長鏈非編碼RNA-ATB在膠質(zhì)瘤中的表達水平和臨床意義

羅國強，秦彥昌，張百平，于慶偉

空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科(西安710038 )

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是由星形膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)前體細胞引起的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腦瘤，每年的發(fā)病率約為4.5/10萬[1]。近年來，盡管隨著研究發(fā)展，針對膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的生物學和分子基礎已經(jīng)進行了大量驗證，腫瘤診斷和治療方面也取得了巨大進展，但膠質(zhì)瘤患者的預后仍然不佳。其中低級別膠質(zhì)瘤患者5年生存率為30%～70%，而惡性程度最高的膠質(zhì)母細胞瘤患者的中位生存時間僅為9～12個月，5年存活率低于3%。因此，應進一步研究膠質(zhì)瘤的臨床診療方法，探索新的危險因素和分子標志物、開發(fā)新的治療靶點，已改善是神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的臨床預后。長鏈非編碼RNA (Long non-coding RNA，lncRNA)曾經(jīng)被認為是一類堿基長度大于200 bp而無編碼蛋白質(zhì)功能的RNA，但新的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA通過其可以調(diào)節(jié)基因表達、調(diào)控染色質(zhì)重組的特點，在多種類型的惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮致癌或抑癌的作用[2]。特別是許多l(xiāng)ncRNA的異常表達可能在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)揮重要作用，如XIST在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織的表達水平顯著升高，可作為預測患者預后的獨立危險因素[3]；MEG3可降低膠質(zhì)瘤細胞的活力并促進其凋亡[4]。lncRNA-ATB是首個發(fā)現(xiàn)能被轉(zhuǎn)化生長因子激活的lncRNA，其在肝癌[5]、肺腺癌[6]、結(jié)腸癌[7]等多種腫瘤中表達水平異常。然而，目前尚無探究ATB與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預后之間關(guān)系的報道。因此，本研究的目的是研究ATB在膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的表達，分析ATB與腦膠質(zhì)瘤患者預后的關(guān)系。

對象與方法

1 研究對象 收集2007-2013年在空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院神經(jīng)外科62例手術(shù)切除且術(shù)后確診的膠質(zhì)瘤組織樣品進行qRT- PCR檢測。將切除的組織標本分為兩部分：一部分用于組織病理學診斷，另一部分保存在液氮中，用于RNA提取。本研究共納入男性患者36例和女性患者26例，年齡34～75歲，中位年齡51歲。以上腫瘤組織標本中WHO I級8例，WHO II級14例，WHO III級18例，WHO IV級22例。所有患者術(shù)前均未接受化療或放療等抗腫瘤治療，且具有完整的臨床隨訪。此外，自因腦損傷和腦出血而進行手術(shù)的患者中取16份正常腦組織標本作為對照，其中男11例，女5例，年齡29～47歲，中位年齡36歲。

2 實驗方法 采用TRIzol試劑(Invitrogen，CA，USA)按說明書從膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織中提取總RNA。采紫外分光光度計檢測所有RNA樣品的濃度和純度，OD 260/280在1.9～2.0范圍內(nèi)為合格。應用qRT-PCR法配置逆轉(zhuǎn)錄反應體系。然后采用2-△△Ct法分析qRT-PCR所得結(jié)數(shù)據(jù)，計算神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中ATB的表達水平，所有實驗至少重復3次。

結(jié) 果

1 ATB在膠質(zhì)瘤組織中的表達水平 使用qRT-PCR檢測了所有膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中ATB的表達(圖1)。與正常腦組織相比，腫瘤組織ATB的表達水平明顯升高[正常腦組織(0.88±0.26)、膠質(zhì)瘤組織(2.84±0.28)P<0.01]。此外ATB在惡性程度高的膠質(zhì)瘤中的表達水平中顯著高于惡性程度低的膠質(zhì)瘤組織，這提示ATB的表達與膠質(zhì)瘤惡性程度呈正相關(guān)[WHO I～II(2.17±0.29) 、WHO III～IV(3.51±0.30)P<0.01]。

圖1 lncRNA-ATB在癌旁正常腦組織和膠質(zhì)瘤I～II期、III～IV期中的表達水平

2 ATB表達水平與膠質(zhì)瘤患者臨床預后的關(guān)系 我們回顧了62例膠質(zhì)瘤患者的詳細臨床資料，采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗評價低表達組和高表達組患者術(shù)后5年生存率的差異。生存分析的結(jié)果顯示：神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者ATB高表達組患者預后較差，5年生存率明顯低于ATB低表達組(圖2)，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.002)。

圖2 lncRNA-ATB高表達組和低表達組患者術(shù)后生存率比較

3 膠質(zhì)瘤患者不同臨床病理指標單因素和多因素分析 見表1。采用單因素和多因素COX比例風險回歸分析評價ATB的表達水平和各種臨床病理特征是否為膠質(zhì)瘤患者的獨立預后危險因素。多因素分析結(jié)果顯示，高ATB表達水平(P<0.01)、高WHO分級(P<0.01)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.01)、KPS評分<80分(P<0.01)均為影響膠質(zhì)瘤患者預后的獨立危險因素。

討 論

膠質(zhì)瘤，尤其是膠質(zhì)母細胞瘤，是人類最具破壞性的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤[8]。盡管近年來腫瘤的診斷和治療取得了巨大的進展，但由于膠質(zhì)瘤細胞增殖迅速，僅靠手術(shù)切除難以根治，患者術(shù)后極易復發(fā)，導致膠質(zhì)瘤患者的臨床預后仍較差[9]。因此，探索可早期診斷膠質(zhì)瘤并準確預測膠質(zhì)瘤預后，確定神經(jīng)膠質(zhì)瘤的潛在治療靶點和預后指標具有重要臨床意義。為此越來越多的研究者把目光放在了非編碼RNA上。

表1膠質(zhì)瘤患者不同臨床病理指標單因素和多因素分析

注：KPS，卡氏行為狀態(tài)評分；HR，風險比；CI，置信區(qū)間

lncRNA已經(jīng)被證實具有多種信號轉(zhuǎn)導調(diào)控功能，以此影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的多個環(huán)節(jié)[10]，例如：非小細胞肺癌患者血清中l(wèi)ncRNA H19的表達水平增高，lncRNA H19可能參與了非小細胞肺癌的病理過程[11]；UCA1在膀胱癌中的表達水平明顯著提升，并且負向調(diào)節(jié)miRNA-99b的表達發(fā)揮作用[12]。同樣在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，研究發(fā)現(xiàn)也存在多種lncRNA表達異常，例如：PVT1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達量高于正常腦組織，高PVT1提示膠質(zhì)瘤患者的不良預后[13]；UCA1的表達水平在膠質(zhì)瘤組織中顯著增高，且與膠質(zhì)瘤患者的WHO分級明顯相關(guān)[14]。

本研究中，我們通過qRT-PCR檢測了不同WHO分級的膠質(zhì)瘤組織中l(wèi)ncRNA-ATB的表達，判斷其表達量與膠質(zhì)瘤患者預后關(guān)系。ATB作為一種新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA明星分子，受到研究者的廣泛關(guān)注。先前的研究表明，ATB在多種腫瘤中表達異常并且發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，例如：ATB在膀胱癌中呈高表達狀態(tài)，可以作為預測患者預后的獨立危險因素[15]；宮頸癌患者的ATB表達明顯上調(diào)，并且高表達的ATB可以促進宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移[16]；腎細胞癌中，ATB高表達的患者5年生存率明顯下降，暗示高ATB表達預示腎細胞癌患者預后不良[17]。Chun等[18]還研究發(fā)現(xiàn)ATB在膠質(zhì)瘤中的作用機制：在膠質(zhì)瘤組織中表達水平上調(diào)的ATB通過抑制mir-200a進而促進TGF-β2表達，從而促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展。本研究是首次探討ATB在膠質(zhì)瘤中的臨床預后價值。

研究發(fā)現(xiàn)：ATB在膠質(zhì)瘤組織中表達水平顯著上調(diào)，且高級別膠質(zhì)瘤組織(III級和IV級)的ATB表達水平遠高于低級別膠質(zhì)瘤組織(I～II級)，提示ATB的表達水平與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)。然后，我們進一步探討了ATB表達與膠質(zhì)瘤患者預后的關(guān)系。根據(jù)Kaplan-Meier分析結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)ATB高表達的膠質(zhì)瘤患者五年生存率顯著于低ATB低表達者，這表明ATB表達水平和膠質(zhì)瘤患者預后具有相關(guān)性。最后進行單因素和多因素分析，結(jié)果表明，高ATB表達、高WHO分級、低KPS評分和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預后獨立危險因素，暗示ATB的表達能夠成為膠質(zhì)瘤患者預后診斷的獨立指標。

綜上所述，高表達的ATB在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中高表達，并且和不良預后顯著相關(guān)。ATB有望成為評價膠質(zhì)瘤預后以及指導早期診療的新型標記物。