白藜蘆醇對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠腦氧化損傷預(yù)防作用研究

陳紅玲,高貴珍,王 晴,段 紅,龍 濤,杜菲凡

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州，234000

機(jī)體的衰老是個(gè)變化而復(fù)雜的過(guò)程，氧自由基導(dǎo)致的氧化損傷所引起的機(jī)體細(xì)胞的功能紊亂在其中起著很大作用，而腦組織耗氧量較大，又由于其含有單胺氧化酶等特性，導(dǎo)致氧自由基所引起的氧化損傷在腦組織更為明顯[1-2]。

白藜蘆醇是植物中的天然抗氧化劑，有較強(qiáng)的抗自由基、抗氧化作用[3-6]。2006年,Valenzano等人發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以增加脊椎動(dòng)物的壽命[7]。王長(zhǎng)本等人使用避暗試驗(yàn)觀察白藜蘆醇對(duì)小鼠記憶學(xué)習(xí)能力的影響，該試驗(yàn)在常壓耐缺氧和亞硝酸鈉中毒等造成的缺氧情況下觀察白藜蘆醇對(duì)小鼠缺氧的耐力影響。試驗(yàn)表明,白藜蘆醇能顯著增強(qiáng)小鼠的記憶能力和改善記憶障礙。通過(guò)耐力試驗(yàn)還表明,白藜蘆醇可顯著延長(zhǎng)小鼠缺氧時(shí)間、提高鼠耐力和抗疲勞能力，以證明白藜蘆醇具有良好的抗衰老的作用[8]。胥德政的研究結(jié)果顯示,白藜蘆醇能夠較有效地清除自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化效應(yīng)，其生理活性明顯強(qiáng)于自由基清除劑維生素E和維生素C的生理活性[9]。目前試驗(yàn)研究表明,白藜蘆醇主要通過(guò)清除或抑制自由基的生成、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和調(diào)節(jié)抗氧化相關(guān)酶活性等機(jī)制來(lái)發(fā)揮抗氧化作用，延緩機(jī)體的組織氧化損傷過(guò)程，進(jìn)而起到延緩和抗衰老作用。

脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁上的特有結(jié)構(gòu)，脂多糖本身并沒(méi)有毒性作用，但能夠刺激體內(nèi)各種細(xì)胞合成并釋放眾多內(nèi)源性生物活性因子，導(dǎo)致大量的一氧化氮(NO)和炎性細(xì)胞因子的釋放，而產(chǎn)生的NO及其衍生物可以引起宿主組織的氧化損傷和毒性作用。另外，NO是在一氧化氮合酶(NOS)的催化下產(chǎn)生的。NOS的作用是促進(jìn)腦皮層和海馬在LPS刺激下產(chǎn)生大量的NO，過(guò)量的NO與過(guò)氧化物一起導(dǎo)致過(guò)氧化,從而引起組織的氧化損傷[ 10]。當(dāng)組織缺氧缺血時(shí),在輔酶II氧化酶作用下還原型輔酶II(NADPH) →NADP+(氧化型輔II),而則接受一個(gè)電子成為超氧陰離子自由基。超氧化物歧化酶(SOD)是自由基的消除劑。丙二醛(MDA)是自由基引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的一種產(chǎn)物,其水平可反映體內(nèi)自由基含量。

本試驗(yàn)采用的是LPS誘導(dǎo)氧化損傷模型，研究白藜蘆醇對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的ICR小鼠腦皮層和海馬中NOS活性的影響和白藜蘆醇的抗氧化損傷保護(hù)機(jī)制(SOD酶活性和MDA含量)，旨在為白藜蘆醇在抗機(jī)體氧化損傷的研究和臨床應(yīng)用中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)材料

ICR品系小鼠(雄性，6～8周齡，購(gòu)于徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物部)、LPS(脂多糖，sigma公司)、白藜蘆醇(天津一方生物制劑公司)、生理鹽水(安徽環(huán)球藥業(yè)股份有限公司)、NOS試劑盒(南京建成生物工程公司)、小鼠的飼料、考馬斯亮藍(lán)G250 、蒸餾水 、乙醚等購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)，分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備

酶標(biāo)儀(Multiskan G0 美國(guó)Thermo公司)、臺(tái)式冷凍離心機(jī)(力康發(fā)展有限公司 型號(hào)Neofuge 23R)、組織勻漿器(cryomill，Retsch GmbH)、雪花制冰機(jī) 、電子天平(FA2004N型)、-80 ℃的冰箱、eppendorf管、96孔板 、各種移液槍及槍頭、純水儀 、離心管、滅菌鍋、一次性無(wú)菌注射器等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物

ICR小鼠，雄性，體重30～40 g,于室內(nèi)分籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水，待小鼠適應(yīng)后進(jìn)行試驗(yàn)。將小鼠隨機(jī)分成三組，即：對(duì)照組(生理鹽水，n= 6)、模型組(LPS，n= 6)、預(yù)防組(Res+LPS，n=6)。模型組前10天采用腹腔注射的方式注射生理鹽水，然后注射LPS 5 mg/kg，連續(xù)2天。對(duì)照組注射等量的對(duì)照液(生理鹽水)。預(yù)防組前10天按每天10 mg/kg體重腹腔注射白藜蘆醇，在之后2天中預(yù)防組給藥后采用腹腔注射LPS 5 mg/kg，對(duì)照組注射等量的生理鹽水。

1.2.2 組織勻漿

處死：在最后一次給藥48 h后，應(yīng)用乙醚將動(dòng)物深度麻醉，然后放置在冰浴中斷頸處死。用乙醇消毒后的手術(shù)器材引頸剪開(kāi)皮膚，取出完整的腦，并將腦皮層和海馬分開(kāi)稱(chēng)重。取出后立刻將這些組織放入eppendorf管中，保存在液氮中。待所有的小鼠腦皮層和海馬組織都取完后，放入-80 ℃冰箱中保存。

組織勻漿：取出凍存的腦皮層和海馬組織0.1 g放入1 mL的生理鹽水中,制備10%的組織勻漿。

1.2.3 組織蛋白質(zhì)含量測(cè)定

取10%組織勻漿液于適宜的考馬斯亮藍(lán)中，混勻。放置兩分鐘，然后取200 μL于96孔板中，用酶標(biāo)儀測(cè)出各個(gè)待測(cè)樣的吸光度值，保證所得到的吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中良好的線性范圍之內(nèi)。

1.2.4 NOS活力

NOS的測(cè)定原理是：NOS催化L-Arg和分子氧反應(yīng)生成NO,NO與親核性物質(zhì)生成有色化合物，在530 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)吸光度的大小可計(jì)算出NOS活力。當(dāng)被測(cè)樣品中含有NOS時(shí)，產(chǎn)生NO與過(guò)氧化物一起導(dǎo)致過(guò)氧化，引起組織損傷，比色時(shí)測(cè)定管的吸光度值高于對(duì)照管的吸光度值，通過(guò)公式計(jì)算可求出被測(cè)樣品中的NOS活力。

計(jì)算公式：

具體的操作步驟：混勻，530 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各管吸光度值。

1.2.5 制作標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線

采用考馬斯亮藍(lán)法[12-14]。

1.2.6 SOD酶活性的測(cè)定

按SOD活力的測(cè)定試劑盒操作，每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位(U)。

1）管線高度集中。地下綜合管廊是在城市道路下面建造一個(gè)市政共同通道，將電力、燃?xì)?、通信、供水等多種市政管線集中在一起，排列緊湊，拓?fù)潢P(guān)系復(fù)雜，可實(shí)現(xiàn)地下空間的綜合利用。

計(jì)算公式為：

1.2.7 MDA含量的測(cè)定

采用TBA法，酶標(biāo)儀在532 nm處可以測(cè)定出樣品的吸光光度值，通過(guò)公式即可求算出被測(cè)樣品中MDA的含量。

計(jì)算公式為：

組織中MDA含量計(jì)算公式：

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)表示為均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± S.D.)。數(shù)據(jù)采用Student’s-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，p小于0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 NOS活性

NOS是NO合成過(guò)程中起關(guān)鍵作用的酶，NOS在靜息狀態(tài)的細(xì)胞內(nèi)是不表達(dá)的，但當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子和免疫微生物等刺激時(shí)，如脂多糖(LPS)的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，NOS催化合成非生理濃度的大量NO，產(chǎn)生一系列的病理作用。本試驗(yàn)中,小鼠腦皮層和海馬組織中NOS的活性如圖1所示。

圖1 白藜蘆醇預(yù)防后檢測(cè)小鼠腦皮層內(nèi)NOS活性 *LPS組與CON組相比有顯著性差異(p<0.05)#Res+LPS組與LPS組相比有顯著性差異(p<0.05)

2.1.1 白藜蘆醇預(yù)防后對(duì)小鼠腦皮層中NOS活性的影響

從圖1可知，LPS處理后小鼠腦皮層中的NOS活性顯著提高，表明氧化損傷誘導(dǎo)模型建立成功；用白藜蘆醇預(yù)防10天后腦海馬中NOS活力水平較模型組有所降低，表明白藜蘆醇可清除小鼠腦皮層中的自由基，對(duì)NOS表達(dá)及NO合成過(guò)程有抑制作用，且有顯著性差異。

2.1.2 白藜蘆醇預(yù)防后小鼠腦海馬中NOS活性的影響

從圖2中可以看出，用LPS處理后小鼠腦海馬中的NOS活性顯著提高，表明氧化損傷誘導(dǎo)模型建立成功；用白藜蘆醇預(yù)防10天后腦海馬中NOS活力水平較模型組有所降低，表明白藜蘆醇可清除小鼠海馬中的自由基，對(duì)NOS表達(dá)及NO合成過(guò)程有抑制作用，且有顯著性差異。

圖2 白藜蘆醇預(yù)防后檢測(cè)小鼠海馬內(nèi)NOS活性*LPS組與CON組相比有顯著性差異(p<0.05)#Res+LPS組與LPS組相比有顯著性差異(p<0.05)

2.2 SOD酶活性

圖3 白藜蘆醇預(yù)防后檢測(cè)小鼠腦皮層內(nèi)SOD活性*LPS組與CON組相比有顯著性差異(p<0.05)

SOD是線粒體內(nèi)含量較為豐富的一種抗氧化物酶。它可以清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。小鼠腦皮層、海馬組織中SOD的活力如圖3和圖4所示。模型組小鼠與對(duì)照組相比腦皮層中的SOD活力明顯降低。海馬內(nèi)預(yù)防組與模型組相比能顯著升高SOD活性(p< 0.05)，由此說(shuō)明白藜蘆醇預(yù)防后可顯著提高預(yù)防組小鼠腦海馬中的SOD活力。

圖4 白藜蘆醇預(yù)防后檢測(cè)小鼠海馬內(nèi)SOD活性#Res+LPS組與LPS組相比有顯著性差異(p<0.05)

2.3 MDA含量

MDA是多不飽和脂肪酸過(guò)氧化物的降解產(chǎn)物。脂質(zhì)過(guò)氧化物是由氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸形成的，小鼠腦皮層和海馬中MDA含量如圖5和圖6所示。預(yù)防組小鼠和模型組小鼠相比，腦皮層和海馬中MDA的含量明顯降低，由此說(shuō)明，應(yīng)用白藜蘆醇預(yù)防后可顯著降低預(yù)防組小鼠腦皮層和海馬中MDA的含量，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 白藜蘆醇預(yù)防后檢測(cè)小鼠腦皮層內(nèi)MDA含量*LPS組與CON組相比有顯著性差異(p<0.05)##Res+LPS組與LPS組相比有顯著性差異(p<0.01)

圖6 白藜蘆醇預(yù)防后檢測(cè)小鼠海馬內(nèi)MDA含量*LPS組與CON組相比有顯著性差異(p<0.05)

3 結(jié) 語(yǔ)

相關(guān)文獻(xiàn)表明，白藜蘆醇是源自天然植物中的脂溶性抗毒素，屬于多酚類(lèi)化合物，主要存在于虎杖、葡萄和花生等自然植物中。其在人體內(nèi)的重要作用有抗氧化、抗炎和抗衰老等作用[6]。

本文試驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠腦皮層和海馬中內(nèi)源性抗氧化酶SOD活性下降，說(shuō)明腦皮層和海馬遭受氧化損傷，白藜蘆醇可提高SOD活性，減輕了LPS介導(dǎo)的腦皮層和海馬的氧化損傷。

本試驗(yàn)中，模型組注射10天LPS后，腦皮層和海馬中MDA含量明顯上升，與模型組相比，預(yù)防組小鼠腦皮層和海馬中MDA的含量明顯降低。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明小鼠腦皮層、海馬氧化損傷得到控制，白藜蘆醇使自由基的生成受到抑制，減輕了LPS誘導(dǎo)的腦皮層、海馬的氧化損傷。筆者認(rèn)為，藜蘆醇能夠預(yù)防LPS引起的腦皮層和海馬組織的氧化損傷，這可能是由于白藜蘆醇可以減少或抑制氧自由基的生成，從而降低過(guò)氧化對(duì)機(jī)體造成的損傷。

本次試驗(yàn)結(jié)果表明：模型組LPS處理過(guò)的小鼠腦皮層和海馬組織中的NOS活性顯著提高，用白藜蘆醇預(yù)防10天后腦海馬中NOS活力水平較模型組有所降低，但與空白對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯差異。這表明白藜蘆醇可清除小鼠腦皮層和海馬中的自由基，對(duì)NOS表達(dá)及NO合成過(guò)程有抑制作用，但無(wú)顯著性差異。