高效體積排阻色譜法定量檢測口蹄疫疫苗中146S的疫苗預(yù)處理方法

宋艷民，楊延麗，蘇志國，劉麗麗，朱元源，徐嫄，鄒興啟，趙啟祖，張松平

高效體積排阻色譜法定量檢測口蹄疫疫苗中146S的疫苗預(yù)處理方法

宋艷民1,2，楊延麗1，蘇志國1，劉麗麗1，朱元源3，徐嫄3，鄒興啟3，趙啟祖3，張松平1

1 中國科學(xué)院過程工程研究所 生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗室，北京 100190 2 中國科學(xué)院大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，北京 100049 3 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081

旨在建立一種口蹄疫滅活病毒疫苗的處理方法，去除尺寸排阻色譜法（HPSEC）檢測146S抗原過程中的雜質(zhì)干擾，獲得最佳的檢測信號并實(shí)現(xiàn)146S抗原含量的準(zhǔn)確測定。分別考察了超速離心法、PEG沉淀法、核酸酶消化法對兩批疫苗樣品中的HPSEC檢測干擾雜質(zhì)的去除效果。在優(yōu)化條件下，超速離心法處理后146S檢測結(jié)果分別為7.1、7.6 μg/mL，PEG沉淀法為9.7、10.4 μg/mL；酶消化法處理后的檢測值最高，分別為10.5、10.4 μg/mL，且雜質(zhì)去除完全、處理速度快、操作條件溫和。通過響應(yīng)面法確定最優(yōu)酶消化處理條件如下：200 μL水相中添加終濃度421 U/mL的Benzonase，25.1 ℃下反應(yīng)1.29 h。在該最優(yōu)條件下，對4家企業(yè)各3種不同血清型共12批疫苗樣品進(jìn)行146S含量檢測，結(jié)果表明建立的方法對不同疫苗均有良好適用性，且重復(fù)性好（<5.3%，=3）。通過該處理方法，解決了雜質(zhì)對146S定量檢測的干擾，擴(kuò)大了HPSEC檢測技術(shù)的應(yīng)用范圍，進(jìn)一步確保了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

尺寸排阻色譜，口蹄疫疫苗，146S，定量，酶消化

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD) 是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV) 引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。由于其強(qiáng)感染性及存在多種血清型和亞型，F(xiàn)MD往往難以控制[1-2]。目前，在流行區(qū)對口蹄疫的防控主要采取滅活病毒疫苗定期免疫，使用的滅活疫苗為雙相油乳劑疫苗[2-3]。隨著對疫苗安全性、純度和整體質(zhì)量要求的日益嚴(yán)格，疫苗的質(zhì)量控制在疫苗開發(fā)和生產(chǎn)中的重要性與日俱增[4-5]。評價口蹄疫滅活疫苗質(zhì)量的重要指標(biāo)之一是疫苗中活性成分即完整病毒粒子146S的含量[6]，因此146S含量檢測技術(shù)的研究成為近幾年關(guān)注的重點(diǎn)。檢測146S抗原含量的傳統(tǒng)方法為蔗糖密度梯度離心法[7-8]，該方法存在操作復(fù)雜、檢測速度慢、樣品損耗大、結(jié)果重復(fù)性差等問題[9-12]。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 也有報道[13-14]，但存在難以區(qū)分完整抗原146S與裂解產(chǎn)物12S的缺點(diǎn)，且準(zhǔn)確性差。高效液相尺寸排阻色譜技術(shù)(High performance size exclusion chromatography，HPSEC) 因其靈敏度高、快速、重復(fù)性好、自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)，近年來廣泛應(yīng)用于疫苗的分析檢測[9,15-16]。該技術(shù)的原理是利用不同分子水力學(xué)大小上的差異，在色譜柱中的停留時間不同，從而實(shí)現(xiàn)對疫苗中不同組分的分離、檢測[17]。近年來，HPSEC法在口蹄疫疫苗抗原檢測上的應(yīng)用逐漸受到關(guān)注。楊延麗等利用HPSEC法對口蹄疫病毒溶液中的146S進(jìn)行了定量分析和穩(wěn)定性檢測，并結(jié)合差示掃描量熱技術(shù)篩選出對146S具有保護(hù)效果的穩(wěn)定劑[9,18]。徐嫄等通過優(yōu)化口蹄疫成品疫苗的破乳條件，建立了油乳劑疫苗產(chǎn)品中146S的HPSEC定量檢測方法，對該方法的精密度、準(zhǔn)確度、專屬性、耐受性等進(jìn)行了驗證，并應(yīng)用到了不同血清型的滅活口蹄疫疫苗的市場抽檢[19-20]，認(rèn)為HPSEC法簡便、高效、準(zhǔn)確度較高，有望在口蹄疫滅活疫苗的質(zhì)量控制中發(fā)揮重要作用。

然而HPSEC在口蹄疫疫苗質(zhì)量控制的應(yīng)用中也存在一些挑戰(zhàn)。由于各口蹄疫疫苗生產(chǎn)企業(yè)的制備工藝差別較大，疫苗中可能存在與146S抗原具有相近尺寸大小的蛋白質(zhì)、宿主核酸等雜質(zhì)，干擾146S的紫外特征吸收峰，極大地影響146S的準(zhǔn)確定量，從而限制了該方法的廣泛應(yīng)用。本研究旨在建立一種口蹄疫滅活病毒疫苗的前處理方法，去除對HPSEC中146S特征吸收峰產(chǎn)生干擾的主要物質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)146S的準(zhǔn)確定量。經(jīng)過驗證，該方法適用于市面上不同廠家、不同血清型的口蹄疫疫苗產(chǎn)品的處理及后續(xù)準(zhǔn)確測定。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀(Agilent，USA)，Neofuge 23R臺式高速冷凍離心機(jī)(上海力申科學(xué)儀器有限公司)，Sartorius BS 110S 型萬分之一電子天平(Sartorius，Germany)，Sorvall WX Ultra Series離心機(jī)(Thermo Scientific，USA)及Surespin 630水平轉(zhuǎn)子。

1.2 主要試劑及測試樣品

Benzonase (Sigma公司，USA)，RNase A (Sigma公司，USA)。所用其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。供試疫苗樣品16批，由國內(nèi)4家口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。含O型146S的細(xì)胞培養(yǎng)液由蘭州獸醫(yī)研究所提供。146S純品是根據(jù)文獻(xiàn)報道的層析純化方法，對146S細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行純化制備獲得[21]。

1.3 口蹄疫疫苗破乳

使用正戊醇作為破乳劑，按疫苗與正戊醇體積比9︰1充分振蕩混勻，4 ℃靜置30 min后，3 000 r/min、4 ℃離心5 min，取下層抗原水相進(jìn)行后續(xù)處理或檢測。

1.4 高效液相尺寸排阻色譜定量檢測方法

色譜檢測采用TSK G4000 SWXL(7.8 mm× 300 mm)色譜柱(TOSOH)；流動相為50 mmol/L pH 7.5磷酸緩沖液，含0.1 mmol/L硫酸鈉；進(jìn)樣體積為100 μL；流速為0.6 mL/min；檢測波長259 nm。首先建立用于146S定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線。用上述配置的流動相對146S純品進(jìn)行梯度稀釋，至最低檢測濃度為1 μg/mL。根據(jù)上述色譜條件對各濃度的146S純品進(jìn)行檢測，以儀器積分的峰面積為橫坐標(biāo)，146S濃度為縱坐標(biāo)，繪制峰面積與濃度的線性回歸方程，得到方程=0.016 5(2=0.998，=6)。隨后采用上述色譜條件對破乳后得到的水相抗原進(jìn)行檢測，將146S的積分峰面積代入所得回歸方程中，即可計算得到146S在破乳水相中的濃度。

1.5 超速離心法處理

取10 mL疫苗破乳后收集的水相抗原加至10 mL超速離心管中，分別于Sorvall WX Ultra Series離心機(jī)中20 000 r/min離心5 h、30 000 r/min離心4 h、40 000 r/min離心2 h。棄去上清液后，用200 mmol/L 磷酸鈉緩沖液(PBS) (pH 8.0)復(fù)溶至10 mL，進(jìn)行后續(xù)HPSEC檢測。每個樣品及離心條件重復(fù)3次實(shí)驗。

1.6 PEG沉淀法處理

取1 mL水相抗原，分別加入終濃度6%–10% (/) 的聚乙二醇2 000、6 000、10 000，以及終濃度0–1 mol/L 的氯化鈉?；靹蚝笥? ℃靜置 10 h充分沉淀146S，8 000 r/min離心20 min，棄去上清后用等體積的PBS (pH 8.0)復(fù)溶并采用HPSEC檢測。

1.7 核酸酶消化處理

將Benzonase和RNase A分別預(yù)先用 50 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)、20 mmol/L NaCl、 2 mmol/L MgCl2緩沖液稀釋至一定濃度。取疫苗破乳水相抗原200 μL，分別加入1 μL稀釋后的酶液至終濃度為50–500 U/mL?；靹蚝笥?0–37 ℃下反應(yīng)0.5–3.0 h后采用HPSEC測定。

1.8 透射電子顯微鏡檢測

146S的形貌通過FEI Tecnai 20 透射電子顯微鏡檢測(TEM，Royal Philips Electronics，Amsterdam)。將少量樣品滴至400-網(wǎng)眼銅載網(wǎng)，1%乙酸雙氧鈾染色，自然干燥后測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 無處理的疫苗的HPSEC檢測

隨機(jī)挑選4批不同血清型的口蹄疫疫苗(表1)，按照文獻(xiàn)報道的方法[20]，經(jīng)破乳后直接進(jìn)行HPSEC法定量檢測。除非特別說明，本文中的146S含量均為疫苗破乳后水相中的濃度。

根據(jù)圖1中的色譜圖，樣品2、4的色譜圖與報道中的一致[9]，能夠很好地檢測到146S在13.4 min左右出現(xiàn)的特征吸收峰，而1、3樣品的色譜圖中存在大量的雜質(zhì)覆蓋了146S的吸收峰，無法積分計算含量。因此，這部分口蹄疫疫苗樣品，難以直接使用HPSEC進(jìn)行準(zhǔn)確定量，從而限制了在口蹄疫疫苗質(zhì)量控制的應(yīng)用。為了解決這一問題，去除雜質(zhì)對146S特征峰的干擾，對1、3樣品分別采用超速離心法、PEG沉淀法、核酸酶消化法進(jìn)行處理，優(yōu)化去除干擾的最佳方法及條件。

表1 不經(jīng)預(yù)處理疫苗樣品的測定結(jié)果

aNA represents the 146S concentration was not acquired due to disturbance from impurities.

圖1 四種口蹄疫疫苗不經(jīng)預(yù)處理的HPSEC測定色譜圖

2.2 超速離心法處理

超速離心的時間和轉(zhuǎn)速都將影響146S的沉淀完全與否。轉(zhuǎn)速越高、沉淀時間越長，146S沉淀的越完全，但過高的離心速度同樣會導(dǎo)致雜質(zhì)的沉淀而降低除雜效果。三種離心條件下處理后樣品1、3的HPSEC檢測色譜圖如圖2所示。相比未經(jīng)處理時，經(jīng)超速離心收集后的樣品其146S特征峰附近的干擾雜質(zhì)大大減少，能逐漸看到146S特征吸收峰。然而146S損失大，尤其是在30 000 r/min離心4 h時，未能觀測到顯著的146S特征峰。此外，3種條件均無法去除9–14 min出現(xiàn)的尺寸比146S大的雜質(zhì)。這可能是由于這些雜質(zhì)具有比146S更大的沉降系數(shù)，當(dāng)146S被沉降收集時，這些雜質(zhì)也被一同收集。經(jīng)過對146S峰面積計算，最佳條件為40 000 r/min 離心2 h，測得樣品1濃度為7.1 μg/mL，樣品3濃度為 7.6 μg/mL。作為對比，將7.5 μg/mL的146S純品按照相同操作進(jìn)行40 000 r/min離心2 h沉淀并重懸，測得濃度為5.8 μg/mL，表明該方法可能會產(chǎn)生抗原損失。

<1)，且各件產(chǎn)品是否為不合格品相互獨(dú)立．

2.3 PEG沉淀處理

首先以樣品3為考察對象，對PEG沉淀過程中添加的PEG分子量、PEG濃度及氯化鈉濃度的影響設(shè)計了Box-Behnken響應(yīng)面試驗，結(jié)果見表2。經(jīng)過PEG沉淀后，對146S特征吸收峰有干擾的物質(zhì)都被不同程度地去除，并能檢測到146S特征峰。PEG沉淀的條件不僅影響到干擾雜質(zhì)的去除效果，同樣也會影響146S抗原經(jīng)過沉淀復(fù)溶后的收率。根據(jù)Design-Expert 8.0擬合結(jié)果，向水相抗原中加入質(zhì)量體積比為10%的PEG 6 000，NaCl濃度為0 mol/L時進(jìn)行沉淀復(fù)溶的結(jié)果最佳，HPSEC檢測具有最高值。在該條件下對樣品1和3的水相抗原進(jìn)行處理后進(jìn)行HPSEC檢測的結(jié)果見圖3。該最佳條件下測得樣品1濃度為9.7 μg/mL，樣品3濃度為10.4 μg/mL。作為對比，將7.5 μg/mL的146S純品按照相同操作進(jìn)行PEG沉淀及復(fù)溶，測得濃度為7.1 μg/mL，與原濃度相近，但經(jīng)過處理后結(jié)果略低。

圖2 1號和3號疫苗抗原相超速離心預(yù)處理后色譜圖

表2 PEG沉淀試驗的Box-Behnken設(shè)計方案及響應(yīng)值結(jié)果

2.4 核酸酶消化法試驗

口蹄疫疫苗生產(chǎn)所得細(xì)胞培養(yǎng)液中可能包含大量的宿主核酸或病毒核酸未被純化除去而存在于最終制備的疫苗中。為了去除這部分雜質(zhì)的影響，首先向200 μL樣品3的抗原水相中分別加入終濃度為500 U/mL的Benzonase或RNase A，于25 ℃下反應(yīng)1 h后進(jìn)行HPSEC檢測，結(jié)果見圖4A。經(jīng)過核酸酶消化后，干擾物的紫外吸收均有大幅度減少，但Benzonase消化后能夠檢測到完整的146S特征峰，而RNase A未能完全去除干擾物，仍存在極少量干擾峰對146S的積分產(chǎn)生影響。RNase A為內(nèi)切核糖核酸酶，具有高度專一性，可催化RNA鏈的斷裂[22]。Benzonase則為多功能非限制性核酸內(nèi)切酶，可將不同的DNA或RNA鏈完全水解成小片段，且無蛋白水解活性[23]，可在不破壞病毒蛋白衣殼的同時，將外部核酸雜質(zhì)完全水解。因此Benzonase的處理效果更理想，且以上結(jié)果也證實(shí)對HPSEC檢測146S抗原產(chǎn)生干擾的主要物質(zhì)應(yīng)為核酸。收集圖4B中經(jīng)Benzonase處理后的樣品1的146S特征峰，經(jīng)TEM驗證為完整的146S顆粒。

圖3 FMDV疫苗抗原相PEG沉淀預(yù)處理后的色譜圖

圖4 FMDV疫苗抗原相核酸酶消化預(yù)處理后色譜圖

進(jìn)一步優(yōu)化Benzonase處理條件。提高溫度可以提高酶活、減少處理時間，但由于FMDV極不穩(wěn)定[24-26]，提高溫度可能會造成146S的裂解。對酶消化的時間、溫度、酶濃度三種因素設(shè)計了響應(yīng)面實(shí)驗，結(jié)果見表3。對影響146S檢測濃度的各因素之間的交互作用進(jìn)行分析，并繪制響應(yīng)面曲線圖(圖5)。各變量因素對146S檢測濃度影響程度的大小順序依次為：酶活濃度>溫度>時間。利用Design-Expert 8.0軟件對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，并建立二次回歸方程，得2=0.953 9，表明擬合結(jié)果較好。經(jīng)過響應(yīng)面實(shí)驗，確定的最佳操作條件為200 μL水相添加終濃度為421 U/mL的酶溶液，25.1 ℃環(huán)境中反應(yīng)1.29 h。將該最優(yōu)條件用于樣品1、3處理，色譜圖如圖4B所示。經(jīng)充分酶消化反應(yīng)后，大量干擾紫外吸收峰消失，而20 min左右的紫外吸收峰顯著增大，表明干擾雜質(zhì)被降解為分子量更小的雜質(zhì)。隨著干擾雜質(zhì)的去除，能夠檢測到完整的146S特征吸收峰。經(jīng)積分計算，測得樣品1濃度為10.5 μg/mL，樣品3濃度為10.4 μg/mL。

圖5 時間、溫度和酶濃度對146S測定結(jié)果的交互影響

表3 核酸酶處理響應(yīng)面設(shè)計方案及響應(yīng)值結(jié)果

adisturbance was removed after digestion but no 146S was detected, which was probably due to 146S dissociation at 37 °C.

b146S concentration was not acquired due to disturbance from impurities, no evident 146S peak was observed.

為進(jìn)一步驗證核酸酶是否會對146S的顆粒結(jié)構(gòu)或內(nèi)部的核酸產(chǎn)生影響，以及該處理溫度、時間條件下是否會導(dǎo)致146S的損失，在7.5 μg/mL 146S純品中分別加入終濃度為421 U/mL的Benzonase或RNase A，于25.1 ℃環(huán)境中反應(yīng)1.29 h，并與加酶孵育前的146S進(jìn)行HPSEC色譜圖和透射電子顯微鏡觀測比較。如圖6所示，146S的特征吸收峰的位置、峰面積以及TEM形貌，在加入核酸酶反應(yīng)前后均未發(fā)生明顯改變。該結(jié)果表明，在優(yōu)化的酶處理的溫度、時間條件下，兩種核酸酶處理對146S的含量和結(jié)構(gòu)均無影響。并且由于146S在259 nm處特征峰的大小沒有變化，也進(jìn)一步證實(shí)由于病毒衣殼蛋白間的空隙較小，核酸酶難以進(jìn)入病毒內(nèi)部，從而不會作用于病毒內(nèi)部的RNA，否則由于RNA的降解，其紫外吸收將會發(fā)生變化。

圖6 146S分別加入兩種核酸酶處理前后色譜圖對比

2.5 三種處理方法比較

對以上3種水相抗原的處理方法的比較匯總于表4。對比3種方法的146S檢測結(jié)果，PEG沉淀與酶消化法均高于超速離心法，且根據(jù)HPSEC色譜圖可知這兩種方法能夠完全去除干擾物對特征峰的干擾，得到的結(jié)果更準(zhǔn)確，而超速離心法不僅難以完全去除干擾雜質(zhì)，還產(chǎn)生較大的抗原損失。但PEG沉淀操作可能會產(chǎn)生部分146S抗原的損失，使得部分樣品的測定結(jié)果略低于酶消化法，且PEG沉淀法的缺點(diǎn)是處理時間長，需要靜置過夜。此外，超速離心法還受限于儀器的處理量，難以應(yīng)用于大量樣品的處理。而Benzonase酶消化法不僅處理速度快，操作條件溫和，且處理量不限，為3種方法中的最優(yōu)方法。

2.6 疫苗樣品的測定

對建立的酶消化法的適用性、檢測結(jié)果重復(fù)性及準(zhǔn)確性進(jìn)行了考察。測定了4家企業(yè)各3種不同血清型共12批疫苗樣品破乳水相中的抗原含量，圖7分別對比酶處理及未經(jīng)酶處理的HPSEC檢測的譜圖，計算得到的146S含量結(jié)果匯總于表5。

可以看出，由于各企業(yè)生產(chǎn)工藝不同，疫苗中 146S和干擾雜質(zhì)含量不同，對 146S 檢測產(chǎn)生了不同程度的影響。HPSEC圖譜顯示12 批樣品的色譜結(jié)果存在差異，有些樣品干擾雜質(zhì)含量較高，掩蓋了146S特征峰，有些無雜質(zhì)干擾。存在干擾峰的樣品經(jīng)酶處理后均能檢測到完整的146S特征峰，如圖7 A2、B1、C2、D2所示，表明酶消化法對不同企業(yè)不同血清型的樣品均有良好的適用性；無干擾峰的樣品經(jīng)酶處理后的檢測結(jié)果與酶消化前的圖譜一致，如圖7 A1、B2、C1所示，表明酶消化法不會造成146S的損失。經(jīng)3次重復(fù)操作的均小于5.3%，表明處理重復(fù)性良好。對比無干擾樣品加酶前后的檢測結(jié)果，均小于5%。

表4 三種處理方法比較

圖7 12個批次疫苗樣品抗原相經(jīng)過Benzonase在優(yōu)化條件下預(yù)處理前后進(jìn)行HPSEC檢測的色譜圖

表5 疫苗樣品測定結(jié)果

3 討論

HPSEC作為一種疫苗抗原質(zhì)量評價的新方法，具有快速、高效、成本低等優(yōu)點(diǎn)。146S特征峰與雜質(zhì)的有效分離是保證其含量準(zhǔn)確檢測的基礎(chǔ)。在應(yīng)用HPSEC分析檢測口蹄疫滅活疫苗中的146S抗原含量時，因不同企業(yè)生產(chǎn)工藝的不同會遇到與雜質(zhì)的分離度不理想或146S吸收峰不明顯的情況。文中針對這一問題，綜合考察比較了3種不同原理的去除雜質(zhì)干擾的樣品處理方法。對處理方法的要求在于，首先要能夠完全去除干擾物質(zhì)對146S特征峰的影響，同時要保證處理過程不會造成146S的損失。在本研究考察的3種方法中，超速離心法利用病毒146S具有高的沉降系數(shù)從而與雜質(zhì)分離，但實(shí)際去除干擾雜質(zhì)效果一般，且操作費(fèi)時費(fèi)力，設(shè)備昂貴；PEG沉淀法利用146S具有較大尺寸，在較低濃度的PEG條件下能被沉淀從而與雜質(zhì)分離，分離效果較好，但耗時長；核酸酶消化法將長鏈的殘留核酸消化降解為小的片段，從而能在HPSEC檢測中后出峰，不影響146S的特征峰，處理速度快且操作簡單、條件溫和、無抗原損失。最終對確定的最優(yōu)酶處理條件的適用性、準(zhǔn)確性及重復(fù)性進(jìn)行了驗證。通過建立的口蹄疫疫苗樣品的處理方法，解決了部分口蹄疫滅活病毒疫苗中雜質(zhì)含量高、難以定量分析的問題，提高了HPSEC檢測方法的適用性，保證了HPSEC法在口蹄疫疫苗質(zhì)量控制、降低生物安全風(fēng)險、提高環(huán)保效益等方面的應(yīng)用前景。

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Vaccine pretreatment for quantification of 146S antigen in foot-and-mouth disease vaccines by high performance size exclusion chromatography

Yanmin Song1,2, Yanli Yang1, Zhiguo Su1, Lili Liu1, Yuanyuan Zhu3, Yuan Xu3, Xingqi Zou3, Qizu Zhao3, and Songping Zhang1

1 State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China 2 School of Chemical Engineering, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 3 China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081, China

We developed a pre-treatment method to remove interfering substances during quantification of 146S antigens in foot-and-mouth disease (FMD) vaccines by high performance size exclusion chromatography (HPSEC). Three methods, including ultracentrifugation, PEG precipitation and nuclease digestion, were optimized and compared for removal efficiency of the interfering impurities in FMD vaccines. Under optimized conditions, the 146S contents in two batches of FMD vaccines were determined to be 7.1 and 7.6 μg/mL by ultracentrifugation, 9.7 and 10.4 μg/mL by PEG precipitation, and 10.5 and 10.4 μg/mL by nuclease digestion. The optimal condition for nuclease digestion using Benzonase determined by response surface method was as follows: appending Benzonase into 200 μL of antigen phase to a final concentration of 421 U/mL and incubating at 25.1 °C for 1.29 h. This method has advantages including efficient removal of the interfering impurities, fast processing speed, and mild operating conditions. Then 12 bathes of FMD vaccines with different serotypes produced by 4 manufacturers were tested to verify the established treatment method. Results showed the method was applicable to various FMD vaccines with good reproducibility (<5.3%,=3). The developed method removed interference from impurities during quantification of 146S, and therefore would broaden the application of HPSEC in vaccine quality control and ensure the accuracy and reliability.

size exclusion chromatography, foot-and-mouth disease vaccine, 146S, quantification, enzymatic digestion

January 24, 2019;

March 11, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 21808226, 21821005).

Songping Zhang. Tel/Fax: +86-10-82544958; E-mail: spzhang@ipe.ac.cn

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 21808226，21821005) 資助。

宋艷民, 楊延麗, 蘇志國, 等. 高效體積排阻色譜法定量檢測口蹄疫疫苗中146S的疫苗預(yù)處理方法. 生物工程學(xué)報, 2019, 35(8): 1441–1452.Song YM, Yang YL, Su ZG, et al. Vaccine pretreatment for quantification of 146S antigen in foot-and-mouth disease vaccines by high performance size exclusion chromatography. Chin J Biotech, 2019, 35(8): 1441–1452.

(本文責(zé)編 陳宏宇)