肉桂精油微膠囊中精油提取和測(cè)定方法的比較

李 霞 范亞葦 張 兵 寇秀穎 從仁懷 鄧澤元*

（1 南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌330047 2 無(wú)限極（中國(guó)）有限公司 廣州510623）

肉桂為樟科植物肉桂的干燥樹(shù)皮。肉桂油是將肉桂的干燥枝、葉進(jìn)行水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)油，有肉桂的特異香氣，為黃色或黃棕色的澄清液體，味甜、辛辣，置空氣中或存放日久，色漸變深，質(zhì)漸濃稠[1]。肉桂精油成分比較復(fù)雜，主要活性成分包括肉桂醛（約75%～90%）[2-3]。另外，含有苯甲醛、香草醛、乙酸桂酯、香豆素、丁香酚、2 一甲氧基桂酸和二氫桂酸等成分[4]，具有鎮(zhèn)痛解痙[5]，抗血小板聚集[6]，抗菌消炎[7-9]，抗腫瘤[10]，降血糖血脂[11-12]，增強(qiáng)腸胃蠕動(dòng)[13]等多方面作用。由于肉桂精油具有較強(qiáng)的揮發(fā)性，遇光和熱不穩(wěn)定，在空氣中易被氧化，因此在一定程度上限制了它的應(yīng)用，而將其微膠囊包埋可明顯地降低其揮發(fā)性，增強(qiáng)穩(wěn)定性[14-15]。

在精油微膠囊的制備中，包埋效率是評(píng)價(jià)微膠囊包埋效果的一個(gè)重要指標(biāo)，簡(jiǎn)稱(chēng)包埋率[16]。包埋率是指微膠囊中被包埋的精油與微膠囊總精油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)或體積分?jǐn)?shù)[17]。包埋率越高，精油被包埋的量越大，效果越好。在制備精油微膠囊時(shí)，由于精油的揮發(fā)，微膠囊所含的精油與投入精油的量是不一樣的。在計(jì)算包埋率時(shí)，關(guān)鍵是準(zhǔn)確提取微膠囊中所含的總精油和表面精油，從而計(jì)算微膠囊中被包埋率。

微膠囊表面油的提取主要使用石油醚或乙醚浸提[18]?；谌夤鹁碗y溶于石油醚，易溶于乙醚的物理性質(zhì)，采用乙醚浸提的方法進(jìn)行微膠囊表面油的提取、測(cè)定。因總精油含量的測(cè)定直接影響包埋率的計(jì)算，故準(zhǔn)確提取測(cè)定微膠囊總精油的含量對(duì)評(píng)價(jià)微膠囊效果至關(guān)重要。微膠囊中總精油的提取方法較多，目前沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。李榮等[19]分別采用無(wú)水乙醇、乙醚超聲萃取后，以重量法測(cè)定微膠囊中肉桂精油。陳燕等[20]按藥典中揮發(fā)油的測(cè)定方法，用水蒸氣蒸餾法提取微膠囊中的薄荷精油。彭穎等[21]使用乙醇超聲提取微膠囊中的肉桂精油后用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量。岳淑麗等[22]用干燥失重法測(cè)定微膠囊中桉葉精油，Shaikh J 等[23]采用熱重分析法測(cè)定微膠囊中黑椒樹(shù)脂，王賽賽等[24]分別采用堿性-乙醚法 （羅紫－哥特里法）、混合有機(jī)溶劑[25]萃取微膠囊中的精油。目前這些精油的提取、測(cè)定方法沒(méi)有進(jìn)行結(jié)果比較。熱重分析法因測(cè)試費(fèi)用昂貴，應(yīng)用較少。其它測(cè)試方法應(yīng)用均較多。精油定量的方法一般采用重量法[26]及 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線(xiàn) 法[19]。

本研究選取干燥失重法、揮發(fā)油測(cè)定法（蒸餾法）、紫外分光光度法（乙醇超聲-標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法）和混合溶劑提取稱(chēng)重法對(duì)微膠囊精油進(jìn)行提取并對(duì)比分析，旨在為肉桂精油微膠囊總精油含量的測(cè)定提供科學(xué)依據(jù)，以期獲得微膠囊中精油提取率高，穩(wěn)定性好且簡(jiǎn)單方便的提取、測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

材料與試劑：肉桂精油 （肉桂醛含量85%～95%，批號(hào)20160301），江西匯通藥用香料油有限公司；大豆分離蛋白（食品級(jí)，90%），古神生物科技有限公司；變性淀粉（食品級(jí)），德清三富食品有限公司；麥芽糊精（食品級(jí)，SE：5-20），山東西王淀粉有限公司；石油醚（30～60 ℃）、乙醇、乙醚等常用有機(jī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

FA22 型電子分析天平，上海舜宇恒平科學(xué)有限公司；L6S 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海儀點(diǎn)分析儀器有限公司；50LA 型膠體磨，上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠；60-6S 型均質(zhì)機(jī)，上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠；MDR-50 150 型噴霧塔，錫山市現(xiàn)代噴霧干燥機(jī)；HJ-3 型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，常州國(guó)華電器有限公司；HH-S11 型恒溫水浴鍋，太倉(cāng)科教器材廠；OZF-6050 型真空干燥箱，上海新苗醫(yī)療機(jī)械制造有限公司；超聲波清洗機(jī)（25HZ，300W），無(wú)錫市上佳生物科技有限公司；BT100-2J 精密蠕動(dòng)泵，保定蘭格恒流泵有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 肉桂精油微膠囊樣品的制備 采用萬(wàn)婷婷等[27]方法進(jìn)行改進(jìn)，采用噴霧干燥法制備肉桂精油微膠囊。稱(chēng)取126.0 g 混合壁材（壁材各組分質(zhì)量比：變性淀粉∶麥芽糊精∶大豆分離蛋白=1 ∶9 ∶4，54.0 g 肉桂精油，使芯壁比為3 ∶7。用750 mL 去離子水55 ℃攪拌溶解形成溶液，30 min 后，將精油勻速緩慢加入壁材水溶液中，55 ℃攪拌1 h，經(jīng)膠體磨分散后高壓均質(zhì)得到乳化液，用蠕動(dòng)泵進(jìn)入離心噴霧塔，形成微膠囊顆粒，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.3.2 微膠囊總精油含量的提取、測(cè)定

1.3.2.1 干燥失重法 準(zhǔn)確稱(chēng)取5.0 g 干燥的肉桂精油微膠囊，其質(zhì)量記為m1，置于干燥的錐形瓶中，加入50 mL 無(wú)水乙醇，加蓋密封，在超聲波清洗機(jī)中60 ℃震蕩超聲40 min，真空抽濾，用無(wú)水乙醇充分洗滌濾渣，將濾渣并濾紙?jiān)?0 ℃真空干燥箱中干燥至恒重，記其質(zhì)量為m2，同等規(guī)格濾紙恒重m3，則肉桂精油微膠囊總油質(zhì)量為m1-m2-m3。

1.3.2.2 揮發(fā)油測(cè)定方法 參考2010 版《中國(guó)藥典》附錄XD 揮發(fā)油測(cè)定法（甲法）[1]。由于微膠囊中的精油含量與新鮮枝葉中精油含量相差太大，所以用于蒸餾的微膠囊粉末樣品少。此時(shí)刻度的讀數(shù)誤差帶來(lái)的結(jié)果誤差較大，不可忽視。對(duì)肉桂精油微膠囊精油提取采用改進(jìn)的同時(shí)蒸餾方法，在肉桂精油隨水蒸氣蒸餾的同時(shí)用二氯甲烷進(jìn)行有機(jī)萃取，真空旋干溶劑后稱(chēng)重，以便減小讀數(shù)的誤差。

具體方法：精密稱(chēng)取5.0 g 肉桂精油微膠囊置于裝有10 粒玻璃珠的500 mL 圓底燒瓶中，并加入300 mL 去離子水，有機(jī)相燒瓶（m1）加入60 mL二氯甲烷，連接同時(shí)蒸餾裝置和回流冷凝管。用調(diào)溫電熱器加熱至兩相同時(shí)沸騰，并保持微沸約3 h后停止加熱，將二氯甲烷的有機(jī)相收集后50 ℃真空旋干后稱(chēng)重（m2），則肉桂精油微膠囊總油質(zhì)量為（m2-m1）。

1.3.2.3 紫外分光光度法

1） 最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定 用移液管量取0.1 mL 肉桂油標(biāo)準(zhǔn)品滴入10 mL 比色管中，用無(wú)水乙醇定容10 mL，再用滴管取定容液0.1 mL 滴入10 mL 比色管，用無(wú)水乙醇定容10 mL 作為儲(chǔ)備液。用無(wú)水乙醇稀釋若干倍后作為肉桂精油工作液。以無(wú)水乙醇為空白，對(duì)工作液在波長(zhǎng)200～400 nm范圍進(jìn)行掃描，間隔1 nm，從掃描圖譜中確定最大吸收波長(zhǎng)。

2） 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 分別取肉桂精油工作液0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，用無(wú)水乙醇定容10 mL，在前面獲得的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值，然后通過(guò)吸收強(qiáng)度對(duì)肉桂精油濃度作圖，即得到肉桂精油對(duì)吸光度的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。

3） 總油的測(cè)定 精密稱(chēng)取5.0 g 肉桂精油微膠囊，溶于50 mL 無(wú)水乙醇中，在超聲波清洗機(jī)中60 ℃超聲震蕩40 min。將溶液在高速離心機(jī)上離心20 min，傾出上清液，加入50 mL 乙醇超聲萃取，重復(fù)萃取操作至上清液無(wú)明顯精油氣味，合并，準(zhǔn)確計(jì)量上清液體積。取1 mL 上清液，配制桂精油-無(wú)水乙醇溶液，以無(wú)水乙醇為空白組，在波長(zhǎng)286 nm 處測(cè)量所配溶液的吸光值。根據(jù)回歸方程計(jì)算肉桂精油-乙醇溶液中肉桂精油的體積分?jǐn)?shù)，再乘以上清液的體積，通過(guò)密度（ρ=1.060 g/cm3）即可計(jì)算肉桂精油微膠囊中總油的質(zhì)量。

1.3.2.4 混合溶劑提取稱(chēng)重法 在馮偉等[28]研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。稱(chēng)取2.0 g 微膠囊粉末，用10 mL 溫水溶解，加入15 mL 無(wú)水乙醇。搖勻后加入25 mL 乙醚，充分振搖1 min，加入10 mL 沸程為30～60 ℃的石油醚，加塞水平振搖1 min，靜置分層，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移至已知質(zhì)量的燒瓶（m1）。在水相中繼續(xù)加入5 mL 無(wú)水乙醇，15 mL 乙醚，5 mL 石油醚，采用上述方法操作，第3 次僅加入15 mL 乙醚。提取完畢后合并有機(jī)相，50 ℃減壓濃縮至溶劑揮干后稱(chēng)重（m2），則肉桂精油微膠囊總油質(zhì)量為m2-m1。

1.3.3 微膠囊精油含量的計(jì)算

1.4 4 種方法精密度和準(zhǔn)確度的測(cè)定

1.4.1 精密度試驗(yàn) 精密度指測(cè)定同一勻質(zhì)樣品的一組測(cè)量值彼此符合的程度，它們?cè)浇咏驮骄堋３Ｓ孟鄬?duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）來(lái)表示分析測(cè)試結(jié)果的精密度，RSD 越小，誤差越小，精密度越好。

1） 儀器精密度試驗(yàn) 干燥失重法中的濾渣、揮發(fā)油提取及混合溶劑提取的精油或紫外分光光度法配制的精油溶液，連續(xù)6 次稱(chēng)重或測(cè)定吸光值，計(jì)算各方法精油含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），考察儀器的精密度。

2） 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 將干燥失重法中的濾渣、揮發(fā)油提取及混合溶劑提取的精油或紫外分光光度法配制的精油溶液，分別在0，2，4，8，12，24 h 稱(chēng)重或測(cè)定吸光值，計(jì)算各方法精油含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），考察樣品及儀器的穩(wěn)定性。

3） 方法重復(fù)性試驗(yàn) 取同一肉桂精油微膠囊粉末，按上述4 種方法提取并測(cè)定精油含量，重復(fù)6 次。計(jì)算4 種方法測(cè)得精油含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），考察方法的重復(fù)性。

1.4.2 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 準(zhǔn)確度指測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值之間接近的程度。由于精油的投入量為定值，在試驗(yàn)過(guò)程中精油的揮發(fā)不確定，所以以測(cè)定值與投入量之比為精油的回收率為指標(biāo)，回收率越高，準(zhǔn)確度越高。

采用精油含量逐步增加法，制備含25%，30%，35%和40%的肉桂精油的微膠囊。采用前述4 種方法中準(zhǔn)確度最高的方法測(cè)試不同精油投入量微膠囊的精油回收率，進(jìn)行準(zhǔn)確度試驗(yàn)的驗(yàn)證，重復(fù)6 次。

1.5 數(shù)據(jù)分析及計(jì)算

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用spss16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行ANOVA 因 素 分 析，用ANOVA 中 的Tukey 和Duncan 來(lái)比較組間數(shù)據(jù)的顯著性差異。當(dāng)P＜0.05時(shí)表示存在顯著性差異，P＜0.01 時(shí)存在極顯著性差異。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 肉桂精油紫外分光光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

將肉桂精油乙醇溶液經(jīng)波長(zhǎng)200～400 nm 掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。圖譜顯示在286 nm 處肉桂精油乙醇溶液有最大吸收峰，因此確定286 nm 為肉桂精油在紫外區(qū)的最大吸收波長(zhǎng)。

以肉桂精油乙醇溶液中肉桂精油的體積分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖2。用強(qiáng)吸光值對(duì)肉桂精油的體積分?jǐn)?shù)做回歸處理，得肉桂精油乙醇溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程：y=0.0163x-0.0308，其中y 是溶液在波長(zhǎng)286 nm 處的吸光值，x 是每毫升標(biāo)準(zhǔn)溶液中肉桂精油的體積。R=0.9994，在20～60 nL/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液中有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2 4 種方法對(duì)肉桂精油微膠囊測(cè)定方法的比較

乳液中投入的芯壁比為3∶7，即理論上精油的投入量為30%，4 種測(cè)試方法的結(jié)果見(jiàn)表1，表2。

圖1 肉桂精油-乙醇溶液掃描譜圖Fig.1 Absorption spectra of cinnamon essential oil-ethanol solution

圖2 肉桂精油-乙醇溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2 Standard curve for cinnamon essential oil-ethanol solution

表1 4 種方法的精密度比較Table 1 Result of precision experiment

表2 4 種方法的準(zhǔn)確度比較Table 2 Result of accuracy experiment

表3 混合溶劑法-精油回收率試驗(yàn)Table 3 Result of recovery experiment

4 種方法的儀器精密度的RSD 值均不超過(guò)2%，表明測(cè)量?jī)x器具有良好的精密度。紫外分光光度法穩(wěn)定性的RSD 值雖小于5%，但對(duì)于同一批樣品的測(cè)定結(jié)果明顯高于其它3 種方法。原因可能是測(cè)定時(shí)，精油在乙醇溶液中，因乙醇的揮發(fā)而加快其自身的揮發(fā)，或者也有可能是紫外檢測(cè)器的氘燈長(zhǎng)時(shí)間開(kāi)啟，燈能量的消耗而使得儀器的不穩(wěn)定。比較4 種方法所得肉桂精油微膠囊總精油含量，揮發(fā)油測(cè)定法和紫外分光光度法為60%～70%，干燥失重法和混合溶劑提取法的精油回收率在80%以上（見(jiàn)表2）。根據(jù)《中國(guó)藥典》要求，回收率為80%～120%之間可接受。干燥失重法的測(cè)定結(jié)果顯示試驗(yàn)誤差最大，重復(fù)性差，而混合溶劑提取法試驗(yàn)誤差最小，重復(fù)性最好，且對(duì)不同含油量的微膠囊，精油的回收率均在80%以上（見(jiàn)表3），準(zhǔn)確度較高。

干燥失重法在抽濾過(guò)程中有一定的微膠囊粉末通過(guò)濾紙進(jìn)入濾液中，造成濾渣的損失，進(jìn)而使干燥后差值變大，測(cè)定的總精油含量比實(shí)際的偏大。用乙醇超聲破乳，不能完全將精油提取出來(lái)，使得結(jié)果偏小，此干燥失重法試驗(yàn)誤差大，重復(fù)性差。揮發(fā)油的測(cè)定方法在《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上做了改進(jìn)，使用同時(shí)蒸餾裝置，避免了長(zhǎng)時(shí)間靜置讓油水分離，減少小體積精油量在讀數(shù)上的誤差。總體上時(shí)間較長(zhǎng)，揮發(fā)油隨水蒸氣揮發(fā)的過(guò)程存在動(dòng)態(tài)平衡，長(zhǎng)時(shí)間蒸餾仍不能使精油完全揮發(fā)出來(lái)，而且長(zhǎng)時(shí)間高溫蒸餾，易使精油氧化。粘在蒸餾瓶壁上的微膠囊中沒(méi)有完全破乳，精油可能沒(méi)有完全蒸餾出來(lái)，導(dǎo)致對(duì)精油含量的測(cè)定也有影響。紫外分光光度法前處理復(fù)雜，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及稀釋待測(cè)溶液需稀釋上萬(wàn)倍以上，操作步驟繁瑣，在震蕩，離心，配制溶液等諸多環(huán)節(jié)均易產(chǎn)生人為操作誤差，還受紫外分光光度計(jì)穩(wěn)定性的影響，且需耗費(fèi)大量無(wú)水乙醇，成本較高，然而紫外分光光度法檢測(cè)速度較快?；旌先軇┨崛》Q(chēng)重法是在羅紫-哥特里法（堿性乙醚法）的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，僅用熱水與乙醇破壞壁材，防止精油在強(qiáng)堿溶液中不穩(wěn)定而導(dǎo)致變質(zhì)的現(xiàn)象，并且調(diào)整有機(jī)溶劑的加入比例，減少因高比例的石油醚使得精油在有機(jī)相的溶解度降低的現(xiàn)象。在提取過(guò)程中不能過(guò)于劇烈搖晃，否則容易發(fā)生乳化現(xiàn)象，旋干后也經(jīng)常需要二次萃取，需仔細(xì)操作。溶劑提取精油較完全，提取后的水相基本無(wú)精油風(fēng)味，時(shí)間短，重復(fù)性高。

3 結(jié)論

紫外分光光度法和揮發(fā)油測(cè)定法結(jié)果偏低。紫外分光光度法操作復(fù)雜，測(cè)試結(jié)果受諸多因素的影響，對(duì)操作者及儀器的要求均較高，需耗費(fèi)較多乙醇，相對(duì)成本較高。揮發(fā)油測(cè)定法操作簡(jiǎn)便、成本低，耗時(shí)較長(zhǎng)。干燥失重法由于濾渣的損失，試驗(yàn)誤差較大，測(cè)定結(jié)果偏高?；旌先軇┨崛【徒Y(jié)果較好，試驗(yàn)誤差較小。這4 種方法在測(cè)定肉桂精油微膠囊中精油含量時(shí)，混合溶劑提取法準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，為精油最佳的提取方法。