雷奈酸鍶對抗地塞米松誘導大鼠骨質(zhì)疏松的作用

黃歆，汪瑜，羅梅懿，宋永丹，楊浩森

作者單位：1成都市第七人民醫(yī)院骨科，四川 成都 610000；2四川省人民醫(yī)院骨科，四川 成都 610000

骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）是一種以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨脆性增加和易于發(fā)生骨折的全身性骨代謝疾病［1］。該病多見于絕經(jīng)后婦女、老年男性和多種慢性病病人，日益引起人們的重視。當前，治療骨質(zhì)疏松的藥物主要有三類：①抑制骨吸收，如雌激素、降鈣素（CT）、雙膦酸鹽；②促骨形成，如甲狀旁腺激素（PTH）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）；③促進骨礦化，如鈣劑［2］。雷奈酸鍶是可以促進骨形成和抑制骨吸收的雙重作用新型藥物，是近年來治療和預防骨質(zhì)疏松的藥物研究熱點［3］。為考察雷奈酸鍶抗骨質(zhì)疏松的藥物作用及機制，本研究自2017年10月至2018年2月采用肌內(nèi)注射地塞米松方式，建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，通過考察骨形態(tài)學以及血清相關(guān)骨代謝標志物，評估雷奈酸鍶抗骨質(zhì)疏松效果，為臨床應用雷奈酸鍶治療提供客觀的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及藥物雷奈酸鍶干混懸劑，每袋2 g，法國施維雅藥廠，生產(chǎn)批號H20120291；地塞米松注射液，每支2.5 mg，Sigma公司，生產(chǎn)批號H44024469；Rat IL-6 ELISA檢測試劑盒，Rat BALP ELISA檢測試劑盒，Rat TRACP 5b ELISA檢測試劑盒，Rat CTXI ELISA檢測試劑盒，Rat OCN ELISA檢測試劑盒，Rat HVD ELISA檢測試劑盒；多聚甲醛、伊紅液、蘇木素（AR級）；MEM培養(yǎng)基、南美胎牛血清，等。

1.2 主要儀器Multlskan酶標儀（賽默飛世爾），DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)），UPH-Ⅱ-10T優(yōu)譜超純水（成都超純科技）；轉(zhuǎn)輪式切片機（徠卡-2016，德國），TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機（中威電子），BMJ-Ⅲ型包埋機（中威電子），PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀（中威電子），BA400Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡（麥克奧迪）；倒置生物顯微鏡AE31（麥克奧迪），MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱（三洋電機）；SYQ-DSX-280B壓力蒸汽滅菌器（上海宜川），BN-200高精密電子天平（臺灣巨林櫻花）。

1.3 實驗動物6～8周齡SPF級雌性SD大鼠30只；體質(zhì)量（226±8）g；3月齡SPF級雌性SD大鼠24只，體質(zhì)量（270±12）g，購于成都達碩實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川2013-24），使用許可證號：SYXK（川2014-189）。動物處置符合動物倫理學要求。

1.4 大鼠骨質(zhì)疏松模型制備及實驗分組6～8周齡清潔級雌性SD大鼠30只，飼喂常規(guī)飼料，自由飲水，清潔級飼養(yǎng)。將大鼠隨機分為5組：空白對照組（不做處理），模型組（每周2次地塞米松1 mg/kg肌肉注射），雷奈酸鍶高劑量組（每周2次地塞米松1 mg/kg肌肉注射+每天1次灌胃雷奈酸鍶800 mg/kg），雷奈酸鍶中劑量組（每周2次地塞米松1 mg/kg肌注+每天1次灌胃雷奈酸鍶600 mg/kg），雷奈酸鍶低劑量組（每周2次地塞米松1 mg/kg肌肉注射+每天1次灌胃雷奈酸鍶400 mg/kg），同室常規(guī)飼養(yǎng)5周，第5周最后1次給藥結(jié)束后2 h，采集樣本，用于指標檢測。

1.5 左脛骨組織形態(tài)學測定處死大鼠，分離左脛骨，用4%多聚甲醛固定3 d，然后10%EDTA脫鈣5周，用電鋸從矢狀面剖開，暴露骨髓腔并取左脛骨近端，制備常規(guī)脫鈣骨組織蠟塊，切4 μm厚骨組織切片，HE染色，光鏡下觀察骨形態(tài)改變，每張切片選取5個視野，取其平均值，利用MOTIC Med 6.0型圖象分析系統(tǒng)進行骨組織形態(tài)測量，計算骨形態(tài)指標：平均骨小梁間距（Tb.sp），平均骨小梁厚度（Tb.Th）。

1.6 血清指標檢測

1.6.1血清采集 處死大鼠前，在乙醚麻醉狀態(tài)下從背部主動脈采集血液，血液收集后，4℃靜置3 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清，分裝于小EP管中，-70℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2指標檢測 按試劑盒說明，采用ELISA法，檢測血清白介素-6（IL-6）、血骨堿性磷酸酶（BALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP 5b）、I型膠原C端肽（CTX-I）、骨鈣素（OCN）和25-羥維生素D（25-HVD）。

1.7 細胞指標檢測

1.7.1載藥血清的制備 按參考文獻［4］方法，制備雷奈酸鍶載藥血清。取3月齡雌性SD大鼠24只，采用隨機數(shù)字表法分為4組（n＝6）：雷奈酸鍶低、中、高劑量給藥組和空白對照組。雷奈酸鍶劑量組，按人鼠體表面積法換算，以成人臨床等效劑量的1、3、9倍劑量灌胃，對照組灌胃等體積的生理鹽水。每天1次，連續(xù)給藥7 d，末次給藥后2 h，無菌操作，心臟取血，3 000 r/min離心30 min，分離血清，56℃水浴30 min滅活。采用0.22 μm濾器除菌，-70℃保存?zhèn)溆?。用時以無血清DMEM稀釋為10%濃度的含藥血清。

1.7.2大鼠成骨細胞分離培養(yǎng) 按參考文獻［4］，無菌條件下，取24 h內(nèi)新生大鼠顱蓋骨，去除骨縫及骨膜組織，用預冷的PBS清洗3次，之后用0.25%胰酶消化清除脂肪和軟組織，剪成1 mm3的小塊，0.1%膠原酶消化45 min，再用無血清DMEM沖洗，置20%小牛血清DMEM培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)。

1.7.3雷奈酸鍶對大鼠成骨細胞增殖的影響 消化收集成骨細胞，調(diào)節(jié)細胞密度為每毫升4×104個，按照每孔200 μL接種于96孔板，貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，在相應的培養(yǎng)孔內(nèi)分別加入高、中、低劑量的雷奈酸鍶的含藥血清及空白血清，每組均設6個復孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入200 μL 0.5%MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），置搖床上低速振蕩10 min后，用酶標儀檢測OD570nm處各孔的吸光值。

1.8統(tǒng)計學方法應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，所有計量資料以xˉ+s表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較為HSD-q檢驗。檢驗水準α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨組織形態(tài)學觀察HE染色結(jié)果提示，地塞米松模型組大鼠骨小梁變細、數(shù)量明顯減少，排列疏松，甚至斷裂，骨小梁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)較多大的空白區(qū)域；雷奈酸鍶中、高劑量組（600，800 mg/kg）骨小梁變粗且致密，骨連續(xù)性較好，排列較為規(guī)則（圖1）。MOTIC Med 6.0型圖像系統(tǒng)分析，較模型組，雷奈酸鍶中、高劑量組的平均骨小梁厚度明顯升高（P＜0.05），骨小梁間距明顯降低（P＜0.05）。見表1。

圖1 各組大鼠骨組織（HE染色×200）：A為高劑量組；B為中劑量組；C為低劑量組；D為空白組；E為模型組

表1 雷奈酸鍶對骨質(zhì)疏松大鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響/（μm，±s）

表1 雷奈酸鍶對骨質(zhì)疏松大鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響/（μm，±s）

注：與模型組相比aP＜0.05，Tb.Th為平均骨小梁厚度，Tb.sp為平均骨小梁間距

組別 鼠數(shù)T b.T h T b.s p空白對照組模型組高劑量組中劑量組低劑量組F值P值6 6 6 6 6 5 3.9 2±3.3 9 a 3 8.0 0±2.3 6 5 2.0 0±4.4 4 a 4 8.5 0±4.0 5 a 4 0.8 4±3.1 2 2 3.0 6 4 0.0 0 0 1 4 2.0 6±1 1.1 5 a 1 8 9.9 0±1 9.2 7 1 5 0.0 2±2 0.8 6 a 1 5 4.2 6±1 3.8 6 a 1 7 4.6 0±1 1.7 1 9.1 5 8 0.0 0 0

2.2 血清指標檢測模型組與空白組相比，所有檢測指標均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明所選指標，具有良好的指示作用。雷奈酸鍶高劑量組較模型組大鼠血清IL-6、BALP、TRACP 5b、CTX-I均明顯降低（P＜0.05，P＜0.05），OCN、25-HVD明顯升高（P＜0.05）。見表2。

2.3 大鼠成骨細胞增殖影響雷奈酸鍶高、中、低含藥血清組OD值和空白組比較，高、中劑量組有明顯細胞增殖作用（P＜0.05）；低劑量組細胞增殖作用不明顯（P＞0.05）。結(jié)果表明，高、中劑量雷奈酸鍶載藥血清對大鼠成骨細胞增殖有明顯促進作用（表3）。

表2 清潔級雌性SD大鼠30只實驗分組后各組相應指標變化情況/±s

表2 清潔級雌性SD大鼠30只實驗分組后各組相應指標變化情況/±s

注：與模型組相比aP＜0.05，IL-6為白介素-6、TRACP 5b為抗酒石酸酸性磷酸酶5b、CTX-I為I型膠原C端肽、OCN為骨鈣素，25-HVD為25-羥維生素D

組別空白對照組模型組高劑量中劑量低劑量F值P值鼠數(shù)6 6 6 6 6 IL-6/（ng/L）20.18±3.41a 24.36±1.54 21.25±1.79a 22.85±2.57 23.16±2.79 2.582 0.062 BALP/（ng/mL）1.35±0.15a 3.48±0.51 2.31±0.21a 2.94±0.42 3.09±0.72 20.433 0.000 TRACP 5b/（U/L）2.85±0.71a 5.70±0.94 4.18±0.95a 4.51±0.78a 4.73±0.66 9.569 0.000 CTX-I/（ng/L）187.87±29.95a 357.16±36.90 279.73±43.69a 305.98±50.58 325.45±42.85 14.499 0.000 OCN/（ng/mL）6.08±0.73a 4.37±0.95 5.62±1.05a 5.00±0.40 5.18±0.99 3.407 0.024 25-HVD/（ng/mL）27.78±2.43a 20.94±2.97 24.51±1.11a 23.34±2.49 22.83±3.66 5.414 0.003

表3 雷奈酸鍶對大鼠成骨細胞增殖的影響/±s

表3 雷奈酸鍶對大鼠成骨細胞增殖的影響/±s

注：劑量組與空白對照組相比，aP＜0.05

組別 鼠數(shù)O D值空白對照組高劑量組中劑量組低劑量組F值P值6 6 6 6 0.3 8±0.0 1 0.4 5±0.0 2 a 0.4 0±0.0 2 a 0.3 9±0.0 1 2 5.2 7 0 0.0 0 0

3 討論

骨質(zhì)疏松是系統(tǒng)性骨骼性疾病，西醫(yī)認為，其發(fā)病機制在于骨形成代謝過程中，骨吸收和骨形成發(fā)生失衡。臨床表現(xiàn)為骨小梁變細變薄，斷裂，數(shù)量減少，孔隙變大，生物力學性能降低，骨密度下降，往往伴隨骨微觀結(jié)構(gòu)退化和骨量降低，骨脆性增加，病人易發(fā)生骨折［5］。雷奈酸鍶化學名為5-［二（羧甲基）氨基］-3-羧甲基-4-氰基-2-噻吩羧酸二鍶鹽，是由穩(wěn)定態(tài)鍶原子和有機雷奈酸組成［6］，新型的抗骨質(zhì)疏松藥物。本研究以地塞米松誘導大鼠骨質(zhì)疏松為病理模型，首先考察了不同劑量的雷奈酸鍶對模型鼠骨形態(tài)學影響。骨質(zhì)疏松癥的重要特征是骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化。骨小梁的數(shù)量、骨連續(xù)性、排列構(gòu)象以及平均骨小梁間距、平均骨小梁厚度等顯微結(jié)構(gòu)影響著骨的生物力學特性，因此骨顯微結(jié)構(gòu)指標的改變可以更直接地反映骨質(zhì)疏松的情況。骨組織病理學檢測是反映骨顯微結(jié)構(gòu)變化的最直接的依據(jù)，評價骨顯微結(jié)構(gòu)的金標準［7］。本實驗結(jié)果表明，雷奈酸鍶高劑量組的骨小梁變粗且致密，骨連續(xù)性較好，排列較為規(guī)則，相比對照組，可以顯著改善骨小梁間距、平均骨小梁厚度。提示雷奈酸鍶對改善顯微結(jié)構(gòu)具有一定的療效。

本研究還考察了雷奈酸鍶對骨代謝血清標志物以及對成骨細胞增殖的影響。IL-6、BALP、5b（TRACP 5b）和CTX-I是骨質(zhì)疏松的指示性血清指標。IL-6可由造血干細胞、破骨細胞、成骨細胞等多種細胞分泌，是調(diào)節(jié)骨代謝的重要蛋白質(zhì)因子之一。IL-6不僅可直接刺激骨吸收，還能刺激骨髓的多核細胞呈現(xiàn)破骨細胞的表現(xiàn)型，加速骨吸收［8］。臨床研究也證實：骨質(zhì)疏松病人血清IL-6水平明顯高于同齡正常人［9］。BALP由成骨細胞分泌，在成骨過程中BALP水解膦酸酯，促進基質(zhì)礦化［10］，骨質(zhì)疏松病人BALP活性增高［11］。TRACP在血液循環(huán)中，有兩種形式：TRACP5a和TRACP5b，其水平大體相等［12］。血清TRACP5a來源于巨噬細胞，是細胞活躍狀態(tài)的標志［13］；而血清TRACP5b雖然可來源于巨噬細胞和破骨細胞，但由激活的巨噬細胞分泌的TRACP5b無酶活性，只有破骨細胞來源的TRACP5b才具有酶活性，因此TRACP5b可作為破骨細胞數(shù)量和骨吸收的有效標志物［14-15］。臨床研究表明，骨質(zhì)疏松病人，血清TRACP5b活性增高［16-18］。骨纖維主要是由Ⅰ型膠原蛋白形成，CTX-I可反映破骨細胞活性及骨吸收的指標，臨床上骨質(zhì)疏松病人CTX-I升高，其是骨轉(zhuǎn)換標志物中首選的風險評估指標［19-21］。本實驗模型組血清IL-6、BALP、5b（TRACP 5b）和CTX-I均顯著高于正常組，從指示性血清指標的角度印證了骨質(zhì)疏松造模成功，雷奈酸鍶高劑量組可顯著降低上述血清指標，對抗骨質(zhì)疏松導致的指示性血清指標的上升。OCN是由成骨細胞合成分泌的一種特異性非膠原蛋白，當骨形成和骨吸收去耦合時是骨形成的特異性標志物［22］；25-HVD雖然不能直接反映出成骨細胞和破骨細胞的活性，但是由于其能調(diào)節(jié)鈣、磷的代謝，因此其對骨代謝也有重要影響［23］。臨床上骨質(zhì)疏松病人的血清OCN和25-HVD均降低［24-25］。本實驗結(jié)果表明，高劑量的雷奈酸鍶可顯著的改善血清OCN和25-HVD，對抗骨質(zhì)疏松導致的其血清水平降低。體外培養(yǎng)的成骨細胞因具有與體內(nèi)成骨細胞相同的生物特性，體外培養(yǎng)成為研究骨代謝和成骨機制的重要手段。本研究實驗表明，雷奈酸鍶可促進體外成骨細胞增殖。

雷奈酸鍶可改善骨微細結(jié)構(gòu)和骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，降低血清IL-6、BALP、5b（TRACP 5b）、CTX-I，提升血清骨鈣素、25-羥維生素D，同時能夠促進成骨細胞增殖，抑制骨吸收和促進骨形成，發(fā)揮對骨的保護作用，具有治療骨質(zhì)疏松的作用。（本文圖1見插圖9-2）