中藥聯(lián)合益生菌ZY的毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)

葛冰潔， 桑 銳， 于逸凡， 鄒 娟， 王 政， 張雪梅*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2. 長(zhǎng)春市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，吉林 長(zhǎng)春 130061)

藥物毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)是在了解藥物使用過程中對(duì)生理功能產(chǎn)生的不良影響的基礎(chǔ)上，從確保藥物的最大效益、對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康最小危害性角度出發(fā)，全面權(quán)衡利弊和實(shí)際應(yīng)用的可能性，對(duì)藥物的合理生產(chǎn)和安全使用做出評(píng)價(jià)[1-3]，利用急性毒性和亞急性毒性試驗(yàn)等確定藥物的一般毒性[4-5]，利用致突變和致畸試驗(yàn)等確定藥物的遺傳毒性[6]。

現(xiàn)代藥理學(xué)表明，傳統(tǒng)中藥具有安全性高、副作用少、對(duì)胃腸道無損傷、對(duì)肝腎刺激小等優(yōu)點(diǎn)[7-10]，益生菌則具有調(diào)節(jié)腸道微生物平衡、增強(qiáng)免疫力等功能[11-12]，但很多中藥由于自身結(jié)構(gòu)而不能被機(jī)體直接利用，需經(jīng)過腸道菌群處理后，才能發(fā)揮藥效[13]。研究證實(shí)中藥益生菌配伍制劑集成了中草藥和益生素的雙重優(yōu)點(diǎn)，具有毒副作用少、無殘留和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢(shì)[14-18]。研制的中藥益生菌ZY由幾味中藥黃芪、蒲公英等的主要成分與益生菌枯草桿菌等科學(xué)組方而成，經(jīng)藥效學(xué)和臨床試驗(yàn)證明對(duì)動(dòng)物細(xì)菌性腹瀉具有良好的防治作用。此研究通過小鼠急性毒性、亞急性毒性、小鼠骨髓紅細(xì)胞微核和精子畸形試驗(yàn)對(duì)中藥益生菌ZY進(jìn)行毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)，為其臨床應(yīng)用與開發(fā)提供可靠的安全依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明系小鼠160只，體重(20±2) g,雌性小鼠55只，雄性小鼠105只，購自延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 藥品

中藥聯(lián)合益生菌ZY，由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室自行研制。提取中藥黃芪、蒲公英等主要成分，與益生菌枯草桿菌等按最佳配比組方而成；環(huán)磷酰胺(批號(hào)：H22022673)，購于廣東康愛多連鎖藥店有限公司。

1.1.3 主要儀器

超凈工作臺(tái)(SW-CJ2FD)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；電子分析天平(AB145S)，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；雙開門冰箱(BCD-572WD),海爾集團(tuán)公司；全自動(dòng)滅菌鍋(LDZM-60KC)，上海申安醫(yī)療器械廠；自動(dòng)組織脫水機(jī)(A130390)，艾測(cè)科技有限公司；生物組織包埋機(jī)(KD-BMIII)、自動(dòng)切片機(jī)(KD-3368AM)，均購自金華科迪儀器有限公司；實(shí)體顯微鏡(CX31)，購自 OLYMPUS 公司；顯微鏡(SMART)，購自重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗(yàn)[19-21]

將中藥益生菌ZY用蒸餾水配制成1 g/mL藥液，按照最大耐受量(MTD)法進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)前16 h試驗(yàn)動(dòng)物斷食不斷水。選擇雌雄各10只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按照10 g/kg劑量24 h內(nèi)灌胃4次，2次給藥間隔6 h，累計(jì)給藥劑量為40 g/kg。記錄小鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、皮毛光澤、食欲排泄、死亡等臨床癥狀，連續(xù)觀察14 d。

1.2.2 亞急性毒性試驗(yàn)[22]

將40只小鼠隨機(jī)分為空白組和中藥益生菌ZY(低、中、高)劑量組，每組10只，雌雄各半，劑量組按照2.5、5、10 g/kg灌服中藥益生菌ZY，空白組灌服蒸餾水，每天同一時(shí)間給藥，連續(xù)14 d。觀察并記錄小鼠的體重及精神狀態(tài)、飲食情況、被毛光澤度等；14 d后剖檢，觀察主要臟器顏色、形狀、大小等組織病變情況，稱重并計(jì)算主要臟器指數(shù)，H.E染色法制作病理切片，用顯微鏡進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)[23,24]

將50小鼠隨機(jī)分為空白組、中藥益生菌ZY(低、中、高)劑量組和陽性組，每組10只，雌雄各半。劑量組按照2.5、5、10 g/kg灌服中藥益生菌ZY，空白組灌服蒸餾水，陽性組按照40 mg/kg灌服環(huán)磷酰胺，采用30 h給藥法給藥，即連續(xù)2次給藥，間隔24 h，末次給藥6 h后脫頸處死，分別取兩側(cè)股骨制骨髓涂片、Giemsa染色。每張玻片計(jì)數(shù)2 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)，并計(jì)數(shù)含微核的PCE, 計(jì)算微核率。

小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率/‰= 含微核的PCE數(shù)/PCE總數(shù)×1000‰。

1.2.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)[25-28]

將50只6～8周齡雄性小鼠隨機(jī)分為空白組、中藥益生菌ZY(低、中、高)劑量組和陽性組，每組10只，劑量組按照2.5、5、10 g/kg灌服中藥益生菌ZY，空白組灌服蒸餾水，陽性組按照40 mg/kg灌服環(huán)磷酰胺。連續(xù)給藥5天，于首次給藥后第35天采用脫頸法處死小鼠, 取兩側(cè)附睪制精子涂片、伊紅染色。每只小鼠計(jì)數(shù)5 000個(gè)完整精子, 并計(jì)數(shù)其中畸形精子數(shù)，計(jì)算精子畸形率。

小鼠精子畸形率/% = 畸形精子總數(shù)/檢查精子總數(shù)×100%。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大耐受量測(cè)定結(jié)果

在最大給藥體積和最大藥物濃度條件下，14 d內(nèi)小鼠未出現(xiàn)死亡，且精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、皮毛光澤、食欲排泄等臨床癥狀均未出現(xiàn)中毒現(xiàn)象。最大耐受量試驗(yàn)結(jié)果顯示，中藥益生菌ZY對(duì)小鼠的最大耐受量大于40 g/kg，根據(jù)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，中藥益生菌ZY屬于無毒物質(zhì)。

2.2 亞急性毒性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

各組小鼠采食、飲水等行為均正常、精神狀態(tài)良好，未見中毒反應(yīng)；剖檢肝、腎、心等主要臟器未見外形異常、表面充血、瘀血、腫脹、滲出、粘連等變化。對(duì)小鼠體重的影響見表1，對(duì)臟器指數(shù)的影響見表2，組織病理學(xué)切片見圖1～3。

表1 中藥益生菌ZY對(duì)小鼠體重的影響

注：與空白組比較，“#”表示差異顯著(P<0.05)，“##”表示差異極顯著(P<0.01)，無肩標(biāo)表示差異不顯著(P>0.05),下同。

由表1可知，與空白組相比，低劑量組小鼠體重差異不顯著(P>0.05)；中、高劑量組小鼠體重在給藥7 d后顯著增加(P<0.05)；高劑量組小鼠體重在給藥14 d后極顯著增加(P<0.01)。結(jié)果表明，中藥益生菌ZY不會(huì)引起小鼠中毒反應(yīng)，并且能夠以劑量依賴性的方式促進(jìn)小鼠體重的增加。

表2 中藥益生菌ZY對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

剖檢受試小鼠，觀察肝、腎、心等主要臟器未見有異常變化。由表2可知，與空白組相比，各劑量組小鼠臟器指數(shù)差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，中藥益生菌ZY較長(zhǎng)時(shí)間、較大劑量使用時(shí)對(duì)小鼠主要臟器無影響，說明中藥益生菌ZY安全無毒，無一般毒性。

對(duì)小鼠肝臟進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察，可見空白組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞壁均勻，細(xì)胞核清晰，可見清晰的肝小葉和排列整齊的肝索(圖1-A)。低、中、高劑量組小鼠肝組織病理切片結(jié)構(gòu)完整，可以清晰地看到肝小葉，肝索呈放射狀，均未見肝細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)，未見肝細(xì)胞變性和壞死(圖1-B,C,D)。結(jié)果表明，中藥益生菌ZY對(duì)小鼠肝組織無損傷作用，說明中藥益生菌ZY對(duì)小鼠肝組織無毒性作用。

注:A.空白組;B.低劑量組;C.中劑量組;D.高劑量組;下同。

圖1 中藥益生菌ZY對(duì)小鼠肝臟組織病理變化的影響

Fig.1 Effect of Chinese medicine and probiotics ZY on liver histopathology in mice

圖2 中藥益生菌ZY對(duì)小鼠腎臟組織病理變化的影響

對(duì)小鼠腎臟進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察，可見空白組小鼠腎單位數(shù)量、大小和分布未見異常改變，腎小球未見異常改變，腎小管上皮未見腫脹，遠(yuǎn)曲小管和集合管未見異常(圖2-A)。低、中、高劑量組小鼠腎小球大小正常，形狀形態(tài)規(guī)整，腎間質(zhì)未見炎癥浸潤(rùn)，系膜區(qū)無可見增生情況(圖2-B,C,D)。結(jié)果表明，中藥益生菌ZY對(duì)小鼠腎臟無損傷作用，說明中藥益生菌ZY對(duì)小鼠腎臟組織無毒性作用。

圖3 中藥益生菌ZY對(duì)小鼠脾臟組織病理變化的影響

對(duì)小鼠脾臟進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察，可見空白組小鼠脾臟被膜未見異常，脾血竇內(nèi)的血細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)目正常(圖3-A)。低、中、高劑量組小鼠脾臟被膜與空白組無異，脾血竇內(nèi)的血細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)目未見異常增多或減少，脾小體淋巴細(xì)胞未見損傷，未見瘀血或出血(圖3-B,C,D)。結(jié)果表明，中藥益生菌ZY對(duì)小鼠脾臟毒損傷作用，說明中藥益生菌ZY對(duì)小鼠脾臟無毒性作用。

2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

中藥益生菌ZY小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率結(jié)果見表3。

本試驗(yàn)通過計(jì)算小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核出現(xiàn)率，判斷化合物的致突變作用，微核率以千分率計(jì)。由表3可知，中藥益生菌ZY低、中、高劑量組微核率與空白組相比,差異不顯著(P>0.05)，與陽性組相比,差異極顯著(P<0.01)。小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)的陰性結(jié)果表明，中藥益生菌ZY無誘發(fā)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率增加的作用，說明其無致小鼠體細(xì)胞染色體損傷的作用。

表3 中藥益生菌ZY對(duì)小鼠骨髓紅細(xì)胞微核率的影響

2.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

中藥益生菌ZY小鼠精子畸形率結(jié)果見表4。

觀察并計(jì)數(shù)無勾、胖頭、尾折疊等類型的畸形精子數(shù)，分別計(jì)算各組精子畸形發(fā)生率，精子畸形率以百分?jǐn)?shù)計(jì)，中藥益生菌ZY試驗(yàn)組精子畸形率與空白組相比,差異不顯著(P>0.05)，與陽性組相比,差異極顯著(P<0.01)。小鼠精子畸形試驗(yàn)的陰性結(jié)果表明，中藥益生菌ZY無明顯誘發(fā)小鼠精子畸形率增加的作用，說明其無致小鼠生殖細(xì)胞突變作用，無遺傳毒性。

表4 中藥益生菌ZY對(duì)小鼠精子畸形率的影響

3 討論與結(jié)論

毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)是藥物過渡到臨床使用的主要依據(jù)，通過連續(xù)反復(fù)給藥，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)的毒性反應(yīng)及臟器病理學(xué)改變等分析藥物的一般毒性和遺傳毒性[29]。本試驗(yàn)通過小鼠最大耐受量、亞急性毒性、骨髓紅細(xì)胞微核及精子畸形試驗(yàn)對(duì)中藥益生菌ZY進(jìn)行毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)。

通過測(cè)定最大耐受量來反映中藥益生菌ZY的毒性情況。在藥物最大濃度和小鼠最大給藥量的條件下，未導(dǎo)致小鼠死亡，且所有受試小鼠均未出現(xiàn)中毒反應(yīng)，剖檢觀察小鼠主要臟器形態(tài)結(jié)構(gòu)未發(fā)生異常變化，根據(jù)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，中藥益生菌配伍制劑屬于無毒性物質(zhì)。亞急性毒性是介于急性毒性和慢性毒性之間的一種毒性表現(xiàn)，亞急性毒性試驗(yàn)旨在判斷動(dòng)物接觸藥物時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，對(duì)機(jī)體引起結(jié)構(gòu)或功能的損害作用。試驗(yàn)動(dòng)物的體重變化是反映動(dòng)物機(jī)體中毒效應(yīng)和毒物毒性的最基本指標(biāo)，臟器指數(shù)是小鼠臟器與體重之比，能在一定程度上反應(yīng)臟器損傷的程度，當(dāng)臟器腫大時(shí)，臟器指數(shù)升高，當(dāng)臟器萎縮時(shí)，臟器指數(shù)降低，是提供受試化合物靶器官的重要指標(biāo)[30-32]。中藥益生菌ZY各劑量組小鼠均未出現(xiàn)中毒反應(yīng)，精神狀態(tài)均正常，高劑量組小鼠體重與空白組相比,差異極顯著，剖檢肝、腎等主要器官均無明顯病變，臟器指數(shù)與空白組相比,差異不顯著，觀察組織病理學(xué)切片顯示,肝、腎等主要臟器均無損傷。試驗(yàn)結(jié)果說明，中藥益生菌ZY較長(zhǎng)時(shí)間、較大劑量使用時(shí)對(duì)小鼠機(jī)體無損傷作用，并且能夠以劑量依賴性的方式促進(jìn)小鼠體重的增加。試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，中藥益生菌ZY安全無毒。

小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核和精子畸形試驗(yàn)判斷藥物的致突變性和遺傳毒性是藥物安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容。小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)是檢測(cè)外源化學(xué)物質(zhì)對(duì)染色體損傷作用的一種遺傳毒性試驗(yàn)方法，是評(píng)價(jià)細(xì)胞遺傳學(xué)損傷、檢測(cè)染色體異常最簡(jiǎn)便的方法，常用微核率作為評(píng)價(jià)致突變作用的指標(biāo)[33-34]。通過測(cè)定小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率判斷中藥益生菌配伍制劑致小鼠體細(xì)胞突變作用，以此評(píng)價(jià)該藥物的體細(xì)胞遺傳毒性。精子畸形試驗(yàn)常用來檢測(cè)藥物的生殖毒性和對(duì)生殖細(xì)胞的致突變性，具有操作方便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。通過小鼠精子畸形率判斷中藥益生菌ZY對(duì)小鼠生殖細(xì)胞的致突變作用，以此評(píng)價(jià)該藥物的生殖細(xì)胞遺傳毒性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，中藥益生菌ZY對(duì)小鼠體細(xì)胞和生殖細(xì)胞未產(chǎn)生致突變作用，即中藥益生菌ZY無致突變作用，無遺傳毒性。

綜上所述，急性毒性、亞急性毒性和遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，中藥益生菌ZY無一般毒性、致突變性和遺傳毒性，這為該藥物的合理應(yīng)用和開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。