植物甾醇酯對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝臟部分代謝物的影響

歐陽鵬凌，管 玘，曲 丹，丁信文，宋立華,3,*

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.上海市第七人民醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科，上海 200137；3.上海交通大學(xué)陸伯勛食品安全研究中心，上海 200240）

非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholic fatty liver，NAFLD）是代謝綜合征在肝臟中的表現(xiàn)[1]。隨著肥胖及其相關(guān)代謝綜合征的全球化流行趨勢(shì)，NAFLD現(xiàn)已成為歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家和我國(guó)富裕地區(qū)慢性肝病的重要病因。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，在世界范圍內(nèi)NAFLD的患病率為6%～33%，在我國(guó)其發(fā)病率約為15%[2]。NAFLD發(fā)生初期，通過調(diào)整飲食和加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)，肝臟的脂肪變性會(huì)逆轉(zhuǎn)，但若任其發(fā)展，其中有10%～20%會(huì)逐漸發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎，其10 年內(nèi)肝硬化發(fā)生率高達(dá)25%[3]；此外，NAFLD還與2型糖尿病、心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，因此，NAFLD已成為21世紀(jì)世界范圍內(nèi)的一個(gè)重要的公共健康問題。

肝臟是人體最大的代謝器官，參與糖、脂類、蛋白質(zhì)等的代謝過程，在物質(zhì)代謝過程中發(fā)揮樞紐作用[4]。當(dāng)肝臟出現(xiàn)脂肪病變時(shí)，必然會(huì)導(dǎo)致相關(guān)代謝通路發(fā)生變化[5]。由于各物質(zhì)代謝通路的復(fù)雜性，只有利用代謝組學(xué)方法分析才能反映病理狀態(tài)下機(jī)體代謝產(chǎn)物的整體性變化[6]。蔣華軍[7]研究發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照相比，NAFLD大鼠肝臟組織代謝物中脂類、氨基酸類以及糖類的含量均出現(xiàn)明顯變化；另有研究對(duì)NAFLD患者血液進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)糖類、脂類、氨基酸類及胺類化合物等11 種差異代謝物[8]。黃海軍[5]對(duì)肝病患者糞便做代謝組學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示膽汁酸類、膽素原類以及膽堿類等與正常組相比有明顯變化。這些差異代謝物的檢出為NAFLD的預(yù)防、診治及其相關(guān)機(jī)制的研究提供了新思路。

植物甾醇（phytosterols，PS）是一類存在于食物中的天然化合物[9]，其酯化產(chǎn)物即植物甾醇酯（phytosterol esters，PSE）具有較好的溶解特性。前期研究發(fā)現(xiàn)PSE可顯著減輕NAFLD大鼠肝臟的脂肪變性程度[10]。為進(jìn)一步研究PSE干預(yù)后如何影響肝臟代謝物的變化，本實(shí)驗(yàn)擬在前期研究基礎(chǔ)上，利用高脂飲食誘導(dǎo)建立NAFLD大鼠模型，同時(shí)通過灌胃不同劑量PSE連續(xù)干預(yù)12 周后，檢測(cè)肝臟總脂肪含量，利用超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultraperformance liquid chromatography tandem time-of-fight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)檢測(cè)PSE對(duì)NAFLD大鼠肝臟小分子代謝物的影響，從代謝組學(xué)的角度進(jìn)一步闡明PSE有效預(yù)防NAFLD的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

6 周齡雄性清潔級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量（170±10）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002）。大鼠飼料由福貝世亨生物醫(yī)藥（上海）有限公司提供，基礎(chǔ)飼料組成：粗蛋白≥20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、水分≤10%、灰分≤8%、粗纖維≤5%、粗脂肪≥4%、鈣1%～1.8%、賴氨酸1.32%、磷0.6%～1.2%、蛋氨酸＋胱氨酸0.78%；高脂飼料組成：繁殖鼠飼料52.65%、豬油21%、蔗糖10%、酪蛋白10%、麥芽糊精2.7%、預(yù)混料1.9%、膽固醇1.25%、膽鹽0.5%。

植物甾醇酯（植物甾醇和植物甾醇酯≥97%，其中游離植物甾醇≤6%、總植物甾醇≥59%、植物甾醇酯≥91%；甾醇的組成：β-谷甾醇42.0%～55.0%、菜油甾醇20.0%～29.0%、豆甾醇12.0%～23.0%、菜籽甾醇≤6%、D5-燕麥甾醇≤4%、膽甾醇≤2%、D7-燕麥甾醇≤2%、D7-豆甾烯醇≤2%、其他≤5%）由巴斯夫中國(guó)有限公司提供。

分析純氯仿、甲醇均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity UPLC I-Class系統(tǒng)（由二元泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱組成）、VION IMS Q-TOF-MS儀美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 灌胃用PSE強(qiáng)化牛奶的制備

將PSE產(chǎn)品于65 ℃水浴中液化，與純牛奶混合并通過高壓均質(zhì)乳化，得到PSE質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10 g/mL的PSE強(qiáng)化牛奶。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與樣本收集

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為4 組：正常對(duì)照組（NC，n=4）、高脂模型組（HF，n=9）、低劑量PSE組（PSE-L，n=9）和高劑量PSE組（PSE-H，n=9）。NC組大鼠進(jìn)食基礎(chǔ)飼料，其余各組進(jìn)食高脂飼料。NC和HF組灌胃給予等體積普通脫脂牛奶，低（0.05 g/（100 g·d mb））、高劑量（0.1 g/（100 g·d mb））PSE干預(yù)組分別灌胃給予上述PSE強(qiáng)化牛奶（相當(dāng)于成人3 g/d和6 g/d的攝入量），連續(xù)灌胃12 周。飼養(yǎng)環(huán)境條件：室溫為（25±1）℃，相對(duì)濕度為45%～65%，12 h明暗輪換采光，大鼠可自由進(jìn)食及飲水。期間每天記錄各組大鼠攝食量，每周稱量記錄其體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉，按劑量40 mg/kg麻醉大鼠后取出大鼠肝臟，用生理鹽水漂洗干凈，分裝并迅速于液氮中冷凍，然后轉(zhuǎn)移至－80 ℃低溫冰箱中貯存?zhèn)溆?，本?shí)驗(yàn)檢測(cè)選取肝右葉同一部位。

1.3.3 肝臟總脂肪含量測(cè)定

稱取1 g肝臟組織樣品，加入8 mL氯仿-甲醇溶液（體積比2∶1，下同）研磨至勻漿狀，移入15 mL離心管，殘留物用2 mL氯仿-甲醇溶液均沖洗至離心管，超聲處理（400 W，20 min）后2 000 r/min離心5 min，取上清液，加入2.5 mL KCl溶液，靜置1 h分層，2 000 r/min離心5 min后吸去上層液，取下層液于70 ℃水浴鍋蒸干后，烘箱烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量即可得到1 g肝臟中脂肪的總質(zhì)量[6]。

1.3.4 肝組織樣品前處理

取50 mg大鼠肝臟組織于研磨管中，分別加入250、500、750 μL的溶劑（乙腈、甲醇、水體積比為2∶2∶1）后勻漿（60 Hz、20 s），靜置1 h（每15 min漩渦混合一次）后離心（12 000 r/min、10 min、4℃），吸取上清液，進(jìn)樣檢測(cè)。

1.3.5 UPLC -Q-TOF-MS分析方法

1.3.5.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫：45 ℃，進(jìn)樣量：1 μL。流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的乙腈溶液。洗脫程序：0～1 min，95%～80% A；1～2.5 min，80%～60% A；2.5～9min，60%～0%A；9～12 min，0% A；12～12.5 min，0%～95% A；12.5～14.5 min，95% A；流速0.4 mL/min。

1.3.5.2 質(zhì)譜條件

離子源以正和負(fù)電噴霧電離模式運(yùn)行。全信息串聯(lián)質(zhì)譜掃描模式：在運(yùn)行期間使用低能量（碰撞能量4 eV）和高能量（碰撞能量20～45 eV）兩種全信息串聯(lián)質(zhì)譜模式交替采集，氬氣（純度99.999%）作為碰撞誘導(dǎo)解離氣體，氮?dú)猓兌龋?9.5%）作為去溶劑化和錐形氣體。掃描范圍50～1 000 amu；掃描速率：一次掃描用0.2 s；毛細(xì)管電壓2 kV（正離子模式）、1 kV（負(fù)離子模式）；錐形電壓40 V；源偏置60 V；源溫度115 ℃；去溶劑化氣體溫度450 ℃；去溶劑化氣體流量900 L/h；錐形氣體流量50 L/h。鎖定質(zhì)量校正：乙腈-水-甲酸（體積比50∶49.9∶0.1）中的250 ng/mL亮氨酸腦啡肽標(biāo)準(zhǔn)校正溶液通過參比探針連續(xù)輸注（5 μL/min），每30 s掃描一次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

肝組織脂肪含量采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（SPSS 20.0軟件）。UNIFI 1.8.1軟件用于肝臟代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集，原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenesis QI v2.3進(jìn)行峰采集、比對(duì)和歸一化，以得到保留時(shí)間和質(zhì)荷比（m/z）數(shù)據(jù)的峰強(qiáng)度等。將篩選編輯后的結(jié)果組織為二維數(shù)據(jù)矩陣，在SIMCA-P軟件中進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA），根據(jù)模型得到的變量權(quán)重值（VIP＞1）、Student-t檢驗(yàn)的P值（P＜0.05）以及最小變異系數(shù)（CV＜30%）等來尋找差異性表達(dá)代謝物。基于精確質(zhì)量以及高能質(zhì)譜中的碎片，在HMDB和L v2.3ipid數(shù)據(jù)庫中進(jìn)一步鑒定化合物。運(yùn)用EZinfor v3.0.3軟件對(duì)產(chǎn)生的歸一化峰強(qiáng)度做進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析。通過在線數(shù)據(jù)庫HMDB（http://www.hmdb.ca/）、lipidmaps（http://www.lipidmaps.org/tools/）、LipidBank（http://www.lipidbank.jp/）、KEGG（http://www.kegg.jp/）、Metabo Analyst（http://www.metaboanalyst.ca/faces/upload/PathUploadView.xhtml）等檢索差異性代謝物及其所參與的代謝通路。采用GraphPad Prism 6軟件作圖，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 20軟件進(jìn)行單因素方差顯著性分析，并用Tukey HSD法兩兩比較，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PSE干預(yù)對(duì)NAFLD大鼠攝食量的影響

表1 PSE干預(yù)對(duì)NAFLD大鼠攝食量的影響Table 1 Effect of PSE on daily diet consumption of NAFLD rats

由表1可知，1～9 周內(nèi)，隨著大鼠周齡的增加，各組大鼠的攝食量均有所增加，其中實(shí)驗(yàn)至第9周后，NC組及PSE-H組大鼠攝食量較接近，與之前相比無明顯變化，而HF組及PSE-L組攝食量較之前略有下降。這可能是由于高脂飼料熱量較高，引起大鼠食欲下降，而高劑量PSE可更好地調(diào)節(jié)脂代謝，因此使大鼠保持正常食量。事實(shí)上后期代謝檢測(cè)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，PSE-H組大鼠的代謝情況與NC組更接近，提示高劑量PSE（相當(dāng)于人每天攝入6 g）可能會(huì)更好地發(fā)揮調(diào)節(jié)脂代謝作用。

2.2 PSE干預(yù)對(duì)NAFLD大鼠體質(zhì)量的影響

表2 PSE干預(yù)對(duì)NAFLD大鼠體質(zhì)量的影響Table 2 Effect of PSE on body mass of NAFLD rats

表2中數(shù)據(jù)為起始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束各組大鼠體質(zhì)量的變化情況。實(shí)驗(yàn)初始時(shí)間各組大鼠體質(zhì)量無顯著差異；從第6周開始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束HF組大鼠體質(zhì)量一直高于其他組，到第12周時(shí)HF組大鼠體質(zhì)量最高，PSE-L組次之。表明高脂飲食會(huì)導(dǎo)致體質(zhì)量增加，有肥胖的趨勢(shì)，而本實(shí)驗(yàn)中高劑量PSE干預(yù)可減緩體質(zhì)量的增長(zhǎng)。

2.3 PSE干預(yù)對(duì)肝組織總脂肪含量的影響

圖1 PSE對(duì)NAFLD大鼠肝臟總脂肪含量的影響Fig. 1 Effect of PSE on total fat content in liver of NAFLD rats

由圖1可知，HF組較NC組肝臟脂肪含量極顯著升高（P＜0.01），而PSE-L和PSE-H干預(yù)組大鼠肝臟中總脂肪含量均較HF組極顯著下降（P＜0.01），PSE-L和PSE-H兩組肝組織脂肪含量接近。

2.4 肝組織代謝物檢測(cè)不同前處理方法比較

實(shí)驗(yàn)分別采用250、500、750 μL的溶劑（乙腈-甲醇-水體積比2∶2∶1）處理樣品后，從圖2a～f可以看出：在正、負(fù)離子模式下，500、750 μL溶劑量較250 μL溶劑量在8～10 min內(nèi)，出峰數(shù)目更多，且峰形更好，而負(fù)離子模式的圖2f可以看出，750 μL溶劑量下其響應(yīng)較低。為了增強(qiáng)代謝物的提取效果，最終選擇在50 mg肝臟組織中加入500 μL的溶劑（乙腈、甲醇、水體積比2∶2∶1）作為提取條件。

圖2 3 種不同前處理方法在UPLC-Q-TOF-MS正、負(fù)離子模式下的基峰離子流圖譜比較Fig. 2 Comparison of base peak ion current patterns in positive and negative modes of UPLC-Q-TOF-MS under different pretreatment conditions

2.5 PSE干預(yù)對(duì)肝組織部分小分子代謝物的影響

2.5.1 多維統(tǒng)計(jì)分析

圖3 各組肝組織小分子代謝物PCA和PLS-DA分析圖Fig. 3 PCA and PLS-DA scores of small-molecule metabolites in livers of different groups

對(duì)各組大鼠肝組織小分子代謝物進(jìn)行PCA分析，一般來說當(dāng)模型概括X矩陣解釋率（R2X）＞0.4時(shí)表明該模型可靠，R2Y越接近于1說明模型的穩(wěn)定性越好。本實(shí)驗(yàn)樣品在正離子模式下R2X=0.74，負(fù)離子模式下R2X=0.68，因此本實(shí)驗(yàn)所建立的模型可用于各組之間代謝譜差異的可視化觀察。為了更好地區(qū)分組間差異，提高模型的有效性，過濾與模型分類不相關(guān)的正交信號(hào)，采用PLS-DA方法對(duì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步分析，得到在正離子模式下R2Y=0.54，負(fù)離子模式下R2Y=0.77。由圖3中PLS-DA圖可知，HF組與PSE-L組分布差異較小，而PSE-H組與HF組區(qū)分明顯。

2.5.2 差異代謝物的確認(rèn)

圖4 正離子模式下磷脂酰膽堿（18∶1（6Z）/0∶0）的低（a）、高（b）能量譜圖Fig. 4 Low-(a) and high-(b) energy spectra of PC (18:1(6Z)/0:0) in positive ion mode

TOF-MS可以在低碰撞能掃描和高碰撞能掃描之間快速切換，從而同時(shí)完成兩個(gè)掃描功能的數(shù)據(jù)采集。低能量掃描可以得到分子離子峰以及加合峰的信息，結(jié)合Mass FragmentTM確定化合物的可能分子式。通過高能量掃描產(chǎn)生的碎片離子信息，了解化合物可能的結(jié)構(gòu)片段，再利用保留時(shí)間將低、高能量得到的信息進(jìn)行關(guān)聯(lián)，并與輸入電腦中的MOL文件進(jìn)行比對(duì)，從而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行初步的定性。以磷脂酰膽堿（18∶1（6Z）/0∶0）為例，根據(jù)圖4中低能量圖譜可以看到，準(zhǔn)分子離子峰為m/z522.3545[M+H]+，磷脂酰膽堿（18∶1（6Z）/0∶0）的精確相對(duì)分子質(zhì)量為521.348 14。該物質(zhì)的高能量質(zhì)譜圖中部分碎片離子如圖5所示，通過比對(duì)UNIFI軟件中給出的磷脂酰膽堿（18∶1（6Z）/0∶0）結(jié)構(gòu)并結(jié)合其裂解規(guī)律，推斷出該物質(zhì)是磷脂酰膽堿（18∶1（6Z）/0∶0）。按照此方式，采集分析正負(fù)離子模式下得到的差異代謝物后，篩選出20 種差異代謝物如表3所示，其中19 種為脂類，1 種差異代謝物為膽汁酸類。用HMDB（http://www.hmdb.ca/）、lipidmaps（http://www.lipidmaps.org/tools/）、Pubchem（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound）、KEGG（http://www.kegg.jp/）等數(shù)據(jù)庫以及文獻(xiàn)對(duì)差異代謝物進(jìn)行搜索，了解其作用和所參與的代謝通路。

表3 PSE干預(yù)對(duì)NAFLD大鼠肝組織中差異代謝物的影響Table 3 Effect of PSE intervention on differential metabolites in liver of NAFLD rats

圖5 磷脂酰膽堿（18∶1（6Z）/0∶0）高能量譜圖中部分碎片離子Fig. 5 Selected fragment ions off PC(18:1(6Z)/0:0) in high-energy spectra

表3為20 種變量權(quán)重值（VIP）大于1的差異代謝物的質(zhì)荷比、保留時(shí)間及其在Lipidmaps中的編號(hào)。從表3中數(shù)據(jù)可以看出，與HF組同一代謝物響應(yīng)值相比較，NC組中代謝物離子強(qiáng)度水平低于或者高于HF組時(shí)，PSE-H組中也表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，進(jìn)一步提示高脂飲食條件下，高劑量PSE干預(yù)可有效減輕脂代謝紊亂，大鼠代謝狀況與正常對(duì)照組更接近。

圖6為20 種差異代謝物在各組大鼠肝臟中離子強(qiáng)度的比較。HF組與NC組比較，20 種差異代謝物均有極顯著性差異（P＜0.01）。總體來看，PSE-H組差異代謝物強(qiáng)度變化趨勢(shì)與NC組更接近，其中PSE-H組中的磷脂酰乙醇胺（20∶3（8Z，11Z，14Z）/22∶6（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z）、22∶6（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z）/17∶1（9Z））、磷脂酰甘油（17∶2（9Z，12Z）/22∶6（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z））、磷脂酸（20∶1（11Z）/0∶0）、磷脂酰膽堿（16∶0/16∶1（9Z））離子強(qiáng)度較HF組顯著下降（P＜0.05）；磷脂酸（16∶0/20∶2（11Z，14Z））、磷脂酰膽堿（16∶0/18∶1（11E）、18∶1（6Z）/0∶0）、18∶1（9Z）/18∶0、20∶3（8Z，11Z，14Z）/0∶0）、鞘磷脂（d18∶0/16∶0）、甘氨膽酸、溶血卵磷脂（18∶1（9Z）、20∶3（5Z，8Z，11Z）、20∶3（8Z，11Z，14Z））、磷脂酰膽堿（15∶0/18∶1（11Z）、16∶0/2∶0）、17∶1（10Z）/0∶0）、19∶3（10Z，13Z，16Z）/0∶0）的離子強(qiáng)度較HF組極顯著降低（P＜0.01）；而磷脂酰膽堿（20∶4（5Z，8Z，11Z，14Z）/14∶0）則有明顯上升（P＜0.05）。

圖6 各組大鼠肝組織中主要的差異代謝物離子強(qiáng)度比較Fig. 6 Comparison of ionic strengths of major differential metabolites in rat liver from each group

2.5.3 代謝通路分析

圖7 通過Metabo Analyst得到的通路分析概要圖Fig. 7 Pathway analysis profile obtained by Metabo Analyst

將表3中的差異代謝物輸入Metabo Analyst（ http://www.metaboanalyst.ca/faces/upload/PathUploadView.xhtml）數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行代謝通路濃縮與拓?fù)浞治?，?duì)可能的生物擾動(dòng)途徑進(jìn)行分析評(píng)估，選擇代謝通路影響值大于0.10的作為潛在的靶向途徑，構(gòu)建代謝通路如圖7所示。由圖8和表4可以看到，通過篩選影響值，得到由溶血卵磷脂以及磷脂酰膽堿參與的甘油磷脂代謝通路，該通路的影響值為0.183 33。圖8紅色部分為本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出在甘油磷脂代謝通路中的差異代謝物：磷脂酰膽堿（15∶0/18∶1（11Z），16∶0/16∶1（9Z）），以及溶血卵磷脂（18∶1（9Z），20∶3（5Z，8Z，11Z），20∶3（8Z，11Z，14Z）。表4為這5 種VIP＞1的差異代謝物在HMDB、PubChem以及KEGG數(shù)據(jù)庫中的編號(hào)。由代謝通路分析提示PSE可通過對(duì)糾正高脂飲食誘導(dǎo)的甘油磷脂代謝紊亂，發(fā)揮其對(duì)NAFLD的預(yù)防作用。

圖8 通過Metabo Analyst得到的甘油磷脂代謝通路Fig. 8 Glycerophospholipid metabolism pathway obtained by Metabo Analyst

表4 參與甘油磷脂代謝通路的差異代謝物Table 4 Differential metabolites involved in glycerophospholipid metabolism

3 討 論

van Ginneken等[12]研究了NAFLD小鼠饑餓導(dǎo)致的肝臟代謝組學(xué)變化，利用氯仿、甲醇、水提取肝臟組織樣品，LC-MS檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘油三酯、溶血卵磷脂以及磷脂酰膽堿在NAFLD小鼠肝臟中含量明顯增加。另有相似研究運(yùn)用氯仿、甲醇、水對(duì)肝臟組織進(jìn)行前處理，研究NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中肝臟代謝物的變化，與正常組相較有顯著差異的物質(zhì)為溶血卵磷脂、甘油磷酸乙醇胺以及游離脂肪酸（主要是花生四烯酸）[13]。在對(duì)NAFLD大鼠肝臟代謝組學(xué)研究中，Hall等[14]運(yùn)用氯仿、甲醇、丙二醇以及水混合提取劑，LC-MS法檢測(cè)出磷脂酰膽堿、甘油三酯以及高級(jí)脂肪酸等差異代謝物。另有研究利用甲醇水溶液勻漿處理肝臟組織后，通過LC-MS研究NAFLD的肝臟代謝組學(xué)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異代謝物主要為磷脂酰膽堿、磷酸乙醇胺、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、二?；视?、甘油三酯[15]。此外，Qi Suwen等[16]用甲醇對(duì)肝臟組織進(jìn)行研磨，進(jìn)一步通過LC-MS研究NAFLD的肝臟小分子代謝物變化，得到的差異代謝物有硬脂酸、棕櫚酸等高級(jí)脂肪酸，以及L-色氨酸、L-蛋氨基酸、谷氨酸以及L-谷氨酰胺等氨基酸，考慮到前期已對(duì)PSE干預(yù)后NAFLD大鼠肝組織脂肪酸代謝譜進(jìn)行了研究（數(shù)據(jù)未發(fā)表），且由于NAFLD的發(fā)病機(jī)制主要與脂代謝紊亂相關(guān)，因此本研究以乙腈-甲醇-水（體積比2∶2∶1）為提取劑進(jìn)行差異代謝物的提取和篩選。實(shí)驗(yàn)篩選出20 種差異代謝物主要為磷脂類（溶血卵磷脂、磷脂酰膽堿、鞘磷脂、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油）以及膽汁酸類（甘氨膽酸），其中溶血卵磷脂和磷脂酰膽堿參與了甘油磷脂代謝通路。

溶血卵磷脂是低密度脂蛋白的主要成分，可以誘導(dǎo)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥的出現(xiàn)，在細(xì)胞膜與介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用[17]。近年來大量研究表明溶血卵磷脂在多種肝臟疾病和肝毒性的發(fā)生發(fā)展過程中有明顯的變化。一般而言，溶血卵磷脂在細(xì)胞或組織中的量很少，如果濃度過高則會(huì)對(duì)細(xì)胞的膜系統(tǒng)造成傷害[18]。有研究顯示在肝細(xì)胞中磷脂酶活性物質(zhì)的積累可以導(dǎo)致溶血卵磷脂的生成，致使肝細(xì)胞損傷甚至死亡，而細(xì)胞死亡會(huì)激活炎癥通道，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的增多，最終引起脂質(zhì)代謝紊亂[19]。另有研究顯示，肝損傷會(huì)導(dǎo)致磷脂酰膽堿的合成增加，從而代償性地對(duì)肝組織起到一定的保護(hù)作用[20]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高脂飲食可誘導(dǎo)肝組織中溶血卵磷脂和磷脂酰膽堿含量上升，而高劑量PSE干預(yù)后溶血卵磷脂和磷脂酰膽堿的含量顯著降低，有向正常水平調(diào)節(jié)的趨勢(shì)，表明PSE通過調(diào)節(jié)甘油磷脂代謝通路減輕NAFLD的發(fā)生及發(fā)展。

此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HF組中鞘磷脂的離子強(qiáng)度較對(duì)照組顯著上升，高劑量PSE干預(yù)后，鞘磷脂含量較HF組顯著下降。已有文獻(xiàn)指出在炎癥、代謝紊亂等病變過程中鞘磷脂的含量有所上升[21]，大量研究提示，神經(jīng)酰胺參與了NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程[22]，而鞘磷脂可以通過鞘磷脂酶水解生成神經(jīng)酰胺[23]。神經(jīng)酰胺能促進(jìn)胰島素抵抗，增加運(yùn)送到肝臟內(nèi)的游離脂肪酸含量，引起脂質(zhì)蓄積，進(jìn)一步導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)代謝紊亂[24]。其次，神經(jīng)酰胺刺激機(jī)體，使得體內(nèi)活性氧增多，加劇脂質(zhì)過氧化，最終使肝細(xì)胞出現(xiàn)炎癥、壞死甚至肝纖維化[25]。

磷脂酸可以通過Akt-mTOR信號(hào)通路刺激巨噬細(xì)胞，引發(fā)炎癥因子：腫瘤壞死因子、白介素-1β和白介素-6分泌增多[26]。本實(shí)驗(yàn)中，HF組的磷脂酸離子強(qiáng)度較正常對(duì)照組顯著增加，表明高脂飲食會(huì)激發(fā)機(jī)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，而高劑量PSE組較單純高脂飲食組可顯著降低肝組織中磷脂酸的含量。磷脂酰乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（phosphatidylethanolamine N-methyltransferase，PEMT）可以催化磷脂酰乙醇胺。當(dāng)PEMT的活性被抑制時(shí)，磷脂酰乙醇胺的含量會(huì)增加，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，小脂滴發(fā)生融合現(xiàn)象，形成較大的脂滴聚積，最終打破脂質(zhì)代謝的平衡[27]；另一方面，磷脂酰乙醇胺的上調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞通透性加強(qiáng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，造成肝損傷程度更加嚴(yán)重[28]。本研究中高劑量PSE組肝組織中磷脂酰乙醇胺離子強(qiáng)度較模型組明顯降低，提示PSE可通過降低磷脂酰乙醇胺含量，調(diào)節(jié)脂代謝平衡，減少肝臟中的脂滴積聚，減輕炎癥反應(yīng)。

磷脂酰甘油是細(xì)胞膜的主要組成成分[29]，對(duì)細(xì)胞膜的通透性和生理功能有直接影響。炎癥的發(fā)生、發(fā)展以及消退過程均有磷脂酰甘油的參與，其含量變化可以很好的反映機(jī)體內(nèi)脂類代謝是否紊亂，所以磷脂酰甘油含量是一個(gè)重要的生物學(xué)指標(biāo)[30]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中高劑量PSE干預(yù)后肝組織中的磷脂酰甘油含量較HF組顯著下降，進(jìn)一步說明高劑量的PSE在一定程度上減輕高脂飲食導(dǎo)致的脂質(zhì)代謝紊亂及炎癥反應(yīng)。

動(dòng)物膽汁中主要是結(jié)合型膽汁酸，其中就包括甘氨膽酸。肝臟是膽固醇分解的主要代謝場(chǎng)所，可通過7α-羥化酶將膽固醇轉(zhuǎn)化生成膽汁酸[31]。PSE在體內(nèi)可以被水解為植物甾醇，植物甾醇與膽固醇的結(jié)構(gòu)相似，可以競(jìng)爭(zhēng)性地附著于腸上皮受體，限制膽固醇的吸收，最終降低膽固醇水平[32]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出HF組肝臟中膽汁酸含量較正常對(duì)照組顯著升高，這可能是由于高脂飲食造成肝組織中膽固醇較高，PSE干預(yù)可降低NAFLD大鼠肝臟中的膽固醇含量降低[11]，進(jìn)一步導(dǎo)致轉(zhuǎn)化生成的膽汁酸含量下降，提示PSE通過降低膽固醇水平調(diào)節(jié)膽汁酸合成與分泌。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)研究PSE干預(yù)對(duì)NAFLD大鼠肝組織小分子代謝物的影響，篩選出20 種差異代謝物，分別為參與甘油磷脂代謝通路的磷脂類和膽汁酸類，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSE干預(yù)后可降低肝組織中溶血卵磷脂、磷脂酰膽堿、鞘磷脂、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油的含量，提示其可通過甘油磷脂代謝通路調(diào)節(jié)脂類代謝紊亂，減輕高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)積累，從而抑制NAFLD的發(fā)生發(fā)展。