黃連大黃肉桂復(fù)方及其有效組分配伍對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721端粒酶的影響*

磨 煉 楊林浩 嚴(yán) 格 劉小美

上海中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)院 (上海， 201203)

中醫(yī)藥是肝癌綜合防治體系的重要組成部分。課題組前期已發(fā)現(xiàn)黃連大黃肉桂復(fù)方及其有效組分配伍(小檗堿、大黃素和桂皮醛)可有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖[1]。結(jié)合端粒酶與腫瘤發(fā)生和異常增殖密切相關(guān)和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶( hTERT)在維持端粒酶活性中起關(guān)鍵限速作用等報(bào)道[2]，本研究擬探討復(fù)方及其組分配伍對(duì)肝癌細(xì)胞中hTERT的mRNA和蛋白表達(dá)的影響，探索其抑制肝癌細(xì)胞增殖的可能機(jī)制。其研究結(jié)果將為該復(fù)方及其組分配伍開發(fā)成為有效地抗肝癌新藥提供部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 SMMC-7721人肝癌細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

1.2 主要試劑與藥品 黃連大黃肉桂復(fù)方由中藥飲片黃連、大黃和肉桂組成(黃連∶大黃∶肉桂為9∶3∶1)，均購(gòu)自上海養(yǎng)和堂張江店。RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液(100×)和0.25%胰酶，均購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；小檗堿、大黃素購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，桂皮醛購(gòu)自美Sigma-Aldrich公司；二甲基亞砜(DMSO)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TRIzol，購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司；PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix Ex Taq，購(gòu)自日本Takara公司；Protein Ladder、BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液、PMSF、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BeyoECL PLUS購(gòu)自碧云天(上海)生物技術(shù)有限公司；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；PCR擴(kuò)增引物由賽默飛公司合成； 兔抗GADPH和hTERT與辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 儀器 CKX41熒光倒置相差顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品；ELX-800全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-TEK公司生產(chǎn)；NanoDrop 2000/2000c 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)賽默飛公司生產(chǎn)；Eco PCR儀器，美國(guó)Illumin公司生產(chǎn)；Universal Hood II化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Biorad公司生產(chǎn)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)復(fù)蘇SMMC-7721人肝癌細(xì)胞，培養(yǎng)在加有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫且充有5%CO2和95%空氣混合氣體的培養(yǎng)箱中，每2～3天更換培養(yǎng)液1次。

1.5 藥物配制及用藥 復(fù)方配制方法同課題組以往發(fā)表文獻(xiàn)[1]；小檗堿以無(wú)菌Mini-Q水配制母液濃度為5mM(80℃水浴中助溶10min)；大黃素和桂皮醛分別以DMSO配制成40mM和50mM的母液；以上藥液用之前以培養(yǎng)液稀釋至目標(biāo)濃度，即復(fù)方為0.86mg/ml，小檗堿、大黃素和桂皮醛分別為44μM、23μM和46μM(即組分配伍)。用藥：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞常規(guī)消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)后按2×105/孔接種至6孔板中，設(shè)3個(gè)組別，分別是對(duì)照組、復(fù)方組和組分組，每組做3個(gè)復(fù)孔。3組分別給予0.1%DMSO、0.86mg/mL黃連大黃肉桂復(fù)方以及組分配伍。以上藥物作用24h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)并拍照，然后收集細(xì)胞用于提取總RNA和蛋白質(zhì)。

1.6 檢測(cè)hTERT mRNA表達(dá) 以TRIzol一步法提取各組細(xì)胞總RNA，并檢測(cè)總RNA的濃度和質(zhì)量。以RT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并利用SYBR green實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒擴(kuò)增cDNA中的hTERT，同步擴(kuò)增內(nèi)參GAPDH。擴(kuò)增基因的引物序列如下：GAPDH(Forward：5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，Reverse：5′-GATCTCGCTCCTGGAAGATG-3′)；hTERT(Forward：5′-GTGACCGTGGTTTCTGTGTG-3′，Reverse：5′- CCTTGTCGCCTGAGGAGTAG -3′)。擴(kuò)增條件為95℃ 30 sec；95℃ 30 sec，60℃ 30 sec，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果采用相對(duì)定量法(2-△△CT法)對(duì)目的基因進(jìn)行分析，計(jì)算各組hTERT的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 Western Blot檢測(cè)hTERT蛋白表達(dá) 以RIPA裂解細(xì)胞，離心收集上清液以BCA法測(cè)定其蛋白濃度。取12μg蛋白變性后電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗(hTERT和GAPDH均以1∶1000稀釋)后放于4℃冰柜搖床輕搖孵育過(guò)夜。TBST清洗3次后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(抗兔IgG 1∶1000)室溫孵育1h，TBST清洗3次。ECL顯色曝光獲得圖像，使用Image J軟件分析圖像并計(jì)算各用藥組目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件，計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組人肝癌細(xì)胞SMMC-7721形態(tài)變化 與對(duì)照組比較，復(fù)方組細(xì)胞24h后其細(xì)胞附壁邊界不清、消失，細(xì)胞浮起變圓，甚至萎縮、變暗、漂浮死亡，細(xì)胞間隙增大，胞質(zhì)內(nèi)可觀察到高折光性顆粒增多，細(xì)胞間融合部分?jǐn)嗔?，偶?jiàn)區(qū)域性脫落。懸浮死亡的細(xì)胞為組分組>復(fù)方組>對(duì)照組，即藥物對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用。見(jiàn)插頁(yè)圖1。

2.2 黃連大黃肉桂復(fù)方及組分配伍對(duì)肝癌細(xì)胞hTERT mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，復(fù)方組和組分組hTERT mRNA的表達(dá)均有不同程度的上調(diào)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，其中復(fù)方組上調(diào)幅度大于組分組。見(jiàn)圖2。

圖2 各組hTERT mRNA表達(dá)圖

2.3 黃連大黃肉桂復(fù)方及組分配伍對(duì)肝癌細(xì)胞hTERT 蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，復(fù)方組和組分組hTERT 蛋白表達(dá)均下降，其中又以組分組為甚，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 3組細(xì)胞hTERT 蛋白表達(dá)凝膠曝光圖

圖4 3組細(xì)胞hTERT 蛋白表達(dá)圖

3 討論

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，對(duì)人類健康危害極大。通過(guò)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段如化療、射頻消融、生物治療等治療肝癌，均會(huì)產(chǎn)生不同程度的毒副作用[4～6]，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。與此同時(shí)，祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在肝癌不同階段、針對(duì)不同個(gè)體實(shí)行辨證論治的方法，在改善患者臨床癥狀、減輕放化療毒副作用、提高生活質(zhì)量等方面顯示出絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。因此，中西醫(yī)結(jié)合成為我國(guó)治療肝癌普遍采用的方法。

端粒酶是一種特殊的核糖核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，其在不同物種細(xì)胞中對(duì)于保持染色體穩(wěn)定性和細(xì)胞活性有重要作用，能延長(zhǎng)縮短的端粒，從而增強(qiáng)體外細(xì)胞的增殖能力。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者逐漸認(rèn)識(shí)到端粒酶在腫瘤診治中的重要性，人類超過(guò)90%的腫瘤尤其是惡性、晚期腫瘤中，端粒酶的表達(dá)都有增加，活性被激活[7]，使得細(xì)胞分裂異?；钴S。hTERT是決定端粒酶活性的重要因子，其mRNA和蛋白水平的表達(dá)即能反映端粒酶的活性[8]。

有研究顯示肝癌細(xì)胞中端粒酶及hTERT 均呈高表達(dá)[9]，甚至近期還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)hTERT對(duì)小肝癌陽(yáng)性的診斷優(yōu)于影像學(xué)方法，且具有預(yù)示肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的作用[10]，近年來(lái)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)RNA干擾技術(shù)能明顯抑制靶基因hTERT的表達(dá)與肝癌細(xì)胞的增殖，但hTERT的mRNA與蛋白表達(dá)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中下調(diào)比動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的更加明顯，由此認(rèn)為該技術(shù)應(yīng)用于體內(nèi)研究還有待進(jìn)一步優(yōu)化[11]。而在傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療中?；谌梭w與疾病之間的整體性來(lái)用藥，有可能通過(guò)中藥加減配伍，調(diào)整機(jī)體狀態(tài)，促進(jìn)以上技術(shù)方法的實(shí)現(xiàn)。

有研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)中的“毒”與hTERT mRNA的高表達(dá)具有相關(guān)性，中醫(yī)的“解毒法”可干預(yù)hTERT mRNA表達(dá)，從而治療相關(guān)疾病[12]。比如含有大黃的成藥清毒片聯(lián)合化療治療急性白血病對(duì)hTERT mRNA表達(dá)的下調(diào)作用顯著優(yōu)于單純化療[12]，以黃連為主要藥物組成的成藥連黛片能通過(guò)減少人大腸癌HT29 hTERT表達(dá)來(lái)抑制大腸癌細(xì)胞的增殖[13]。本課題采用的黃連大黃肉桂復(fù)方具有清熱解毒的功效，以往研究發(fā)現(xiàn)該復(fù)方及其組分配伍(小檗堿、大黃素和桂皮醛)能抑制肝癌細(xì)胞增殖[1]。本研究結(jié)果顯示，藥物作用后肝癌細(xì)胞hTERT的mRNA均有所上調(diào)，而蛋白表達(dá)均下降，提示該復(fù)方及其組分配伍抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用與hTERT有關(guān)，但其作用并不在于抑制hTERT的mRNA轉(zhuǎn)錄，而是在于hTERT mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的過(guò)程，如翻譯和翻譯后加工等，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。