GFPT2在胃癌中的表達(dá)及作用的研究

胃癌是全球常見的惡性腫瘤，每年約有100萬患者被確診[1]。飲食習(xí)慣、肥胖、吸煙、慢性感染尤其是幽門螺桿菌(Hp)感染都會導(dǎo)致胃癌發(fā)生[2-3]。在中國，由于胃癌患者確診時(shí)多數(shù)是晚期，故療效不佳，5年生存率較低[4]。因此，尋找能預(yù)測早期胃癌和轉(zhuǎn)移相關(guān)的標(biāo)志物以及有效治療胃癌的新靶點(diǎn)具有重要意義。谷氨酰胺果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶2(GFPT2)基因位于染色體 5g34～5g35.2 區(qū)域，在冰島糖尿病家系研究中發(fā)現(xiàn)該區(qū)域與糖尿病有關(guān)[5]，支持GFPT2是2型糖尿病的候選基因。與非侵襲性上皮細(xì)胞株相比，具有高度侵襲性的乳腺癌細(xì)胞株中GFPT2表達(dá)的升高[6]。GFPT2表達(dá)的升高還與2型糖尿病有關(guān)[7]。而目前尚未見GFPT2與胃癌關(guān)系的研究報(bào)道，本研究主要探討GFPT2在胃癌組織中的表達(dá)情況及作用。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本和細(xì)胞系

選擇2014年1月至2015年6月在樂山市人民醫(yī)院接受胃切除手術(shù)、切除標(biāo)本經(jīng)病理診斷為胃癌的82例患者，其中男性49例，女性33例，年齡23～72歲，平均年齡(56.2±4.56)歲，收集82例患者的配對胃癌及癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣5 cm)石蠟標(biāo)本。另收集2017年6月至2018年7月在樂山市人民醫(yī)院胃腸外科經(jīng)手術(shù)切除的33例患者配對的新鮮胃癌組織及癌旁正常組織。正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES和胃癌細(xì)胞株MGC803、MKN45、BGC823、AGS由南方醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系任小莉博士提供。細(xì)胞培養(yǎng)用加入10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.2 Real-time PCR檢測GFPT2 mRNA的表達(dá)水平

收集細(xì)胞，按Trizol 和反轉(zhuǎn)錄試劑說明書分別提取RNA 及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系10 uL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。目的基因以2-ΔΔCt表示，目的基因引物由Sangong Biotech公司合成。

表1 引物序列

1.3 Western blotting檢測GFPT2蛋白的表達(dá)水平

總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將膜置于GFPT2一抗過夜(1∶500)。漂洗一抗后，室溫孵育兔二抗(1∶10 000)1 h。PBST洗膜3次，每次10 min，加入化學(xué)發(fā)光物和顯色試劑，于暗室中曝光、顯影、定影。GAPDH為內(nèi)參。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測GFPT2蛋白的表達(dá)水平

將胃癌及癌旁正常組織石蠟標(biāo)本進(jìn)行3 μm連續(xù)切片，采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素SP法染色。枸櫞酸鹽高溫高壓5 min進(jìn)行抗原修復(fù)，DAB顯色。以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為GFPT2陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的比例為陽性率。由2名以上病理醫(yī)師(主治醫(yī)師)獨(dú)立評分，評分結(jié)果取平均值。根據(jù)物鏡下腫瘤細(xì)胞陽性染色范圍分為4個(gè)等級：陽性率<5%為0分，5%～30%為1分，31%～70%為2分，>70%為3分；依據(jù)對每張切片陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度進(jìn)行評定，無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。上述兩個(gè)計(jì)分的乘積為染色的評判結(jié)果：0分為陰性(-)，統(tǒng)計(jì)時(shí)記為0分；1～4分為弱陽性(+)，統(tǒng)計(jì)時(shí)記為1分；5～8分為陽性(++)，統(tǒng)計(jì)時(shí)記為2分；9～12分為強(qiáng)陽性(+++)，統(tǒng)計(jì)時(shí)記為3分。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并取均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。胃癌組織石蠟切片中GFPT2蛋白表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性采用Wilcoxon Signed Ranks檢驗(yàn)分析和Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 配對新鮮組織標(biāo)本中GFPT2 mRNA的表達(dá)水平

將33例配對的新鮮胃癌組織及癌旁正常組織進(jìn)行Real-time PCR檢測。設(shè)定癌旁正常組織中GFPT2 mRNA表達(dá)水平為1，采用 2-ΔΔCT公式計(jì)算胃癌組織中GFPT2 mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示33例患者的新鮮配對組織中，有27例胃癌組織中GFPT2 mRNA水平高于癌旁正常組織(t=2.891，P=0.007，圖1A)，并且伴有肝轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的GFPT2 mRNA水平高于不伴有肝轉(zhuǎn)移的胃癌組織(P=0.0015，圖1B)。

圖1新鮮配對組織標(biāo)本中GFPT2 mRNA表達(dá)水平A33對新鮮胃癌組織及癌旁正常組織中GFPT2 mRNA的表達(dá)水平B伴有肝轉(zhuǎn)移和不伴有肝轉(zhuǎn)移的胃癌組織中GFPT2 mRNA表達(dá)水平比較

2.2 配對胃癌組織及癌旁正常組織石蠟切片中GFPT2蛋白表達(dá)水平

GFPT2蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，胃癌組織中GFPT2表達(dá)陽性率為98.45%，平均表達(dá)強(qiáng)度為2.06±0.852 5，癌旁正常黏膜組織中GFPT2表達(dá)陽性率為20.60%，平均表達(dá)強(qiáng)度為0.79±0.563 3，根據(jù)染色范圍及染色強(qiáng)度的乘積結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示胃癌組織中GFPT2蛋白表達(dá)要明顯高于癌旁正常組織，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-7.18，P<0.001)。見圖2。

圖2癌旁正常組織和胃癌組織石蠟切片中GFPT2蛋白的表達(dá)A癌旁正常組織 ×200B胃癌組織 ×200

2.3 胃癌組織石蠟切片中GFPT2蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析

結(jié)果顯示，胃癌組織中GFPT2蛋白表達(dá)的高低與腫瘤分化程度、是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與患者的性別、年齡、腫瘤浸潤深度無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 胃癌組織中GFPT2蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性/例

2.4 細(xì)胞株中GFPT2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平

采用Real-time PCR法檢測出5種細(xì)胞株中GFPT2 mRNA表達(dá)水平的CT值，將正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES中GFPT2 mRNA表達(dá)水平設(shè)定為1，采用2-ΔΔCT公式計(jì)算各細(xì)胞株中GFPT2 mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，與正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES相比，胃癌細(xì)胞株MGC803、MKN45、BGC823和AGS中GFPT2 mRNA表達(dá)水平更高(P<0.05)。此外，高轉(zhuǎn)移潛能胃癌細(xì)胞株MKN45和BGC823 中 GFPT2 mRNA的相對表達(dá)量分別為9.809 0±1.505 2、5.825 6±1.469 0，低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細(xì)胞株AGS及MGC803中GFPT2 mRNA的相對表達(dá)量分別為3.423 3±0.846 5、1.842 6±0.282 9。上述結(jié)果提示胃癌細(xì)胞株中GFPT2 mRNA的表達(dá)水平明顯高于正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES，且高轉(zhuǎn)移潛能胃癌細(xì)胞株中GFPT2 mRNA的表達(dá)水平較低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細(xì)胞株高(P<0.05)。進(jìn)一步提取上述5種細(xì)胞株的總蛋白進(jìn)行Western blotting法檢測，結(jié)果顯示正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES中GFPT2蛋白表達(dá)水平低于胃癌細(xì)胞株MGC803、BGC823及MKN45(P<0.05)，但與AGS的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株MKN45和BGC823中GFPT2蛋白表達(dá)水平高于低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株AGS及MGC803(P<0.05)。見圖3。

圖3 5種細(xì)胞株中GFPT2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平比較 A GFPT2 mRNA表達(dá)水平 B GFPT2蛋白表達(dá)水平

3 討論

隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，胃癌發(fā)病率和病死率已明顯下降，但其目前仍是世界第3位惡性腫瘤[8-10]。研究胃癌的發(fā)病機(jī)制，為臨床提供新的治療靶點(diǎn)具有重要的意義。

GFPT屬于高度保守的基因，是氨基己糖途徑(HBP)的第一個(gè)限速酶，該酶是由非連鎖但高度同源的GFPT l和GFPT 2基因編碼，使L-6-磷酸-谷酰胺果糖轉(zhuǎn)化形成6-磷酸-氨基葡萄糖。而6-磷酸-氨基葡萄糖是蛋白和脂類糖基化中己醣胺的重要前體[11]。GFPT酶包括兩個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域，谷氨酰胺酶結(jié)構(gòu)域和合酶結(jié)構(gòu)域，前者可使谷氨酰胺水解為谷氨酸和氨，后者可使6-磷酸果糖氨基化和異構(gòu)化形成6-磷酸-氨基葡萄糖。GFPT1和GFPT2是相互獨(dú)立的位于不同染色體上的兩個(gè)基因，在不同組織中的表達(dá)也有所不同。胰腺、胎盤、睪丸中GFPT1的表達(dá)水平高于GFPT2，而在神經(jīng)系統(tǒng)特別是脊髓中GFPT2的表達(dá)水平明顯高于GFPT1[12]。以往文獻(xiàn)已證明氨基葡萄糖可引起血糖毒性和胰島素抵抗，GFPT表達(dá)的改變可引起糖尿病發(fā)生[13]。目前GFPT1被研究得較多，主要研究O-GlcNAc 糖基化修飾、胰島素抵抗及GFPT1在腫瘤中的表達(dá)上調(diào)等[14-15]。此外，GFPT1的突變還與先天性肌無力綜合征相關(guān)[16]。目前尚未見GFPT2在胃癌中的作用及機(jī)制的相關(guān)研究報(bào)道。

本研究中首先檢測了GFPT2在33例配對新鮮胃癌組織及癌旁正常組織中GFPT2 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示胃癌組織中GFPT2 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常組織。本研究還檢測了82例配對胃癌及癌旁正常組織石蠟標(biāo)本中GFPT2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示胃癌組織中GFPT2蛋白表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，且GFPT2蛋白表達(dá)與腫瘤分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與患者的性別、年齡、腫瘤浸潤深度無關(guān)。這些結(jié)果說明GFPT2在胃癌組織中呈高表達(dá)且與胃癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。此外，本研究還檢測了正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES 和 4 種胃癌細(xì)胞株(AGS、MGC803、MKN45和BGC823)中GFPT2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示GFPT2在胃正常黏膜上皮細(xì)胞GES中的表達(dá)最低，在低分化的轉(zhuǎn)移潛能較高的胃癌細(xì)胞株MKN45和BGC823中的表達(dá)較高，這進(jìn)一步說明了GFPT2在胃癌的轉(zhuǎn)移中可能起著促進(jìn)作用。以往研究顯示，GFPT2與糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)，是2型糖尿病的候選基因[5]。但其在腫瘤方面的文獻(xiàn)較少，僅有幾篇。在后續(xù)的研究中，將著重研究USP18促進(jìn)胃癌侵襲和增殖的分子機(jī)制及其在臨床治療中的應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，GFPT2在胃癌組織中高表達(dá)，與胃癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，為臨床治療胃癌提供了一個(gè)潛在的新靶點(diǎn)，也為進(jìn)一步研究奠定了良好的基礎(chǔ)。