焦文佳,程 銘,夏廉臣,王雪暉,陶 冶,祝愛俠,王春維,,3,*
(1.武漢輕工大學食品科學與工程學院,湖北武漢 430023;2.武漢輕工大學動科科學與營養(yǎng)工程學院,湖北武漢 430023;3.國家糧食局糧油資源綜合開發(fā)工程技術(shù)研究中心,湖北武漢 430023)
植物甾醇是一種重要天然甾醇資源,也是一種存在于植物中的天然活性物質(zhì)[1]。它廣泛分布于自然界,是植物體內(nèi)構(gòu)成細胞膜的成分之一,也是機體中多種激素、維生素D及甾體化合物合成的前體[2]。植物甾醇不僅可以影響脂質(zhì)體膜上磷脂分子聚集,調(diào)節(jié)膜對小分子物質(zhì)的通透性[3],改變膜的表面性質(zhì)[4],還可以降低膽固醇的腸道吸收[5]。植物甾醇因其與膽固醇有著極為相似的結(jié)構(gòu),可影響膽固醇在人體內(nèi)的代謝,且對人體無副作用,被認為是治療和預(yù)防高血脂癥的最佳天然物質(zhì)[6]。
天然植物甾醇具有不溶于水,微溶于油,熔點高等特性,目前,其主要以物理改性后的形式加入到食品體系中,如乳液、脂質(zhì)體、微膠囊和納米粒等,以提高植物甾醇的水溶性。Chao等[7]采用乳化蒸發(fā)法制備植物甾醇納米粒,將植物甾醇溶解在正己烷中,注入含蛋白的水相中,通過高速分散、均質(zhì)形成植物甾醇納米粒;彭捷[6]分別采用反溶劑法和白蛋白結(jié)合技術(shù)制備了水溶性植物甾醇納米顆粒和富含植物甾醇的高蛋白7S豆奶;曹文君[8]利用乳化蒸發(fā)技術(shù)構(gòu)建食物蛋白-植物甾醇納米顆粒,提高植物甾醇的溶解性和生物利用率。
植物甾醇納米粒增加了植物甾醇的水溶性,擴大了植物甾醇的應(yīng)用范圍,但目前,對制備的植物甾醇納米粒的降膽固醇功效研究報道較少。因此,本課題研究了自制的兩種植物甾醇納米粒對高血脂癥小鼠的降膽固醇效果,為植物甾醇納米粒的降膽固醇效果提供理論依據(jù)。
C57BL/6J小鼠 雄性,SPF級,96只,4~5周齡,體重18~22 g,北京華府康生物科技股份有限公司,實驗動物合格證號:SCXK(京)2014-0004;普通飼料、墊料 武漢市疾控中心;高脂飼料配方為:普通飼料88.8%,豬油10%,膽固醇1%,豬膽鹽0.2%;植物甾醇(純度≥95%)、阿托伐他汀鈣(純度≥99.5%) 武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司;大豆分離蛋白(純度≥95%) 新西蘭恒天然有限公司;大豆卵磷脂(純度≥70%)、殼聚糖(脫乙酰度≥95%,粘度100~200 mpa.s) 阿拉丁試劑有限公司;蘇木素 美國Sigma-Aldrich公司;伊紅Y(水溶性)、無水乙醇、二甲苯、鹽酸、包埋石蠟、中性樹膠 國藥集團化學試劑有限公司;膽固醇(純度≥90%)、豬膽鹽(膽酸含量≥60%)、豬油 上海源葉生物科技有限公司;總膽固醇(Total Cholesterol,TC)試劑盒、總甘油三酯(Triacylglycerol,TG)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(High Density Lipoprotein Cholesterol,HDL-C)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol,LDL-C)試劑盒 南京建成生物工程研究所。
AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;DF-101S型磁力攪拌機 上??茽杻x器設(shè)備有限公司;T18型高速分散機、Lab Dancer渦旋儀 德國IKA公司;ST2100型pH計 上海奧豪斯儀器有限公司;R3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司;Zetasizer Nano ZS型激光粒度儀 英國Malvern公司;Turbiscan Lab Expert型穩(wěn)定性分析儀 法國Formulaction公司;AH-2010型高壓均質(zhì)機 安拓思納米技術(shù)(蘇州)有限公司;GC 7890A型氣相色譜儀 美國Agilent科技有限公司;PICO 17型高速離心機 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;FD5系列冷凍干燥機 美國SIM公司;Enspire酶標儀 美國鉑金埃爾默公司;RM 2016病理切片機 德國Leica公司;BX53顯微鏡 日本奧林巴斯。
1.2.1 樣品的制備及表征
1.2.1.1 植物甾醇納米粒(PNP)制備 將大豆分離蛋白(SPI)溶解在去離子水中,室溫攪拌溶解,調(diào)節(jié)溶液pH為7.0,4 ℃水化過夜。將植物甾醇與卵磷脂按一定比例(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)溶解在無水乙醇中,室溫攪拌溶解,形成有機相;蛋白分散液于高速分散機下以10000 r/min的轉(zhuǎn)速進行高速分散,用帶有針頭的注射器將有機相緩慢注入其中,并繼續(xù)分散5 min;所得混合溶液通過高壓均質(zhì)形成穩(wěn)定的植物甾醇納米分散液(Phytosterol Nano-dispersions,PND),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇,加水稀釋至原蛋白濃度即得植物甾醇納米粒(Phytosterol Nanoparticles,PNP)。通過對PNP進行表征,穩(wěn)定性分析及包埋效果進行研究,得到PNP的制備最佳工藝為:均質(zhì)壓力為900 bar,均質(zhì)次數(shù)為6次,植物甾醇與卵磷脂比例為1∶4,大豆分離蛋白濃度為0.75%(w/w),無水乙醇體積為16 mL;所得納米粒的粒徑為(93.35±1.222) nm,電位為(-29.3±0.611) mV,植物甾醇的包埋率為97.26%。且PNP凍干后復(fù)溶性良好,經(jīng)復(fù)溶后植物甾醇在水中的溶解度達到了2.122 mg/mL。
1.2.1.2 殼聚糖修飾植物甾醇納米粒(CS-PNP)制備 按上述方法制備0.75%的SPI溶液,按照PND的最佳工藝條件及制備方法(無需進行高壓均質(zhì))制備植物甾醇分散液(Phytosterol Dispersions,PD),將殼聚糖按0.2%的比例溶于1%醋酸溶液中,40 ℃攪拌溶解,4 ℃水化過夜,按比例稀釋備用。取一定濃度(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL)的殼聚糖溶液,與植物甾醇分散液按1∶1 (v/v)混合,調(diào)節(jié)混合液pH至3.5,10000 r/min高速分散2 min,95 ℃水浴攪拌30 min,冷卻至室溫,得到CS-PNP。所得CS-PNP的最佳制備工藝為:殼聚糖濃度0.4 mg/mL,pH為3.5,加熱溫度為95 ℃,加熱時間為30 min;所得納米粒的粒徑為(182.6±2.05) nm,電位為(35.3±1.58) mV,植物甾醇的包埋率為91.37%。CS-PNP在低溫下穩(wěn)定性良好。
1.2.1.3 空白納米粒(NP)和空白殼聚糖修飾納米粒(CS-NP)制備 空白納米粒(NP)和空白殼聚糖修飾納米粒(CS-NP)分別按照PNP和CS-PNP的最佳制備工藝條件及制備方法(無需添加植物甾醇)進行制備。
1.2.2 試驗動物及飼養(yǎng)條件 試驗選用4~5周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠96只,體重18~22 g。實驗室溫度控制在22~25 ℃,相對濕度為55%~70%,自然光照,自由進食和飲水,適時更換飼料和飲用水,并清理鼠籠。
1.2.3 動物模型建立及干預(yù) 在小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)一周后,將小鼠隨機分成8組:正常組、高脂模型組、陽性對照組、植物甾醇(PS)組、植物甾醇納米粒(PNP)組、空白納米粒(NP)組、殼聚糖修飾植物甾醇納米粒(CS-PNP)組、空白殼聚糖修飾納米粒(CS-NP)組,每組12只,每組兩籠。正常組飼喂普通飼料,其他組飼喂高脂飼料,自由進食和飲水,建立高脂模型。飼喂8周后,測定小鼠血清指標TG、TC、HDL-C、LDL-C含量,判定高脂模型是否建立成功。模型建立成功后,再對小鼠進行干預(yù),正常組:飼喂普通飼料;高脂模型組:飼喂高脂飼料;陽性對照組:飼喂高脂飼料+0.0075%阿托伐他汀鈣;PS組:飼喂高脂飼料+0.2%植物甾醇;PNP組:飼喂高脂飼料+1.75%植物甾醇納米粒;NP組:飼喂高脂飼料+1.55%空白納米粒;CS-PNP組:飼喂高脂飼料+1.83%殼聚糖修飾植物甾醇納米粒;CS-NP組:飼喂高脂飼料+1.63%空白殼聚糖修飾納米粒。試驗藥物根據(jù)要求按照一定比例與高脂飼料混合均勻后使用,陽性藥物(阿托伐他汀鈣)按照人體最大攝入量80 mg/d計算,飼料中阿托伐他汀鈣以0.0075%的比例添加在高脂飼料中,試驗藥物均按照PS添加量為0.2%比例換算。
1.2.4 樣品收集 建模期間,每周記錄小鼠的體重,每日記錄采食量,每隔兩周小鼠眼眶采血,測定其血脂水平。藥物干預(yù)4周,干預(yù)結(jié)束后,小鼠禁食16 h,眼眶取血,頸椎脫臼致死,分離小鼠心、肝、脾、肺、腎,用生理鹽水漂洗,濾紙吸干并稱重。收集建模期和給藥期小鼠糞便,凍干保存,以便進一步分析。
1.2.5 小鼠臟器指數(shù) 將分離得到的臟器組織(心、肝、脾、肺、腎)用濾紙吸干稱重后,按下列公式計算小鼠的臟器指數(shù):
臟器指數(shù)(%)=臟器濕重(g)×100/體重(%)[9]
1.2.6 血清指標測定 眼眶取血所得血漿,室溫下靜置4 h,8000 r/min離心15 min,取上層血清,4 ℃冷藏保存,試劑盒檢測血清中總膽固醇(TC)、總甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量。
1.2.7 肝脂檢測 利用Folch法[10]抽提肝臟中的脂類物質(zhì):取0.5 g肝臟組織在2 mL生理鹽水中充分勻漿后,加入10 mL氯仿:無水乙醇(2∶1,v/v)溶液,渦旋混勻,超聲10 min,靜置10~15 min,5000 r/min離心10 min,收集下層清液保存。用試劑盒方法檢測肝臟中的TG含量。取1 mL肝臟提取液,加入200 μL 5α-膽甾烷,氮氣吹干,加入10 mL 1 mol/mL氫氧化鉀乙醇溶液,80 ℃皂化1 h,加入5 mL水和10 mL正己烷,萃取分液,水洗三次[11-12]。取有機相氮氣吹干,加入100 μL吡啶與100 μL BSTFA∶MCS(99∶1),70 ℃衍生1 h,氣相分析,檢測肝臟中膽固醇與植物甾醇含量。
1.2.8 肝臟組織病理學觀察 小鼠解剖后,取一小片新鮮肝臟組織用生理鹽水洗凈,立即置入4%多聚甲醛中保存。檢測時樣品經(jīng)脫水處理(75%乙醇4 h,85%乙醇2 h,90%乙醇1.5 h,95%乙醇1 h,無水乙醇Ⅰ 0.5 h,無水乙醇Ⅱ 0.5 h),透明處理(無水乙醇∶二甲苯為1∶1處理10 min,二甲苯Ⅰ 10 min,二甲苯Ⅱ 7 min)后,在60 ℃浸入石蠟(石蠟Ⅰ 1 h,石蠟Ⅱ 1 h,石蠟Ⅲ 1 h),使生物組織充分脫水,并用石蠟進行包埋;蠟塊冷凍后,用Leica RM2235切片機切取厚度為4 μm薄片,貼附于載玻片上,置于42 ℃溫水中展開,再放入60 ℃烤箱中烘烤3 h;然后脫去石蠟,將石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ(10 min)-二甲苯Ⅱ(10 min)-無水乙醇Ⅰ(5 min)-無水乙醇Ⅱ(5 min)-95%乙醇(3 min)-90%乙醇(3 min)-80%乙醇(2 min)-70%乙醇(2 min),然后蒸餾水浸洗2 min;接著將切片依次放入Harris氏蘇木素染液染色5~7 min,自來水洗浸洗返藍,1%的鹽酸酒精分化2~5 s,自來水洗浸洗返藍,1%水溶性伊紅染液染色2 min,自來水洗浸洗30 s,無水乙醇脫水,二甲苯透明,風干后中性樹膠封片;最后在顯微鏡下觀察[13-14]。
1.2.9 糞便中甾醇含量測定 將收集的老鼠糞便冷凍干燥,研成粉末;取0.5 g糞便粉末,加入10 mL氯仿:無水乙醇(2∶1,v/v)超聲提取1 h,5000 r/min離心10 min,收集上清液[15]。取1 mL糞便提取液,氮氣吹干,按上述1.2.5中的方法測定膽固醇與植物甾醇含量。
建模期(8周)各組小鼠的平均初始體重為(20±2) g,喂養(yǎng)8周后,小鼠的平均體重增加到(26±3) g(如圖1A)??梢钥闯?飼喂普通飼料和高脂飼料的小鼠體重同步增長,建模結(jié)束時,各組小鼠體重并無顯著差異。由于飼料配方差異,飼喂高脂飼料組的小鼠采食量均高于飼喂普通飼料組,且7組高脂飼料組小鼠采食量差別不大(如圖1B)。
圖1 建模期小鼠平均體重(A)及平均日采食量(B)變化
高脂血癥是由于脂肪代謝或轉(zhuǎn)運異常導(dǎo)致血脂類濃度異常,包括血清總膽固醇升高、甘油三脂升高、低密度脂蛋白膽固醇升高或高密度脂蛋白膽固醇降低[16]。建模后正常組和高脂模型組小鼠血清指標如表1所示。從表1中可以看出,高脂模型組經(jīng)過8周高脂飼料喂養(yǎng)后,與正常組相比,高脂模型組TG顯著升高(p<0.05),TC和LDL-C極顯著升高(p<0.01),而HDL-C顯著降低(p<0.05),說明小鼠高血脂模型建立成功。
表1 建模后小鼠血清指標(mmol/L)
各組小鼠平均采食量和體重如圖2所示,陽性對照組、PNP組、CS-NP組和CS-PNP組小鼠平均采食量呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢,但無顯著性差異(p>0.05),而其他組小鼠平均體重隨著飼喂時間延長,采食量逐漸增加。可能是由于降脂藥物的添加改變了飼料組成引起老鼠采食的不適,但第2周后均恢復(fù)正常,且總的來說,各組小鼠在給藥的4周內(nèi),采食量呈上升趨勢。在前3周,各組小鼠的平均體重逐漸增加,由26 g左右增加到28 g左右;在第4周時,飼喂阿托伐他汀鈣的陽性對照組小鼠平均體重從28.82 g降至26.23 g,而其他給藥組小鼠平均體重在第4周并無顯著變化,且與正常組小鼠無顯著差別,略低于高脂模型組小鼠,但無顯著差異(p>0.05)。這說明PS、NP、PNP、CS-NP和CS-PNP對小鼠體重沒有影響,而陽性藥物阿托伐他汀鈣會顯著(p<0.05)降低高脂小鼠體重。何文森[13]也發(fā)現(xiàn)植物甾醇、植物甾烷醇及其酯化產(chǎn)物均不會影響高脂模型組小鼠體重,這可能是由于植物甾醇與阿托伐他汀鈣的降膽固醇原理并不相同引起的。
圖2 給藥期小鼠平均體重(A)及平均日采食量(B)變化
給藥4周后,小鼠平均臟器指數(shù)如表2所示。高脂模型組肝系數(shù)顯著高于正常組(p<0.05),說明高脂飼料的攝入會影響小鼠肝的健康[17],而其它給藥組與正常組肝系數(shù)并無顯著差異(p>0.05),且除NP組外,均顯著低于高脂模型組(p<0.05),說明陽性藥物、PS、PNP、CS-NP和CS-PNP均可以顯著降低高血脂小鼠肝系數(shù)(p<0.05),NP也能降低小鼠肝系數(shù),但效果不顯著(p>0.05)。對于心系數(shù),高脂模型組小鼠相對于正常組小鼠有所下降,但其變化并不顯著(p>0.05),說明高血脂并未顯著影響小鼠心系數(shù),這與侯冬梅[18]的研究結(jié)果存在微小差異,但趨勢相同,這可能是由于所選試驗小鼠品種的差異造成。與高脂模型組相比,PS組和CS-PNP組能顯著升高高血脂小鼠心系數(shù)水平(p<0.05),與正常組無顯著差異(p>0.05),其他給藥組與高脂模型組并無顯著差別(p>0.05)。高脂模型組小鼠脾系數(shù)與正常組均在0.26左右,而給藥組小鼠顯著提高了小鼠脾系數(shù)(p<0.05),說明高血脂并不能影響小鼠脾系數(shù),但陽性藥物及其它給藥均會升高小鼠脾系數(shù),這可能是植物甾醇及其他活性物質(zhì)的添加造成了脾臟組織的部分腫大。但對于肺系數(shù)和腎系數(shù),各組小鼠之間并未觀察到顯著差異(p>0.05)。
表2 小鼠臟器指數(shù)(%)
給藥4周后,小鼠血清指標變化如表3所示。對于TG,高脂模型組小鼠顯著高于正常組(p<0.05),達到了1.61 mmol/L;與高脂模型組相比,給藥后,PS組、PNP組、CS-NP組和CS-PNP組TG含量顯著下降(p<0.05),而陽性對照組和NP組TG下降不顯著(p>0.05),說明陽性藥物阿托伐他汀鈣和NP對于高血脂小鼠血清TG并無顯著效果,其他給藥組對TG療效顯著。對于TC,可以看出,給藥組均顯著降低了高血脂小鼠TC水平(p<0.05),但PS組、NP組和CS-NP組TG水平仍顯著高于正常組(p<0.05),而陽性對照組、PNP組和CS-PNP組與正常組間無明顯差異(p>0.05),說明各組藥物均對TC有一定的療效,但阿托伐他汀鈣、PNP和CS-PNP對于降低血清TC效果更好。小鼠飼喂高脂飼料后,HDL-C顯著降低(p<0.05),而飼喂PNP和CS-PNP后,HDL-C恢復(fù)到了正常組水平,其他給藥組對于提高高血脂小鼠HDL-C水平并無顯著效果(p>0.05)。給藥4周后,普通組小鼠LDL-C為0.26 mmol/L,高脂模型組顯著升高達到了0.44 mmol/L(p<0.05),給藥組均顯著降低了高血脂小鼠LDL-C水平(p<0.05),陽性藥物和CS-PNP效果最好,LDL-C水平降至0.27 mmol/L,PNP效果次之,也達到了0.29 mmol/L,PS與NP組和CS-NP組也有一定的效果。在一項關(guān)于植物甾烷醇酯的研究中也表明,膽固醇輕微升高的個體每日攝入2.6 g谷甾烷醇酯持續(xù)一年后,與對照組相比谷甾烷醇酯攝入組的TC和LDL-C水平分別降低10.3%和13%[19]。
表3 給藥后小鼠血清指標(mmol/L)
肝臟是機體新陳代謝最活躍的組織,且脂質(zhì)的合成、分解、轉(zhuǎn)運和代謝等活動主要發(fā)生在肝臟[20]。同時肝臟也是機體中調(diào)節(jié)膽固醇和甘油三酯平衡的重要器官[21],如果肝臟受損,脂肪細胞就不能向血液細胞釋放甘油三酷、膽固醇和磷脂等,從而造成脂質(zhì)的積累,引起肝臟病變,所以肝臟中TG和TC的含量可以直接反應(yīng)植物甾醇對膽固醇代謝的影響[18]。給藥后,小鼠肝臟中TG和TC含量變化如圖3所示。高脂模型組肝臟TG、TC水平均顯著高于正常組(p<0.05),給藥后,陽性對照組、PS組、PNP組和CS-PNP組均顯著降低了肝臟TG水平(p<0.05),且與正常組無顯著差異(p>0.05);NP和CS-NP雖然能降低肝臟TG水平,但效果不顯著(p>0.05)。各藥物干預(yù)組均顯著降低了肝臟TC水平(p<0.05),其中陽性對照組、PNP組和CS-PNP組對于降低肝臟TC效果最明顯(p<0.05),均達到了普通組水平。PS組、NP組和CS-NP組效果次之。說明兩種植物甾醇納米粒對小鼠肝臟的代謝活動有顯著的影響。
圖3 肝臟中甘油三酯(TG)(A)和總膽固醇(TC)(B)含量
脂肪肝是指由于各種原因引起的肝細胞內(nèi)脂肪堆積過多的病變,高脂血癥常常并發(fā)脂肪肝。給藥結(jié)束后,對小鼠肝臟切片,進行組織病理學觀察,結(jié)果如圖4所示。正常組小鼠肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)規(guī)整,分布均勻,細胞質(zhì)無明顯空泡,沒有發(fā)生脂肪變性。高脂模型組小鼠肝細胞腫大,結(jié)構(gòu)松散,細胞間隙內(nèi)存在大量大小不一白色空泡,明顯發(fā)生脂肪變性。給藥后,陽性對照組、PS組、NP組和CS-NP組肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,分布較均勻,但可見大量不規(guī)則間隙,脂肪變性略微改善。而PNP組和CS-PNP組小鼠肝細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu),細胞質(zhì)等分布均趨于正常,對小鼠脂肪肝有明顯在改善。說明阿托伐他汀鈣、PS、NP、CS-NP和PNP、CS-PNP均能改善高血脂小鼠脂肪肝,但后兩者效果更好??梢钥闯龈闻K組織切片觀察所得結(jié)果與圖3所示的數(shù)據(jù)具有很好的一致性,這表明兩種植物甾醇納米粒具有良好的緩解肝臟脂肪病變的功能。
圖4 小鼠肝臟組織病理學觀察(200×)
如圖5所示,正常組小鼠糞便中膽固醇含量為1.04 mg/g,而高脂模型組小鼠糞便中膽固醇含量高達30.72 mg/g。添加陽性藥物后,膽固醇排出量增加到了34.29 mg/g。對于植物甾醇給藥組,由于植物甾醇可以降低膽固醇的吸收,PS組小鼠糞便中膽固醇含量增加到了33.37 mg/g,其效果與阿托伐他汀鈣接近;PNP組中植物甾醇納米化后排出膽固醇相對于PS組又有所增加,但同時植物甾醇的排出也從7.20 mg/g增加到9.42 mg/g,CS-PNP組也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。據(jù)介紹,膽固醇在機體的吸收率可達35%~70%,植物甾醇的吸收率僅為0.4%~3.5%[22]。高脂飼料中添加了1%的膽固醇,加大了機體對膽固醇的攝入量,同時也增加了膽固醇的排出。
圖5 糞便中甾醇含量
本研究通過建立高血脂模型考察自制的兩種植物甾醇納米粒(PNP和CS-PNP)對高血脂小鼠的降膽固醇效果。PNP和CS-PNP可通過降低小鼠肝臟和血脂中TG與TC含量、血清LDL-C水平,升高血清中HDL-C水平,促進機體膽固醇的排出,來改善膳食誘導(dǎo)的脂肪肝、高脂血癥和高膽固醇血癥。本研究為植物甾醇納米粒的降膽固醇效果提供理論依據(jù),為植物甾醇納米粒作為膳食補充劑的應(yīng)用提供了技術(shù)支持。