外泌體中的miRNA-744-5P調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的體外實(shí)驗(yàn)研究

李耀璽 楊文杰 段莉 王大平（通訊作者）

（1 安徽醫(yī)科大學(xué)深圳二院臨床學(xué)院 安徽 合肥 230032）

（2 深圳市第二人民醫(yī)院組織工程實(shí)驗(yàn)室 廣東 深圳 100730）

骨肉瘤是兒童和青少年中最常見(jiàn)的惡性骨腫瘤[1]。骨肉瘤是一種遺傳學(xué)上不穩(wěn)定且高度惡性的骨間充質(zhì)腫瘤，其可以產(chǎn)生類(lèi)骨質(zhì)基質(zhì)和纖維間質(zhì)[2]。本實(shí)驗(yàn)的研究意義在于：（1）構(gòu)建4種骨肉瘤細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜，尋找不同轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞外泌體中miRNA的表達(dá)差異。（2）利用外泌體中的miRNA為媒介，為探究骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性提供新的依據(jù)（3）結(jié)合臨床患者數(shù)據(jù)，探究外泌體中的miRNA成為一個(gè)預(yù)后因子的可能性。

1.資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 細(xì)胞系來(lái)源

骨肉瘤細(xì)胞株MG63(上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))；

骨肉瘤細(xì)胞株Saos2(上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))；

骨肉瘤細(xì)胞株U2OS(上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))；

骨肉瘤細(xì)胞株HOS(上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 骨肉瘤細(xì)胞株Saos2、U2OS使用含有10%胎牛血清和雙抗（1%的青霉素和鏈霉素）的McCoy’5A培養(yǎng)基，HOS、MG63使用含有含有10%胎牛血清和雙抗（1%的青霉素和鏈霉素）的MEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件均為：37℃，5%CO2,飽和濕度的環(huán)境中，2～3天更換新鮮培養(yǎng)基1次。實(shí)驗(yàn)所用均取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.2.2 外泌體的收集 細(xì)胞上清中的外泌體收集主要通過(guò)梯度超速離心法。

1.2.3 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 用于轉(zhuǎn)染的miRNA-744-5P inhibitor序列5’-3’：UGCUGUUAGCCCUAGCCCCGCA

該產(chǎn)品購(gòu)自蘇州泓迅生物科技公司，miR-744-5P inhibitor是miRNA抑制物，本實(shí)驗(yàn)中即反義RNA寡聚物anti-miRNA，是化學(xué)修飾的成熟miRNA互補(bǔ)單鏈，產(chǎn)品為凍干粉形成的即用型試劑，使用前瞬時(shí)離心，用RNase-free H2O或滅菌dd H2O配制成20μM儲(chǔ)存液，分裝保存，避免反復(fù)凍融（應(yīng)＜5次）。

20μM儲(chǔ)存液的配制方法（1:50）

1.2.4 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 選用購(gòu)自美國(guó)corning公司的Transwell聚碳酯膜鑲嵌套，每皿6孔，聚碳酯膜直徑24mm，孔徑8μm。選用高轉(zhuǎn)移性的骨肉瘤細(xì)胞Saos2、U2OS進(jìn)行miRNA-744-5P inhibitor的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)（如上述）。分別對(duì)比轉(zhuǎn)染前后根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

2.結(jié)果

2.1 4種骨肉瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

4種骨肉瘤細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，其中Saos2和MG63呈梭型,HOS與U20S呈類(lèi)圓形。

2.2 高通量測(cè)序及實(shí)時(shí)定量PCR

高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞與低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞差異最明顯的miRNA，實(shí)時(shí)定量結(jié)果，高轉(zhuǎn)移組在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外miRNA-744-5p 表達(dá)均高于低轉(zhuǎn)移組。

2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果

首先我們利用Transwell驗(yàn)證了Saos2、U2OS的高轉(zhuǎn)移性，經(jīng)過(guò)48小時(shí)的遷移后，Saos2、U2OS確實(shí)有大量的細(xì)胞突破了膠質(zhì)層，遷移到了內(nèi)室的下方，刮除內(nèi)室殘余細(xì)胞，經(jīng)過(guò)結(jié)晶紫染色后，可見(jiàn)大量藍(lán)紫色的細(xì)胞。

3.討論

3.1 外泌體的收集方法

本研究首先針對(duì)4種骨肉瘤細(xì)胞的上清進(jìn)行了大量的收集工作，再使用梯度超高速離心法獲得4種骨肉瘤細(xì)胞的外泌體，將4種細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的小分子RNA同時(shí)進(jìn)行測(cè)序，本實(shí)驗(yàn)采用的是梯度超速離心法，梯度超速離心法是經(jīng)典的提取外泌體的方法。具體操作步驟見(jiàn)實(shí)驗(yàn)記錄，此方法耗時(shí)較長(zhǎng)且成本較高，要求實(shí)驗(yàn)室配備超速離心機(jī)和較大的離心起始體積。

3.2 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

Transwell實(shí)驗(yàn)是基于Transwell小室評(píng)估細(xì)胞遷移性的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)。我們選取美國(guó)corning公司的Transwell實(shí)驗(yàn)板，對(duì)4種骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行了Transwell實(shí)驗(yàn)。在進(jìn)行了miRNA-744轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)后，高轉(zhuǎn)移性的骨肉瘤細(xì)胞Saos2、U2OS表現(xiàn)了轉(zhuǎn)染前明顯的差異性，低轉(zhuǎn)移性的骨肉瘤細(xì)胞HOS、MG63在轉(zhuǎn)染前后未見(jiàn)明顯異常。

4.結(jié)論

miRNA-744-5P在不同轉(zhuǎn)移性的骨肉瘤細(xì)胞之間具有明顯的表達(dá)差異，抑制骨肉瘤細(xì)胞中miRNA-744-5P的表達(dá)可以抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移能力。