBV誘導(dǎo)DUSP6的表達(dá)DUSP6是雙特異性磷酸酶家族（DUSPs）的成員，可使ERK1/2通路上的酪氨酸或絲氨酸/蘇氨酸殘基去磷酸化，從而使ERK1/2失活。本研究發(fā)現(xiàn)，IBV感染細(xì)胞后引起ERK1/2的磷酸化，而MEK激酶抑制劑U0126能夠特異性的抑制MEK1/2，阻斷ERK1/2通路的激活，抑制IBV的增殖。通常，MAPK通路需要激酶和磷酸酶來(lái)調(diào)節(jié)其活性，從而根據(jù)細(xì)胞生理需要來(lái)調(diào)節(jié)和平衡相關(guān)基因的表達(dá)。在Microarray數(shù)據(jù)中，我們發(fā)現(xiàn)DUSP6在轉(zhuǎn)錄水平被IBV感染誘導(dǎo)表達(dá)，因此，我們預(yù)測(cè)IBV感染細(xì)胞可能會(huì)通過(guò)促進(jìn)DUSP6的表達(dá)來(lái)負(fù)向調(diào)節(jié)ERK1/2通路的活性。本研究采用IBV感染Vero和H1299細(xì)胞，收集感染后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞樣品，通過(guò)Northern blot檢測(cè)細(xì)胞中DUSP6的mRNA水平變化。如圖3所示，在Vero細(xì)胞中，DUSP6 mRNA在IBV感染后0 h時(shí)有少量表達(dá)，從感染后4 h時(shí)，DUSP6 mRNA信號(hào)有明顯的上調(diào)，并逐漸增強(qiáng)，在感染后16～20 h達(dá)到頂峰，感染后24～28 h，由于細(xì)胞開(kāi)始死亡，RNA發(fā)生降解（如rRNA開(kāi)始降解變少），DUSP6 mRNA信號(hào)開(kāi)始減弱，直到消失。在感染H1299細(xì)胞4～16 h后，DUSP6 mRNA信號(hào)逐漸增強(qiáng)，感染后8 h時(shí)達(dá)到頂峰，在感染后20～28 h，由于mRNA開(kāi)始降解（rRNA開(kāi)始降解變少），DUSP6信號(hào)逐漸消失。以上結(jié)果表明，IBV感染能促進(jìn)DUSP6 mRNA的轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步利用Western blot檢測(cè)IBV感染過(guò)程中DUSP6的蛋白表達(dá)情況。由于在感染后24 h時(shí)細(xì)胞死亡，mRNA 降解，因此本研究?jī)H選取感染后0～20 h的時(shí)間點(diǎn)做檢測(cè)，并設(shè)模擬感染組做對(duì)照。如圖4所示，與模擬感染組相比，無(wú)論是在Vero細(xì)胞還是在H1299細(xì)胞中，IBV感染后4 h時(shí)，DUSP6蛋白表達(dá)水平均開(kāi)始上升，并持續(xù)到感染后20 h。綜上，IBV感染可誘導(dǎo)DUSP6蛋白的表達(dá)。

圖3 IBV感染增強(qiáng)DUSP6 mRNA的轉(zhuǎn)錄Fig.3 IBV infection induced DUSP6 mRNA transcription

圖4 IBV感染誘導(dǎo)DUSP6的蛋白表達(dá)Fig.4 IBV infection induced high expression of DUSP6 protein

2.4 藥物抑制DUSP6活性或者siRNA干擾DUSP6表達(dá)，均能上調(diào)ERK1/2磷酸化水平，并促進(jìn)IBV增殖采用DUSP6特異性抑制劑BCI處理細(xì)胞，抑制DUSP6的磷酸酶活性。IBV感染Vero和H1299細(xì)胞后1 h時(shí)，去除未結(jié)合的病毒，用10 μmol/LBCI處理細(xì)胞12 h。以溶劑DMSO處理細(xì)胞為對(duì)照組，模擬感染組為負(fù)對(duì)照組。如圖5所示，在Vero和H1299細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，在BCI處理組中，DUSP6表達(dá)水平下降（BCI處理導(dǎo)致DUSP6表達(dá)下調(diào)機(jī)制尚不清楚），而ERK1/2的磷酸化水平上升，IBV-N表達(dá)水平上升。該結(jié)果表明，DUSP6發(fā)揮著去磷酸化ERK1/2的作用，不利于病毒復(fù)制增殖。為了進(jìn)一步檢測(cè)DUSP6對(duì)ERK1/2信號(hào)通路的調(diào)控和對(duì)病毒增殖的影響，我們針對(duì)DUSP6設(shè)計(jì)特異性siRNA。siRNA轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞后36 h，且IBV感染后8 h，Western blot結(jié)果（圖6）顯示，與sic組相比，siDUSP6的3條siRNA單轉(zhuǎn)染，能夠抑制DUSP6的表達(dá)，而3條siRNA混合轉(zhuǎn)染，能夠明顯抑制DUSP6的表達(dá)。在所有的siDUSP6轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，p-ERK1/2的水平均有上調(diào)，說(shuō)明DUSP6的表達(dá)量與ERK1/2的磷酸化水平呈負(fù)相關(guān)。在DUSP6基因沉默的細(xì)胞中，IBV-N的表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，說(shuō)明DUSP6的表達(dá)，負(fù)向調(diào)控IBV的復(fù)制增殖。綜上，通過(guò)特異性抑制劑處理或siRNA干擾的方法降低DUSP6的活性或者減少DUSP6的表達(dá)，可導(dǎo)致ERK1/2的磷酸化水平升高，進(jìn)一步促進(jìn)IBV的增殖，說(shuō)明DUSP6在病毒感染過(guò)程中負(fù)向調(diào)控ERK1/2信號(hào)通路，DUSP6的上調(diào)表達(dá)不利于IBV的感染和增殖。

圖5 DUSP6抑制劑BCI影響IBV-N的表達(dá)Fig.5 DUSP6 inhibitor BCI dampened the expression of IBV-N

圖6 siDUSP6抑制IBV-N的表達(dá)Fig.6 siDUSP6 inhibited the expression of IBV-N

3 討論

在眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，ERK1/2通路幾乎參與了所有的細(xì)胞活動(dòng)[2,13-14]，因此，ERK1/2能夠影響細(xì)胞的生理環(huán)境。在病毒生命周期的入胞、病毒基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)表達(dá)或子代病毒粒子釋放等過(guò)程，ERK1/2均發(fā)揮重要作用[15-17]。病毒感染細(xì)胞激活ERK1/2是一個(gè)普遍現(xiàn)象，通常有利于病毒增強(qiáng)自身的感染，例如：ERK1/2因其調(diào)節(jié)HIV感染性而被定性為病毒相關(guān)激酶[18]，ERK1/2的激活是腸道病毒71和痘病毒有效復(fù)制所必需的[6,19]。然而，也有研究表明，某些病毒可在細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平低下時(shí)發(fā)生病毒感染或持續(xù)性感染，例如：?jiǎn)渭儼捳畈《究衫貌《咀陨砭幋a的Us3絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶抑制ERK1/2的活性調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路的激活[20]，登革熱病毒2型感染細(xì)胞不能引起ERK1/2的磷酸化，甚至抑制ERK1/2的活性[21]。因此，針對(duì)ERK1/2信號(hào)通路，不同的病毒采取了不同的策略，來(lái)幫助自身感染。

本研究發(fā)現(xiàn)，IBV感染能夠激活ERK1/2信號(hào)通路，引起ERK1/2的持續(xù)磷酸化。用藥物U0126抑制ERK1/2的磷酸化，能夠明顯減少I(mǎi)BV-N的表達(dá)，此結(jié)果在H1299和Vero細(xì)胞中均得到了驗(yàn)證，說(shuō)明ERK1/2的磷酸化有利于IBV感染和增殖。

雙特異性磷酸酶家族（DUSPs），是蛋白酪氨酸磷酸酶的一個(gè)子類，屬于有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸酶家族，主要參與反饋性負(fù)向調(diào)控MAPK型號(hào)通路活性[11,22]。在先前的報(bào)道中，我們發(fā)現(xiàn)DUSP1在IBV感染過(guò)程中被上調(diào)表達(dá)，負(fù)向調(diào)控p38信號(hào)通路，減少炎癥因子的產(chǎn)生[9]。此家族的另外一個(gè)磷酸酶DUSP6，定位于細(xì)胞質(zhì)中，可以靶向性去磷酸化p-ERK1/2的酪氨酸或絲氨酸/蘇氨酸磷酸基團(tuán)而使其失活[10-11]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)IBV感染能夠促進(jìn)DUSP6的上調(diào)表達(dá)。用DUSP6抑制劑BCI抑制其活性，或者用siRNA干擾其表達(dá)，降低此磷酸酶的功能，能夠?qū)е翬RK1/2的磷酸化持續(xù)累積，同時(shí)有利于IBV病毒蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果說(shuō)明，在IBV感染過(guò)程中，DUSP6的上調(diào)表達(dá)能夠負(fù)向調(diào)控ERK1/2的活性，且不利于病毒復(fù)制增殖，其有可能是宿主細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)策略之一。

綜上，我們認(rèn)為ERK1/2是影響IBV感染和復(fù)制的胞內(nèi)信號(hào)之一。IBV感染后促進(jìn)DUSP6的表達(dá)，去磷酸化p-ERK1/2，是細(xì)胞本身對(duì)信號(hào)通路的反饋性調(diào)節(jié)機(jī)制，同時(shí)發(fā)揮抗感染的作用。然而，ERK1/2促進(jìn)病毒蛋白表達(dá)的具體機(jī)制，尚不清楚，將是以后研究的方向。