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    大鼠血清25羥維生素D水平與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的關(guān)系

    2019-09-02 08:04:08劉兵
    安徽醫(yī)藥 2019年9期
    關(guān)鍵詞:晶狀體眼壓空白對(duì)照

    劉兵

    作者單位:自貢市第四人民醫(yī)院眼科,四川 自貢 643000

    年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract,ARC)又稱老年性白內(nèi)障,是一種與年齡密切相關(guān)的白內(nèi)障疾?。?-2]。作為我國(guó)最常見的致盲性眼病,隨著全國(guó)人口平均壽命的延長(zhǎng),年齡相關(guān)性白內(nèi)障的患病率也在逐年增加[3-4]。關(guān)于老年性白內(nèi)障的預(yù)防及治療引起了越來越多學(xué)者的關(guān)注。25羥維生素D(25-OH-VD)是維生素D在體內(nèi)的主要存在形式,作為人體中不可或缺的營(yíng)養(yǎng)素之一,它不僅影響鈣磷的代謝,而且有廣泛的生理作用,是維持人體健康、細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育的必不可少的物質(zhì)[5-6]。血清中25羥維生素D的高低可以反映人體維生素D的儲(chǔ)存水平,與多種疾病密切相關(guān)[7-8]。關(guān)于血清25羥維生素D水平與年齡相關(guān)性白內(nèi)障關(guān)系的報(bào)道較少,其作用機(jī)制目前也不清楚。因此,本研究自2017年2月至2018年2月通過注射補(bǔ)充維生素D的方式調(diào)節(jié)血清內(nèi)25羥維生素D水平,觀察其對(duì)年齡相關(guān)性白內(nèi)障的影響,并探討其可能的作用機(jī)制。

    1 資料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康1月齡SPF級(jí)Wistar大鼠,體質(zhì)量范圍為50~60 g,雌雄各半,購于北京維通利華有限責(zé)任公司,室溫、12 h∶12 h明暗交替喂養(yǎng)。動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2015-0001。本研究對(duì)大鼠的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)原則。

    1.2 方法

    1.2.1年齡相關(guān)性白內(nèi)障大鼠模型構(gòu)建 Wistar大鼠采用1%阿托品滴眼液進(jìn)行散瞳處理后,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、年齡相關(guān)性白內(nèi)障模型組、維生素D低劑量組(維生素D1 250 IU/d)、維生素D高劑量組(維生素D2 500 IU/d),每組10只。

    實(shí)驗(yàn)開始前,對(duì)照組與模型組大鼠舌下靜脈注射10%葡萄糖溶液(5 mL/kg),維生素D對(duì)照組注射維生素D葡萄糖溶液。15 min后,除空白對(duì)照組外,其余三組均腹腔注射50%濃度的D-半乳糖生理鹽水注射液(劑量為25 g-1·kg-1·d-1),對(duì)照組注射等量的生理鹽水。連續(xù)注射3周并定期對(duì)大鼠進(jìn)行散瞳處理,觀察晶狀體渾濁情況。

    注:本研究的造模方法“大鼠舌下靜脈注射10%葡萄糖溶液(5 mL/kg),維生素D對(duì)照組注射維生素D葡萄糖溶液。15 min后,除空白對(duì)照組外,其余三組均腹腔注射50%濃度的D-半乳糖生理鹽水注射液(劑量為25 g-1·kg-1·d-1)”,其誘發(fā)白內(nèi)障的原理是晶狀體前皮質(zhì)和核的混濁,其與臨床的青光眼性白內(nèi)障發(fā)病途徑比較接近。青光眼性白內(nèi)障即為青光眼引起的白內(nèi)障多由晶狀體前皮質(zhì)和核開始,逐漸使晶狀體全混濁。以后水分吸收,囊膜增厚,晶狀體囊膜皺縮,并有鈣化等變化。其關(guān)鍵病因即為晶狀體的變化,故檢測(cè)眼壓以明確其癥狀的進(jìn)展情況。

    1.2.2眼壓及血清中25羥維生素D的檢測(cè) 采用眼壓計(jì)檢測(cè)大鼠眼壓,結(jié)果取3次平均值;采集外周血(眼底取血),EIA法測(cè)定血清中25羥維生素D的含量。

    1.2.3晶狀體上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng) 大鼠頸處死后取晶狀體上皮組織,生理鹽水沖洗后剪碎并加入胰蛋白酶(1.5 g/L)消化培養(yǎng)25 min(37℃、5%二氧化碳);然后加入含有5%FBS的DMEM培養(yǎng)基,離心并用PBS洗滌,該過程重復(fù)3次。隨后調(diào)整細(xì)胞水平并接種于培養(yǎng)板上,細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng),2~3 d更換1次培養(yǎng)液。細(xì)胞傳代3次后收集細(xì)胞,以便后續(xù)檢測(cè)。

    1.2.4聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)DPPⅡ、cmycmRNA基因表達(dá)的變化 采用RT-PCR方法檢測(cè)DPPⅡ、c-mycmRNA基因表達(dá)水平。PCR擴(kuò)增條件為:97℃預(yù)變性2.5 min,94℃變性30 s,60℃退火25 s,70℃延伸30 s,循環(huán)30次,最后72℃延伸60 s。取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物和6 μL的DGL-200 Maker同時(shí)上樣,于2.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離,紫外凝膠成像系統(tǒng)分析擴(kuò)增結(jié)果并拍照。DPPⅡ、c-myc以及βactin引物設(shè)計(jì),見表1。

    1.2.5免疫印跡(Western Blot)分析相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化 配置一定濃度的SDS-聚丙烯酰胺電泳凝膠并置于電泳槽上,分別取各組條件下的蛋白15μL上樣并電泳。電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉并用TBST清洗后分別加入稀釋過的蛋白抗體(1抗),4℃過夜,TBST清洗4次(每次5 min);隨后加入HRP標(biāo)記的2抗,37℃孵育2 h,TBST洗4次×5 min。設(shè)立陰性對(duì)照組,以GAPDH單克隆體為一抗,HRP標(biāo)記的IgG為二抗。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究中數(shù)據(jù)全部采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件(美國(guó)IBM公司)進(jìn)行處理;計(jì)量資料采用±s表示,組間比較采用單因素方差分析或者重復(fù)測(cè)量的方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用百分率(%)表示,組間比較采用χ2分析;P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組基本情況白內(nèi)障模型組、維生素D給藥組與空白對(duì)照組大鼠的基本情況見表1。由表1可知,對(duì)照組、模型組及各給藥組之間大鼠體質(zhì)量、收縮壓及舒張壓均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)且均在正常范圍內(nèi),見表2。

    表1 PCR過程中引物序列設(shè)計(jì)

    表2 白內(nèi)障模型組、給藥組與對(duì)照組大鼠基本情況/±s

    表2 白內(nèi)障模型組、給藥組與對(duì)照組大鼠基本情況/±s

    組別空白對(duì)照組白內(nèi)障模型組維生素D低劑量組維生素D高劑量組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10體質(zhì)量/g 54.62±7.65 54.49±8.54 55.85±8.72 56.42±4.55 1.346 0.412收縮壓/mmHg 121.32±6.05 120.49±6.54 120.85±5.72 120.35±6.25 1.287 0.399舒張壓/mmHg 77.62±5.25 78.43±4.94 78.62±5.37 78.30±5.20 1.453 0.428

    2.2 25羥維生素D水平與年齡相關(guān)性白內(nèi)障大鼠眼壓的關(guān)系與空白對(duì)照組相比,白內(nèi)障模型組25羥維生素D水平降低,眼壓升高;維生素D給藥后,維生素D水平較模型組升高,眼壓降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(25羥維生素D水平:F=9.215,P=0.007;眼壓:F=12.502,P=0.005),且以高劑量給藥組效果最明顯,且隨著維生素D水平的升高,大鼠眼壓逐漸降低,見表3。

    2.3 25羥維生素D水平與白內(nèi)障大鼠晶狀體渾濁情況的關(guān)系裂隙燈顯微鏡觀察可知,空白對(duì)照組大鼠始終保持晶狀體透明;注射3周后,白內(nèi)障模型組中2只晶狀體高度渾濁(3級(jí)),8只晶狀體呈肉眼可見的渾濁(4級(jí))。姜黃素低劑量給藥后,4只大鼠晶狀體呈3級(jí)渾濁,6只大鼠晶狀體呈4級(jí)渾濁;高劑量給藥后,分別有2只、4只、6只大鼠呈現(xiàn)2級(jí)、3級(jí)和4級(jí)渾濁。綜合分析25羥維生素D水平與白內(nèi)障大鼠晶狀體渾濁情況可知,血清中維生素D水平越低,晶狀體渾濁程度越嚴(yán)重;給藥后,血清中維生素D水平有一定程度的恢復(fù),晶狀體渾濁程度降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.635,P=0.003),見表4。

    表3 25羥維生素D水平與年齡相關(guān)性白內(nèi)障大鼠眼壓的關(guān)系/xˉ± s

    2.4 25羥維生素D水平對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞LEC凋亡的影響各組LEC細(xì)胞凋亡率均隨時(shí)間延長(zhǎng)而緩慢增加;白內(nèi)障模型組晶體上皮細(xì)胞凋亡率高于空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.212,P=0.016);與模型組相比,給藥組各時(shí)間段的LEC細(xì)胞凋亡率下降,且以高劑量組降低效果最明顯。綜合分析25羥維生素D水平與LEC細(xì)胞凋亡率可知,血清中維生素D水平越低,LEC細(xì)胞凋亡率越高;給藥后,血清中維生素D水平有一定程度的回升,LED凋亡程度降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1周:F=10.258,P=0.0111;2周:F=13.390,P=0.005;4周:F=14.157,P=0.003),見表5。

    2.5 血清中25羥維生素D水平對(duì)年齡相關(guān)性白內(nèi)障大鼠晶狀體上皮細(xì)胞DPPⅡ、c-myc基因表達(dá)水平的影響與對(duì)照組相比,白內(nèi)障模型組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞DPPⅡ、c-myc基因表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥后,隨著血清中25羥維生素D水平的回升,DPPⅡ、c-myc表達(dá)的降低,且血清中維生素D水平較高時(shí)降低效果更為明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明,血清中25羥維生素D可有效抑制DPPⅡ、c-myc基因的表達(dá),從而達(dá)到減緩并抑制白內(nèi)障的發(fā)病,見表6,圖1。

    表5 25羥維生素D水平對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞LEC凋亡的影響/±s

    表5 25羥維生素D水平對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞LEC凋亡的影響/±s

    組別空白對(duì)照組白內(nèi)障模型組維生素D低劑量組維生素D高劑量組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 25羥維生素D水平/(ng/mL)21.53±4.25 19.20±2.63 26.46±3.51 35.32±4.52 8.212 0.016 LEC細(xì)胞凋亡率/%1周3.42±1.93 12.60±2.26 8.86±2.34 6.07±3.13 10.258 0.011 2周4.35±1.06 18.23±3.06 10.24±2.87 8.23±2.06 13.390 0.005 4周6.52±1.76 25.72±4.24 13.52±3.40 10.72±2.24 14.157 0.003

    表6 血清中25羥維生素D水平對(duì)DPPⅡ、c-myc基因表達(dá)水平的影響/(ng/mL,±s)

    表6 血清中25羥維生素D水平對(duì)DPPⅡ、c-myc基因表達(dá)水平的影響/(ng/mL,±s)

    組別空白對(duì)照組白內(nèi)障模型組維生素D低劑量組維生素D高劑量組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 DPPⅡ(灰度值)1.31±0.06 4.18±0.21 2.31±0.72 2.03±0.40 11.217 0.008 c-myc(灰度值)1.02±0.05 3.89±0.31 2.25±0.62 1.91±0.41 13.087 0.005

    圖1 RT-PCR檢測(cè)DPPⅡ、c-myc基因表達(dá)情況

    2.6 血清中25羥維生素D水平對(duì)年齡相關(guān)性白內(nèi)障大鼠晶狀體上皮細(xì)胞TNF-α、IL-8蛋白表達(dá)水平的影響與對(duì)照組相比,模型組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞TNF-α、IL-8蛋表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥組與模型組相比,隨著血清中25羥維生素D水平回升,均有下調(diào)TNF-α、IL-8表達(dá)的效果,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且血清中維生素D水平較高時(shí)降低效果更明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明,血清中25羥維生素D可有效抑制TNF-α、IL-8基因的表達(dá),從而達(dá)到減緩并抑制白內(nèi)障的發(fā)病,見表7,圖2。

    表7 NE及BOD對(duì)感染性休克大鼠TNF-α、IL-8蛋白表達(dá)水平的影響/±s

    表7 NE及BOD對(duì)感染性休克大鼠TNF-α、IL-8蛋白表達(dá)水平的影響/±s

    指標(biāo)空白對(duì)照組白內(nèi)障模型組維生素D低劑量組維生素D高劑量組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 TNF-α(灰度值)1.25±0.04 5.28±0.21 3.48±0.61 2.63±0.31 12.023 0.002 IL-8(灰度值)1.12±0.08 4.63±0.50 2.59±0.71 2.14±0.30 10.419 0.005

    圖2 Western Blot檢測(cè)TNF-α、IL-8蛋白表達(dá)情況

    3 討論

    年齡相關(guān)性白內(nèi)障是一種與年齡相關(guān)的致盲率較高的晶狀體渾濁性疾?。?-10]。隨著年齡的增長(zhǎng),晶狀體中變性蛋白質(zhì)和脂質(zhì)不斷累積,在多種因素的綜合作用下導(dǎo)致白內(nèi)障疾病的產(chǎn)生[11-12],其公認(rèn)的治療手段為手術(shù)治療,但早期白內(nèi)障術(shù)后療效不佳,部分病人不適于手術(shù),因此預(yù)防就顯得尤為重要。

    DPPⅡ(二肽基肽酶Ⅱ)作為一種細(xì)胞內(nèi)溶酶體蛋白酶,廣泛存在于晶狀體中,與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)病密切相關(guān)[13]。c-myc基因是原癌基因家族的重要成員,與晶狀體上皮細(xì)胞的增殖、分化和凋亡密切相關(guān),它的過度表達(dá)可促進(jìn)白內(nèi)障的發(fā)生[14-15]。TNF-α由LPS刺激過量產(chǎn)生,可通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞及誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生導(dǎo)致炎癥及組織損傷,在炎癥反應(yīng)中有重要作用[16-17]。IL-8是趨化因子家族的一員,有多重免疫調(diào)節(jié)功能,在囊性纖維化發(fā)病過程中起重要作用[18-20]。

    本研究發(fā)現(xiàn),白內(nèi)障模型組大鼠血清中25羥維生素D水平降低,眼壓較高;給藥后血清中維生素D水平上升,眼壓降低,即D-半乳糖誘導(dǎo)后,血清中25羥維生素D水平與眼壓負(fù)相關(guān)。而且,隨著血清中維生素D水平升高,可降低D-半乳糖誘導(dǎo)年齡相關(guān)性白內(nèi)障的嚴(yán)重程度,誘導(dǎo)建模后血清中25羥維生素D水平與晶體渾濁情況負(fù)相關(guān)。血清中維生素D水平越低,LEC細(xì)胞凋亡率越高;給藥后,血清中維生素D水平有較大程度的升高,LED凋亡程度降低,即誘導(dǎo)建模后血清中25羥維生素D水平與晶狀體上皮細(xì)胞LEC凋亡呈負(fù)相關(guān)。此外,血清中25羥維生素D可抑制DPPⅡ、c-myc的表達(dá),下調(diào)TNF-α、IL-8水平,且高劑量給藥組抑制作用最強(qiáng)。血清中25羥維生素D可下調(diào)溶酶體蛋白酶DPPⅡ、原癌基因c-myc、癌細(xì)胞死亡因子TNF-α、炎癥因子IL-8的表達(dá),保護(hù)晶狀體上皮細(xì)胞,延緩其凋亡,從而達(dá)到延緩年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展的作用。本研究結(jié)果表明,血清中25羥維生素水平與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展呈負(fù)相關(guān),這可能與其下調(diào)DPPⅡ、cmyc、TNF-α、IL-8的表達(dá)有關(guān)。但是其具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的探討和研究。本研究提示,提高血清中25羥維生素D水平對(duì)年齡相關(guān)性白內(nèi)障的預(yù)防及治療有十分重要的意義,同時(shí)也為維生素D作為年齡相關(guān)性白內(nèi)障病人保健藥品的臨床應(yīng)用提供理論支持。

    綜上所述,血清中25羥維生素D水平與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)展負(fù)相關(guān),這對(duì)于白內(nèi)障的預(yù)防及治療有十分重要的意義。

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