功能性便秘幼兒腸道菌群的16SrDNA和REP-PCR檢測分析及效果評價(jià)

王帆 王娟 翁明瑤 尹燕 文革生

[摘要] 目的 研究功能性便秘幼兒腸道菌群的16SrDNA和細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR技術(shù)（repetitive-element PCR，REP-PCR）檢測分析及效果評價(jià)。 方法 選取我院2018年1～12月收治的功能性便秘患兒80例作為觀察組，同期選取我院正常幼兒80例作為對照組。應(yīng)用16SrDNA片段擴(kuò)增和REP-PCR技術(shù)對兩組幼兒的糞便進(jìn)行檢測分析，并對觀察組患兒進(jìn)行益生菌治療。比較兩組幼兒的腸道常駐菌及優(yōu)勢菌群在門和在屬水平的差異性，計(jì)算出16SrDNA和REP-PCR檢測的靈敏度和特異度。 結(jié)果 對照組腸道菌群中放線菌門水平明顯低于觀察組，對照組腸道菌群中變形菌門水平明顯高于觀察組（P<0.05），兩組腸道菌群中無壁菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、梭菌屬門水平比較無明顯差異（P<0.05）;對照組腸道菌群中副桿狀菌屬、擬桿菌屬水平明顯低于觀察組，對照組腸道菌群中普氏菌屬水平明顯高于觀察組（P<0.05）;16SrDNA檢測的靈敏度為87.17%，特異度為92.03%，REP-PCR檢測的靈敏度為85.29%，特異度為84.25%。 結(jié)論 應(yīng)用16SrDNA和REP-PCR檢測分析功能性便秘幼兒腸道菌群具有重要價(jià)值，患兒腸道菌群表現(xiàn)為放線菌門、副桿狀菌屬、擬桿菌屬水平升高，變形菌門、普氏菌屬水平降低，對治療起到指導(dǎo)作用，值得在臨床推廣。

[關(guān)鍵詞] 功能性便秘幼兒;腸道菌群;16SrDNA;REP-PCR

[中圖分類號] R723.14? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）18-0001-04

[Abstract] Objective To study the detection analysis and effect evaluation on 16SrDNA and bacterial genome repetitive-element PCR（repetitive-element PCR， REP-PCR） for intestinal flora in children with functional constipation. Methods 80 children patients with functional constipation who were admitted to our hospital from January to December 2018 were selected as the study subjects and were assigned to the observation group. In the same period， 80 healthy children in our hospital were selected as the control group. The fragment amplification of 16SrDNA and REP-PCR techniques were used to detect and analyze the feces of the two groups of children， and the probiotics was used for treatment in the observation group. The differences were compared between the two groups of intestinal resident bacteria and dominant bacteria at the levels of phylum and genus. The sensitivity and specificity of 16SrDNA and REP-PCR detection were calculated. Results The level of Actinobacteria in the intestinal flora in the control group was significantly lower than that in the observation group. The level of Proteobacteria in the intestinal flora in the control group was significantly higher than that in the observation group（P<0.05）. There were no significant differences in the levels of Mycobacterium， Absidia， Bacteroides and Clostridium in the intestinal flora between the two groups（P<0.05）; in the control group， the levels of Parabacteroides and Bacteroides in the intestinal flora were significantly lower than those in the observation group. The level of Plasmodium in the intestinal flora in the control group was significantly higher than that in the observation group（P<0.05）; the sensitivity of 16SrDNA was 87.17%， and the specificity was 92.03%. The sensitivity of REP-PCR was 85.29%， and the specificity was 84.25%. Conclusion It is of a great value to analyze the intestinal flora of children with functional constipation by 16SrDNA and REP-PCR techniques. The intestinal flora of the children patients shows an increase in the levels of Actinobacteria， Parabacteroides， and Bacteroides， and an decrease in the levels of Proteobacteria and Plasmodium. It plays a guiding role in treatment and is worthy of clinical promotion.

[Key words] Functional constipation; Intestinal flora; 16SrDNA; REP-PCR

功能性便秘（functional constipation，F(xiàn)C）是常見于嬰幼兒時(shí)期的一種便秘類型，繼發(fā)于代謝病等非器質(zhì)性疾病，F(xiàn)C發(fā)病率受環(huán)境、地域、飲食等多種因素影響[1]。FC最初常見于中老年人，但隨著全球快速變化的生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)，F(xiàn)C總體發(fā)病率提高，據(jù)調(diào)查，現(xiàn)階段嬰幼兒發(fā)病率也已高達(dá)29.6%[2]。臨床上，排便難、糞便硬等是FC患兒最主要的臨床表現(xiàn)，當(dāng)FC患兒相繼出現(xiàn)惡化、腹脹、嘔吐、腸梗阻和穿孔等嚴(yán)重不良反應(yīng)，食欲不振是患兒常見伴發(fā)癥狀，嚴(yán)重影響嬰幼兒的生長發(fā)育。一直以來，關(guān)于FC的治療，效果并不明顯，臨床主要以飲食調(diào)整及針對性去除病因?yàn)橹?。?jù)報(bào)道，功能性便秘患兒的腸道菌群的改變是疾病的重要標(biāo)志，其可對疾病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行一定解釋[3-4]。因此，對患兒腸道菌群的構(gòu)成及比例進(jìn)行檢測，成為臨床主要的檢測手段，同時(shí)，也衍生出通過調(diào)節(jié)菌群平衡治療疾病的方法[5]。以往，臨床通過對細(xì)菌的培養(yǎng)進(jìn)行病原微生物的鑒定，該過程復(fù)雜繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間長達(dá)4 d，極易導(dǎo)致患兒不能及時(shí)就診，限制臨床的發(fā)展，因此目前臨床致力于更高效的檢測手段的探索[6]。近階段分子生物學(xué)得到飛速進(jìn)展，臨床上逐漸開始使用可代表生物結(jié)構(gòu)和功能的生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測，最常見的有DNA、RNA、蛋白質(zhì)等[7]。目前臨床依據(jù)原核生物中普遍存在16S rDNA基因短序列和細(xì)菌基因組內(nèi)短重復(fù)序列，提出16SrDNA和REP-PCR兩種分離鑒定微生物的方法[8-9]。然而，關(guān)于利用該方法對微生態(tài)菌群進(jìn)行分析的報(bào)道尚不多見[10]。因此，本研究采用16SrDNA和REP-PCR對功能性便秘幼兒的腸道菌群進(jìn)行檢測分析，并分析治療效果，旨在為臨床提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2018年1～12月收治的功能性便秘患兒80例作為觀察組，均符合2016年兒童功能性胃腸病羅馬Ⅳ診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，年齡<4歲的兒童至少符合以下2項(xiàng)條件，持續(xù)時(shí)間達(dá)1個(gè)月：①每周排便≤2次;②大量糞便潴留史;③有排便疼痛和排便費(fèi)力史;④排粗大糞便史;⑤直腸內(nèi)存在大量糞便團(tuán)塊。對于接受排便訓(xùn)練的兒童，以下條件也作為選項(xiàng)：①能控制排便后每周至少出現(xiàn)1次大便失禁;②粗大糞便曾堵塞抽水馬桶。所有患兒均排除器質(zhì)性病變，病程達(dá)1個(gè)月以上，患兒家屬均自愿參加并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有嚴(yán)重的先天性基礎(chǔ)器官缺陷畸形者;②合并有嚴(yán)重的惡性腫瘤者;③伴有嚴(yán)重血液性疾病者。同期選取我院正常幼兒80例作為對照組，兩組幼兒的一般資料比較均無顯著性差異（P>0.05），具有可比性，見表1。

1.2 方法

收集所有研究對象排便后4 h內(nèi)的糞便置于密閉避光的糞便儲存器內(nèi)作為糞便標(biāo)本待檢測，隨機(jī)迅速將裝有糞便標(biāo)本的糞便儲存器置于-80℃的低溫冰箱內(nèi)保存待檢，檢測時(shí)從標(biāo)本中稱取0.2 g糞便（不足0.2 g者記錄具體重量），并用QIAamp DNA Stool Mini Kit（QIAGEN）（北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司）從糞便細(xì)菌基因組中分離純化提取DNA，按說明書進(jìn)行操作，提取后迅速置于-20℃環(huán)境下保存待用。

1.2.1 16SrDNA檢測? 首先，采用1%瓊脂糖凝膠電泳對基因組DNA進(jìn)行檢測抽提;其次，利用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法進(jìn)行擴(kuò)增，并用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測混合后的同一樣本的PCR產(chǎn)物，并采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）對PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，隨即采用Tris-HCl對其進(jìn)行洗脫;然后，根據(jù)電泳檢測的初步定量結(jié)果，采用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測定量，隨即根據(jù)每個(gè)樣本的測序量具體要求，對其按比例進(jìn)行混合;最終，構(gòu)建Illumina平臺文庫，并采用Illumina平臺測序。

1.2.2 REP-PCR檢測? 采用BOX-PCR、ERIC-PCR、ERIC2-PCR、（GTG）5-PCR進(jìn)行細(xì)菌基因組內(nèi)重復(fù)序列檢測，同時(shí)采用REP-PCR技術(shù)對其進(jìn)行分析。其中，BOX-PCR、ERIC2-PCR和（GTG）5-PCR采用單引物擴(kuò)增，ERIC-PCR和REP -PCR采用雙引物擴(kuò)增。引物序列為：BOXA -1R 5′-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3′;ERIC1f 5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，ERIC2r 5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′（ERIC2r作為單引物用于ERIC2 -PCR）;（GTG）5 5′-GTGGTGGTGGTGGTG -3′;REP1r 5′-IIIICGICGICATCIGGC -3′，REP2I 5′-ICGICTTATCIGGCCTAC-3′。所有引物均來自Invitrogen 公司（美國英杰生命技術(shù)有限公司）。擴(kuò)增體系（50 μL）由50 ng DNA模板，1.5 U Hot Start Taq DNA聚合酶（TaKaRa，Dalian，China），1×PCR buffer（包含2.5 mmol/L MgCl2），2 mmol/L引物，200 mmol/L dNTP組成。REP-PCR 擴(kuò)增過程：除預(yù)變性95℃ 7 min和最后65℃延伸16 min外，還需進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)的過程在94℃環(huán)境下進(jìn)行3 s的變性，在92℃的環(huán)境下進(jìn)行30 s的變性，隨即退火1 min，并在65℃的環(huán)境下進(jìn)行8 min的延伸。其中，REP-PCR和（GTG）5 -PCR應(yīng)在40℃的環(huán)境下進(jìn)行退火，ERIC-PCR、ERIC2-PCR和BOX-PCR應(yīng)該在50℃的環(huán)境下退火。

1.2.3 凝膠電泳分析? 采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離，隨后應(yīng)用溴化乙錠（EB）染色，并在5 V/cm的條件下電泳，時(shí)間為3 h，電泳結(jié)果在UVI全自動凝膠成像分析系統(tǒng)（UVItec）上拍照，最后采用Quantity One 1-D Analysis Software進(jìn)行指紋圖譜相似性分析。

1.3觀察指標(biāo)

①比較兩組的腸道常駐菌及優(yōu)勢菌群在門水平差異性;②比較兩組的腸道常駐菌及優(yōu)勢菌群在屬水平差異性;③計(jì)算16SrDNA和REP-PCR檢測的靈敏度和特異度：假設(shè)真陽性人數(shù)為a，假陽性人數(shù)為b，假陰性人數(shù)為c，真陰性人數(shù)為d，則靈敏度=[a/（a+c）]×100%，特異度=[d/（b+d）]×100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用Z檢驗(yàn)，并繪制ROC曲線以AUC值評價(jià)各指標(biāo)診斷價(jià)值，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組的腸道常駐菌及優(yōu)勢菌群在門水平差異性比較

對照組腸道菌群中放線菌門（Actinobacteria）水平明顯低于觀察組（P<0.05），對照組腸道菌群中變形菌門（Proteobacteria）水平明顯高于觀察組（P<0.05），兩組腸道菌群中無壁菌門（Tenericutes）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、梭菌屬門（Fusobacteria）水平比較無明顯差異（P>0.05），見表2。

2.2 兩組的腸道常駐菌及優(yōu)勢菌群在屬水平差異性比較

對照組腸道菌群中副桿狀菌屬（Parabacteroides）、擬桿菌屬（Bacteroides）水平明顯低于觀察組，對照組腸道菌群中普氏菌屬（Prevotella_9）水平明顯高于觀察組（P<0.05），見表3。

2.3 兩種檢測方法的靈敏度和特異度比較

16SrDNA檢測的靈敏度為87.17%，特異度為92.03%，REP-PCR檢測的靈敏度為85.29%，特異度為84.25%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表4、封三圖1。

3討論

便秘是臨床上常見的幼兒疾病，兒童便秘中約有95%為功能性便秘，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，治療手段尚不成熟。功能性便秘的發(fā)生受飲食、地域等多方面影響，因此，時(shí)代的快速改變導(dǎo)致嬰幼兒功能性便秘發(fā)病率迅速增高，目前已成為全球性疾病[12]。陳煥等[13]在報(bào)道中指出，盡早診斷及治療是提高功能性便秘治療效果的關(guān)鍵，能預(yù)防幼兒功能性便秘的惡化，同時(shí)能減少功能性便秘對幼兒生長發(fā)育的影響，具有重要的臨床意義。因此，臨床越發(fā)致力于功能性便秘的診斷和治療。現(xiàn)階段，多項(xiàng)報(bào)道指出，正常機(jī)體胃腸道中存在大量細(xì)菌并構(gòu)成腸道微生態(tài)平衡，細(xì)菌種數(shù)多達(dá)500種，總數(shù)量高達(dá)1×1014個(gè)，而功能性便秘的發(fā)生受腸道菌群失衡的影響，表現(xiàn)為放線菌門、副桿狀菌屬、擬桿菌屬水平升高，變形菌門、普氏菌屬水平降低，可引起神經(jīng)系統(tǒng)和腸功能改變，尤其當(dāng)患兒處于0～3歲生長發(fā)育關(guān)鍵階段時(shí)，治療的不及時(shí)會嚴(yán)重阻礙患兒身體各系統(tǒng)的發(fā)育及智力的完善，大小便失禁成為患兒常見癥狀[14-15]。因此，通過對腸道菌群進(jìn)行分析可為功能性便秘的臨床檢測和治療提供新的方向。據(jù)研究，人糞便重量的60%是細(xì)菌，因此，腸道菌群的分析主要借助于糞便標(biāo)本，是遠(yuǎn)端結(jié)腸腔內(nèi)環(huán)境的主要代表[16]。以往，臨床培養(yǎng)分離細(xì)菌的方法有較多局限，僅有25%的細(xì)菌能被檢測出，敏感性差且受培養(yǎng)基影響大[17]。

功能性便秘患兒腸道菌群的分析為疾病的治療提供了指導(dǎo)，基于患兒腸道菌群的改變，多項(xiàng)研究指出，可以通過菌群的調(diào)整來達(dá)到治療效果，針對性更高。如李豪等[18]通過應(yīng)用雙歧桿菌三聯(lián)活菌制劑聯(lián)合常規(guī)藥物治療功能性便秘，總體療效提高，且預(yù)后質(zhì)量更佳。謝尚奎等[19]應(yīng)用益生菌治療便秘大鼠，恢復(fù)大鼠腸道菌群狀態(tài)效果顯著，并減少腸道排空時(shí)間。因此，通過分析患兒腸道菌譜并進(jìn)行針對性的改變，是一種新的治療理念，值得進(jìn)一步研究。

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)逐漸被分子技術(shù)所取代。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有原核生物體內(nèi)存在16SrDNA，最重要的是16SrDNA可以長久地保持其原有結(jié)構(gòu)，并不隨著生物進(jìn)化而發(fā)生改變，因此，16SrDNA被臨床用于檢測腸道菌群，具有靈敏度、特異度高等優(yōu)勢，可以檢測出絕大多數(shù)菌群。目前，已有少量研究將16SrDNA檢測應(yīng)用于菌群的分析，如李柏勝等[20]將16SrDNA檢測用于肝硬化患者腸道細(xì)菌毒性的研究，檢測效果顯著。而本研究是將16SrDNA檢測應(yīng)用于多功能便秘患兒的腸道菌群分析，原理一致，研究結(jié)果顯示，16SrDNA檢測的靈敏度為87.17%，特異度為92.03%，價(jià)值顯著。同時(shí)，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，一般情況下，細(xì)菌基因組內(nèi)存在大量重復(fù)性較高的短序列，在此基礎(chǔ)上，臨床逐漸衍生出REP-PCR技術(shù)，尤其是BOX-PCR、ERIC-PCR、ERIC2-PCR、（GTG）5-PCR、REP-PCR等技術(shù)，其檢測機(jī)制為通過提供清晰準(zhǔn)確的DNA指紋圖譜來顯示菌群種類，特異度和靈敏度表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，目前在生物遺傳多樣性方面已有廣泛應(yīng)用，而本研究是將REP-PCR技術(shù)應(yīng)用于微生態(tài)菌群多樣性的分析中，原理一致，本研究結(jié)果顯示，REP-PCR檢測的靈敏度為85.29%，特異度為84.25%，價(jià)值顯著。通過分析正常幼兒和患兒的腸道菌群在門、屬水平的差異，研究結(jié)果顯示，在門水平，對照組腸道菌群中放線菌門水平明顯低于觀察組，對照組腸道菌群中變形菌門水平明顯高于觀察組，兩組腸道菌群無壁菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、梭菌屬門水平比較無明顯差異，同時(shí)，在屬水平，對照組腸道菌群中副桿狀菌屬、擬桿菌屬水平明顯低于觀察組，對照組腸道菌群中普氏菌屬水平明顯高于觀察組，證明多功能便秘的腸道菌群具有明顯的特異性改變，兩種分子檢測方法具有顯著優(yōu)勢，對臨床診治指導(dǎo)價(jià)值高。

綜上所述，應(yīng)用16SrDNA和REP-PCR檢測分析功能性便秘幼兒腸道菌群具有重要價(jià)值，并針對性指導(dǎo)治療，值得在臨床推廣。

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（收稿日期：2019-03-14）