均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化人參單芽誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基

陳雙越, 包悅琳, 陳 鴿， 李 昂， 金東淳

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 1330021)

人參具有重要的醫(yī)療保健價(jià)值和巨大的經(jīng)濟(jì)效益，自古以來就被人們視為珍品[1-3]。但是人參的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、繁殖系數(shù)少、常異花授粉等生物學(xué)特性嚴(yán)重制約著品種選育進(jìn)程，同時(shí)也是基礎(chǔ)性研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其它植物的主要原因[4]。利用組織培養(yǎng)方法，建立高效、穩(wěn)定的人參再生植株體系是克服這些不利因素，加快新品種選育進(jìn)程，提高基礎(chǔ)研究水平的有效途徑[5-7]。然而，人參的常規(guī)組織培養(yǎng)同樣存在難度大、發(fā)根難、再生植株頻率低等諸多問題[8-9]。鑒于人參繁殖及育種的難題，國(guó)內(nèi)外研究人員試圖通過生物技術(shù)及轉(zhuǎn)基因技術(shù)擺脫人參生產(chǎn)及育種上的困境[10]。如通過建立人參的組織快速培養(yǎng)體系，大量繁殖人參苗來緩解生產(chǎn)上的需求，或在組培體系基礎(chǔ)上利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)現(xiàn)有的品種進(jìn)行改良，亦或通過調(diào)控光、溫、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等來促使試管苗開花結(jié)實(shí)來縮短其育種周期等[11-14]。雖然已有很多關(guān)于人參組織培養(yǎng)方面的報(bào)道，但尚未見有穩(wěn)定的體系在育種及生產(chǎn)上應(yīng)用，因此有必要建立一套有效的人參組培體系，以期為人參育種的后續(xù)研究奠定理論基礎(chǔ)[15-18]。

長(zhǎng)期以來，國(guó)內(nèi)外針對(duì)建立完整的人參組織培養(yǎng)體系做了大量研究[19]。雖然已經(jīng)有一些關(guān)于人參組培體系建立的報(bào)告，其中提到的各種激素濃度為人參組培的進(jìn)一步研究提供了參考[20-22]。但目前發(fā)現(xiàn)的報(bào)告中，大多是采用單因素研究方法，這種方法有可能會(huì)漏掉一些較優(yōu)的組合。而使用均勻設(shè)計(jì)恰好能規(guī)避這個(gè)弊端，既能夠保證試驗(yàn)的均勻性和準(zhǔn)確性，又能大大減少試驗(yàn)次數(shù)，且目前尚未有采用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化人參組織培養(yǎng)中各激素配比的相關(guān)報(bào)道[23]。

本試驗(yàn)以MS為基本培養(yǎng)基，大田生長(zhǎng)的人參葉片為試材，采用均勻設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)不同氮濃度、不同種類的激素組合，探討并篩選了人參葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，以期建立高效、穩(wěn)定的人參再生植株體系，為后續(xù)育種試驗(yàn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集試驗(yàn)田的人參葉片，將采集的人參葉片放在水流中清洗，以除去表面污垢。再將人參葉片放入滅菌后的燒杯中，在無菌條件下用75%乙醇浸泡30 s，將其取出用無菌水沖洗2次，每次5 min。然后將葉片浸入0.1%升汞溶液中，浸泡6 min，并不斷晃動(dòng)燒杯，之后用無菌水洗滌3次，每次5 min，最后用無菌水浸泡以備用。

1.2 方法

1.2.1 人參葉片愈傷組織的誘導(dǎo)

在無菌條件下將備好的人參葉片用刀切成小塊，用鑷子將愈傷組織接種在2,4-D 2 mg/L+KT 1 mg/L+NAA 0.66 mg/L+1%瓊脂，pH值為5.8的MS培養(yǎng)基中，并設(shè)置培養(yǎng)溫度為25 ℃。

1.2.2 人參不定芽的誘導(dǎo)

將帶有愈傷組織的人參葉片接種在IBA 3 mg/L+6-BA 3 mg/L+NAA 3 mg/L+1%瓊脂，pH值為5.8的MS培養(yǎng)基中，然后置于光照時(shí)長(zhǎng)為16 h/d，溫度為25 ℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

1.2.3 誘導(dǎo)生根

將帶有不定芽的愈傷組織切成單芽并以MS為基本培養(yǎng)基，附加瓊脂8 g/L，pH值為5.8。將NO3-、NH4+與NAA、KT、IBA、6-BA、IAA、GA36種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，參照均勻設(shè)計(jì)U15(158)，設(shè)計(jì)8個(gè)因素，每種因素為15水平(表1)，每處理10瓶，每瓶1枚外植體。30 d后統(tǒng)計(jì)人參單芽生根數(shù)，生根后的根粗、根長(zhǎng)、莖粗、莖長(zhǎng)。通過分析得到最佳激素組合后，在添加有最佳激素組合的培養(yǎng)基中接種人參帶有愈傷組織的單芽進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 人參單芽U15(158)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4 移栽

打開已經(jīng)生根的試管瓶進(jìn)行煉苗，煉苗的必備條件是溫度25 ℃，5 000～10 000 lx的光照強(qiáng)度，時(shí)間為4～6 d。當(dāng)有小的菌落剛剛出現(xiàn)在培養(yǎng)基的表面時(shí)，及時(shí)地將試管苗從試管瓶中移出。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)單芽生根率的影響

接種后，每7 d觀察1次單芽生根情況，28 d時(shí)統(tǒng)計(jì)單芽生根的誘導(dǎo)情況。通過觀察培養(yǎng)14 d后開始有根出現(xiàn)。28 d后統(tǒng)計(jì)各處理單芽生根率(圖1)。由表2可知，7號(hào)處理的單芽生根率最高，為90%，其次為11號(hào)50%，5號(hào)40%，3號(hào)、6號(hào)、8號(hào)、9號(hào)都為30%，10號(hào)、12號(hào)、14號(hào)都為20%，4號(hào)、13號(hào)都為10%，而1號(hào)、2號(hào)、15號(hào)處理的單芽沒有生根。

表2 單芽生根率

2.2 不同處理對(duì)單芽地上部的影響

28 d后統(tǒng)計(jì)各處理單芽地上部情況(表3)。由表3可知，8號(hào)處理莖粗增長(zhǎng)值最大，為0.04 cm，其次為3號(hào)、5號(hào)6號(hào)、7號(hào)、12號(hào)，都為0.03 cm，1號(hào)、10號(hào)、15號(hào)都為0.02 cm，2號(hào)、4號(hào)、9號(hào)、11號(hào)、13號(hào)、14號(hào)都為0.01 cm。7號(hào)處理莖長(zhǎng)增長(zhǎng)值最大，為0.17 cm，其次為8號(hào)0.13 cm，3號(hào)、6號(hào)、12號(hào)都為0.11 cm，4號(hào)、11號(hào)都為0.06 cm，13號(hào)0.05 cm，1號(hào)0.04 cm，15號(hào)0.03 cm，5號(hào)、10號(hào)、14號(hào)都為0.02 cm，2號(hào)、9號(hào)都為0.01 cm。

表3 單芽地上部試驗(yàn)結(jié)果

2.3 不同處理對(duì)單芽地下部的影響

28 d后統(tǒng)計(jì)各處理單芽地下部情況(表4)。

表4 單芽地下部試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，7號(hào)處理根粗增長(zhǎng)值最大，為0.32 cm，其次為14號(hào)0.28 cm，10號(hào)0.26 cm，3號(hào)0.24 cm，5號(hào)、8號(hào)都為0.22 cm，12號(hào)0.20 cm，9號(hào)0.18 cm，11號(hào)0.15 cm，13號(hào)0.08 cm，6號(hào)0.06 cm，4號(hào)0.02 cm，1號(hào)、2號(hào)、15號(hào)都為0。7號(hào)處理根長(zhǎng)增長(zhǎng)值最大為1.03 cm，其次為14號(hào)0.89 cm，5號(hào)0.83 cm，3號(hào)0.78 cm，10號(hào)0.76 cm，8號(hào)、12號(hào)都為0.66 cm，11號(hào)0.33 cm，13號(hào)0.27 cm，4號(hào)、9號(hào)都為0.24 cm，6號(hào)0.20 cm，1號(hào)、2號(hào)、15號(hào)都為0。

2.4 偏最小二乘回歸建模分析結(jié)果

使用DPS中的偏最小二乘回歸分析程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，參考PRESS統(tǒng)計(jì)量以及誤差統(tǒng)計(jì)量的下降趨勢(shì)，選擇5個(gè)潛變量個(gè)數(shù)，建立二次多項(xiàng)式回歸模型，得到各因子與5個(gè)指標(biāo)間的主效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)。其中，NH4+(X2),NAA(X3)，IBA(X5),6BA(X6)和GA3(X8)對(duì)單芽生根率(Y1),生根后莖粗的增長(zhǎng)值(Y2),生根后莖長(zhǎng)的增長(zhǎng)值(Y3),生根后根粗增長(zhǎng)值(Y4)和生根后根長(zhǎng)增長(zhǎng)值(Y5)的影響為正效應(yīng)，NO3-(X1),KT(X4)及IAA(X5)對(duì)單芽生根率(Y1),生根后莖粗的增長(zhǎng)值(Y2),生根后莖長(zhǎng)的增長(zhǎng)值(Y3),生根后根粗增長(zhǎng)值(Y4)和生根后根長(zhǎng)增長(zhǎng)值(Y5)的影響為負(fù)效應(yīng)。

由表5可知，提取不同潛變量個(gè)數(shù)增加時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)模型誤差平方和及PRESS統(tǒng)計(jì)量呈下降趨勢(shì)，且潛變量個(gè)數(shù)為5時(shí)，Y1、Y2、Y3、Y4、Y5的誤差平方和分別為0.048 7，0.047 6，0.046 7，0.048 0，0.047 0，小于0.05，表明分析具有顯著性，相應(yīng)的決定系數(shù)分別為0.928 5，0.831 4，0.858 9，0.894 9，0.880 7，說明潛變量對(duì)因變量的解釋能力很強(qiáng)，回歸模型的擬合效果較好(決定系數(shù)R2接近1，說明潛變量對(duì)因變量的解釋能力越強(qiáng)，回歸模型擬合效果越好)。

在DPS軟件中設(shè)定需要的優(yōu)化條件為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5取最大值，對(duì)以上5個(gè)模型進(jìn)行優(yōu)化，得到各因素的最優(yōu)值：當(dāng)X1(NO3-)為3 mg/L，X2(NH4+)為7 mg/L，X3(NAA)為0.1 mg/L，X4(KT)為0.1 mg/L,X5(IBA)為8 mg/L，X6(6-BA)為0.125 mg/L，X7(IAA)為0.15 mg/L,X8(GA3)為6 mg/L時(shí)，有最優(yōu)目標(biāo)函數(shù)值，其中，Y1=96%，Y2=0.13 cm，Y3=0.07 cm，Y4=0.32 cm，Y5=1.02 cm。

表5 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后的模型誤差平方和及決定系數(shù)

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

在添加最佳激素組合的培養(yǎng)基中接種人參單芽，30 d后生根誘導(dǎo)率達(dá)95%，生根后莖粗的增長(zhǎng)值為0.09 cm,生根后莖長(zhǎng)的增長(zhǎng)值為0.07 cm,生根后根粗增長(zhǎng)值為0.32 cm,生根后根長(zhǎng)增長(zhǎng)值為1.03 cm。，與模型預(yù)測(cè)值十分接近，表明由模型預(yù)測(cè)出的最佳激素組合符合實(shí)際操作中人參根誘導(dǎo)的要求，結(jié)果比較滿意。

3 討論與結(jié)論

均勻設(shè)計(jì)是方開泰等為了解決多因素、多水平高科技難題而提出的一種試驗(yàn)設(shè)計(jì)。基于試驗(yàn)點(diǎn)在整個(gè)試驗(yàn)范圍內(nèi)是均勻散布的，從均勻性角度出發(fā)，大大減少了試驗(yàn)次數(shù)，并且分析準(zhǔn)確性好；能從全面試驗(yàn)點(diǎn)中挑選出部分代表性的試驗(yàn)點(diǎn)，這些試驗(yàn)點(diǎn)在試驗(yàn)范圍內(nèi)充分均衡分散，但仍能反映體系的主要特征。它與其它試驗(yàn)設(shè)計(jì)法的最大不同之處就在于能從盡可能少的試驗(yàn)次數(shù)中揭示出因素對(duì)指標(biāo)的影響大小和規(guī)律，能夠以最少的次數(shù)，從多個(gè)因素中找出影響試驗(yàn)結(jié)果的各因素的主次和最優(yōu)結(jié)果，并且可以進(jìn)行優(yōu)化擬合設(shè)計(jì)[23]。而本研究是通過均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化了人參單芽誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基。

由于人參的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、繁殖系數(shù)少、常異花授粉等生物學(xué)特性嚴(yán)重制約品種選育進(jìn)程。因而雖然栽培人參的系統(tǒng)選育工作己經(jīng)開展了幾十年，育種工作者也積極進(jìn)行了新品種的選育工作，但育成品種卻很少，而組織培養(yǎng)作為一種快速創(chuàng)造新種質(zhì)的方法，能在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)品質(zhì)優(yōu)良的單株進(jìn)行擴(kuò)增，因此利用組織培養(yǎng)方法是克服這些不利因素，加快人參新品種選育進(jìn)程，提高基礎(chǔ)研究水平的有效途徑。然而，至今為止，人參組織培養(yǎng)仍然存在難度大、發(fā)根難、再生植株頻率低等諸多問題。

本研究通過均勻設(shè)計(jì)篩選出了誘導(dǎo)人參根的最佳培養(yǎng)基為NO3-3 mg/L+NH4+7 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KT 0.1 mg/L+IBA 8mg/L+6-BA 0.125 mg/L+IAA 0.15 mg/L+GA36 mg/L+8%瓊脂+3%蔗糖，其根的誘導(dǎo)率達(dá)95%。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中已篩選出誘導(dǎo)人參愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+2，4-D 2 mg/L+KT 1 mg/L+NAA 0.66 mg/L+1%瓊脂，誘導(dǎo)率為93%和誘導(dǎo)人參不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+IBA 3 mg/L+6-BA 3 mg/L+NAA 3 mg/L+1%瓊脂，誘導(dǎo)率為86%。因此，本實(shí)驗(yàn)室已基本建立了較完整的人參組培體系，對(duì)加快人參新品種選育進(jìn)程，提高人參基礎(chǔ)研究水平等諸方面具有重要意義。