豆粉中大豆轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)能力驗(yàn)證項(xiàng)目檢驗(yàn)方法分析

□ 劉彥泓 楊 滴 大連市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心

能力驗(yàn)證已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的常用方法之一，其在確定實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)或校準(zhǔn)能力方面具有不可替代的作用。中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）要求已認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室和申請(qǐng)認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室必須參加能力驗(yàn)證活動(dòng)。轉(zhuǎn)基因抗草甘膦除草劑（Roundup Ready? ）大豆（即轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2）是目前種植面積和產(chǎn)量都很高的轉(zhuǎn)基因作物，實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展此項(xiàng)目的檢測(cè)能力驗(yàn)證，既可以提高實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)技術(shù)能力與水平，也有利于提高實(shí)驗(yàn)室對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行監(jiān)管的能力。

1 材料與試劑

1.1 試驗(yàn)樣品

轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2樣品：中檢院NIFDC-PT-136豆粉中大豆轉(zhuǎn)基因成分測(cè)定能力驗(yàn)證陽(yáng)性樣品。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒（Magnetic DNA Purif ication System For Food），購(gòu)自Promega公司；PCR反應(yīng)試劑盒TaKaRa Ex Taq? DNA Polymerase、Premix Ex Taq ? （Probe qPCR），購(gòu)自Takara Bio公司。

1.3 引物及探針序列

引物及探針購(gòu)自Takara Bio公司，引物及探針序列見(jiàn)SN/T1195-2003[1]和GB/T19495.5-2018[2]。

2 方法

2.1 模板DNA的提取

采用Promega公司Magnetic DNA Purif ication System For Food試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取。

2.2 PCR檢測(cè)

Ex Taq 0.25 μL，10×Ex Taq Buf fer 5 μL，dNTP 4 μL，引物（10 μmol/L）各 1 μL，DNA（50 ng/μL）2 μL， 補(bǔ)水至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃下5 min；94 ℃下 30 s，54 ℃下 40 s，72 ℃下60 s，40個(gè)循環(huán)；最后一次循環(huán)中，72 ℃下7 min。擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，并記錄結(jié)果。

2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)

反應(yīng)緩沖液10 μL，引物（10 μmol/L）各 1 μL， 探 針（10 μmol/L）1 μL，DNA（50 ng/μL）1 μL， 補(bǔ) 水 至 20 μL。擴(kuò)增條件95 ℃保持10 min；95℃保持1 min，60 ℃保持30 s（讀取熒光），40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，并記錄結(jié)果。

2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

每個(gè)PCR反應(yīng)均設(shè)置2個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，并設(shè)置空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

3 主要儀器

ABI實(shí)時(shí)熒光PCR儀（型號(hào)為QuantStudio 7Flex），購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；ABI PCR儀（型號(hào)為VERITI），購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司。

4 結(jié)果及分析

4.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

內(nèi)源基因Lectin與外源基因CaMV35S、NOS、CP4 EPSPS的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，其PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期大小基本一致，空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照均符合要求，判定此樣品為轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2陽(yáng)性。電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 PCR檢測(cè)結(jié)果

4.2 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

內(nèi)源基因Lectin和GTS40-3-2品系特異基因檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照均符合要求，判定此樣品為轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2陽(yáng)性。擴(kuò)增圖見(jiàn)圖2。

5 結(jié)論與討論

筆者所在實(shí)驗(yàn)室作為中檢院NIFDC-PT-136豆粉中大豆轉(zhuǎn)基因成分測(cè)定項(xiàng)目的技術(shù)合作實(shí)驗(yàn)室，在樣品制備、樣品轉(zhuǎn)基因成分定性檢驗(yàn)、樣品均勻性及穩(wěn)定性檢驗(yàn)等基礎(chǔ)性研究上做了大量的工作。對(duì)于轉(zhuǎn)基因大豆能力驗(yàn)證樣品的檢驗(yàn)，總結(jié)出幾點(diǎn)需要注意的地方。

圖2 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

5.1 避免污染

能力驗(yàn)證發(fā)放的樣品一般為陰性和陽(yáng)性樣品均有。由于樣品是經(jīng)過(guò)粉碎過(guò)篩的大豆粉，其粉塵容易飄散，取樣過(guò)程不規(guī)范可造成不同樣品之間的污染。目前轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方法中，PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用最為廣泛[3]。PCR檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、快捷；缺點(diǎn)是操作不當(dāng)容易造成污染，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。PCR擴(kuò)增時(shí)最主要的污染源是擴(kuò)增產(chǎn)物，PCR擴(kuò)增的終產(chǎn)物容易飛濺或形成氣溶膠，對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、試劑、設(shè)備和衣物等造成污染[4]。因此檢測(cè)過(guò)程中避免污染非常重要。為保證結(jié)果準(zhǔn)確，參加測(cè)試的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)室區(qū)域劃分、檢測(cè)過(guò)程質(zhì)量控制等方面遵循規(guī)范性標(biāo)準(zhǔn)要求。核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)劃為5個(gè)區(qū)：試劑配制和貯存區(qū)、樣品制備區(qū)、PCR反應(yīng)配制區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。做好清潔消毒工作：定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行消毒，用75%的酒精擦拭移液器等小型設(shè)備；經(jīng)常擦洗臺(tái)面、地面，做好衛(wèi)生工作；加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室空氣與大氣空氣的置換，從而凈化實(shí)驗(yàn)室空氣；經(jīng)常對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間紫外燈照射，滅活空氣中的游離核酸片段。另外在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)按標(biāo)準(zhǔn)要求設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，反映檢測(cè)過(guò)程是否存在污染。

5.2 模板DNA濃度和純度

模板的濃度和純度對(duì)目的基因的檢測(cè)來(lái)說(shuō)是較為重要的[5]。通過(guò)紫外分光光度計(jì)可以測(cè)定模板DNA的濃度，并計(jì)算A260nm/A280nm的比值，在1.7～2.0比較好。通常情況下，建議PCR反應(yīng)體系中模板的添加量為50～100 ng。

5.3 檢測(cè)方法的選取

目前現(xiàn)行有效的涉及轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)有很多：GB/T 19495.4-2018、SN/T 1195-2003、SN/T 1204-2016、SN/T 2668-2010、SN/T 1202-2010、NY/T 675-2003 及SN/T 1201-2014等。建議實(shí)驗(yàn)室選擇本實(shí)驗(yàn)室常用的檢驗(yàn)方法進(jìn)行檢驗(yàn)。同時(shí)建議選擇兩種以上的方法進(jìn)行比較后，得出結(jié)論。