MarR家族轉(zhuǎn)錄因子HpaR和XC0449協(xié)同調(diào)控野油菜黃單胞菌致病性

李雅君，李愛(ài)寧，孟繁凡，張宏宇，錢(qián)韋，賀偉，鄧超穎

MarR家族轉(zhuǎn)錄因子HpaR和XC0449協(xié)同調(diào)控野油菜黃單胞菌致病性

李雅君1,2，李愛(ài)寧1，孟繁凡2，張宏宇2，錢(qián)韋2，賀偉1，鄧超穎2

1 北京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，北京 100083 2 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 植物基因組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

MarR家族轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于細(xì)菌及古生菌中，并靈活、精細(xì)地調(diào)控多種毒力、抗脅迫及抗生素相關(guān)的生理生化途徑。在野油菜黃單胞菌中，MarR家族轉(zhuǎn)錄因子HpaR (XC2827) 的失活會(huì)顯著降低細(xì)菌對(duì)于寄主甘藍(lán)的致病力，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致胞外蛋白酶的過(guò)量表達(dá)。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，8004基因組一共編碼9個(gè)MarR家族轉(zhuǎn)錄因子。表達(dá)并純化其中的HpaR (XC2827) 和XC0449，體外微量熱泳動(dòng)(MST) 實(shí)驗(yàn)及Pull-down 實(shí)驗(yàn)證明二者可以在體外特異性結(jié)合。同時(shí)，表型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌致病力顯著下降。通過(guò)體外凝膠遷移阻滯試驗(yàn) (EMSA)、體內(nèi)qRT-PCR和GUS檢測(cè)證明，XC0449和HpaR均作為轉(zhuǎn)錄激活子協(xié)同調(diào)控下游致病相關(guān)基因的表達(dá)，最終調(diào)控細(xì)菌毒力及胞外酶合成。

轉(zhuǎn)錄調(diào)控，MarR家族轉(zhuǎn)錄因子，野油菜黃單胞菌，致病性

MarR (Multiple antibiotic resistance regulator) 家族轉(zhuǎn)錄因子作為控制多重抗生素抗性的一種轉(zhuǎn)錄抑制子，于1983年首次在大腸桿菌中被鑒定[1-2]，這些抗生素包括四環(huán)素、氯霉素、嘌呤霉素、萘啶酸、青霉素、氟喹諾酮等[3-4]。MarR家族轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于細(xì)菌及古生菌中[5]。根據(jù)Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)的統(tǒng)計(jì)，結(jié)合已有的遺傳及生化證據(jù)，目前在44 000種細(xì)菌和古生菌中分布著至少335 000個(gè)MarR家族轉(zhuǎn)錄因子[6-7]。結(jié)構(gòu)上，MarR家族轉(zhuǎn)錄因子是保守的有翼的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋 (wHTH) 結(jié)合蛋白，以二聚體的形式結(jié)合在啟動(dòng)子內(nèi)的回文序列上[8]。功能上，它們作為感應(yīng)環(huán)境變化的傳感器，能夠結(jié)合小分子化合物并快速啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄水平的適應(yīng)性調(diào)節(jié)[9]，包括控制毒力因子產(chǎn)生、對(duì)抗生素和氧化應(yīng)激的反應(yīng)以及環(huán)境芳香族化合物的分解代謝等。MarR作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，既可以抑制也可以激活下游基因的表達(dá)。在特定的信號(hào)或者配體分子存在的情況下，MarR蛋白與DNA的結(jié)合被改變，從而控制不同基因的表達(dá)[10]。

野油菜黃單胞菌 (pv.，) 是一種桿狀、極生單鞭毛、營(yíng)化能異養(yǎng)型革蘭氏陰性細(xì)菌，是十字花科植物的主要病原菌，也是植物病理學(xué)研究領(lǐng)域的主要模式生物。它能夠侵染模式植物擬南芥以及包括甘藍(lán)、白菜、花椰菜、芥菜、蘿卜、油菜等多種重要十字花科作物并引起黑腐病，每年造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[11-12]。目前，已有3個(gè)菌株完成了全基因組序列測(cè)定，它們的全基因組大小約5.1 Mb，編碼4 000余個(gè)基因[13-14]。功能基因組學(xué)分析結(jié)合遺傳學(xué)證據(jù)發(fā)現(xiàn)，中至少有100個(gè)基因參與了細(xì)菌的致病過(guò)程，涉及胞外多糖合成、胞外酶合成、各類分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白、鐵鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞解毒途徑、纖毛和菌毛組裝以及芳香族氨基酸等大分子合成等多種生理生化途徑，并受到精細(xì)、靈活及嚴(yán)格的轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控[15-16]。

已有研究表明，MarR家族轉(zhuǎn)錄因子HpaR (XC2827) 的失活會(huì)顯著降低細(xì)菌對(duì)于寄主甘藍(lán)的致病力和非寄主辣椒的超敏反應(yīng)，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致胞外蛋白酶的過(guò)量表達(dá)[17]。此外，HpaR能作為轉(zhuǎn)錄激活子或抑制子直接調(diào)控約448個(gè)下游基因的表達(dá)，涉及細(xì)菌毒力及相關(guān)的多種生理生化過(guò)程[18]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，8004基因組共編碼9個(gè)MarR家族轉(zhuǎn)錄因子，其中基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子能與HpaR相互作用，并協(xié)同調(diào)控下游致病相關(guān)基因的表達(dá)，最終調(diào)控細(xì)菌毒力及胞外蛋白酶合成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

大腸桿菌DH5α、BL21 (DE3)購(gòu)自Invitrogen 公司，TB1 購(gòu)自BioLabs 公司。野油菜黃單胞菌 (pv.8004，) 為中國(guó)科學(xué)院微生物研究所植物基因組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 質(zhì)粒載體

克隆載體 pGEM-T Easy 購(gòu)自Promega 公司。敲除載體pK18mob和pK18mobSacB，廣寄主互補(bǔ)載體pHMI、pHMII均為中國(guó)科學(xué)院微生物研究所植物基因組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。表達(dá)載體pET30a購(gòu)自Novagen 公司。pMAL-p2X購(gòu)自BioLabs 公司。實(shí)驗(yàn)中所用引物見(jiàn)表1。

1.1.3 常用分子生物學(xué)試劑

各種DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa和Promega公司。各種酶購(gòu)自Qiagen公司。其他常用分子生物學(xué)及生化試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 分子生物學(xué)基本操作

PCR 擴(kuò)增、酶切、連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞等常規(guī)分子生物學(xué)基本操作均按Molecular Cloning[19]進(jìn)行。

1.2.2 細(xì)菌的培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基 (蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L) 用于培養(yǎng)大腸桿菌，培養(yǎng)溫度為37 ℃；NYG培養(yǎng)基 (蛋白胨5 g/L，酵母提取物3 g/L，甘油20 g/L) 用于培養(yǎng)野油菜黃單胞菌 (pv.8004，)，培養(yǎng)溫度為28 ℃；在特定的誘導(dǎo)條件下需要用到MMX培養(yǎng)基 (葡萄糖5g/L，(NH4)2SO42g/L，檸檬酸三鈉1g/L, K2HPO44g/L，KH2PO45g/L，MgSO40.2g/L) 以及XVM2培養(yǎng)基 (NaCl 1.2 g/L，(NH4)2SO41.32 g/L，MgSO41.23 g/L，CaCl20.11 g/L，K2HPO40.022 g/L, KH2PO40.073 g/L，F(xiàn)eSO40.003 g/L，果糖1.8 g/L，蔗糖3.43 g/L)。抗生素的配制濃度為利福平 (Rifampicin，25 μg/mL)，卡那霉素 (Kanamycin，50 μg/mL) 和壯觀霉素(Spectinomycin，150 μg/mL)。

1.2.3 讀框內(nèi)刪除突變體以及雙突菌株的構(gòu)建

按照內(nèi)刪除引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物，具體引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。分別擴(kuò)增兩條片段，酶切連接到pK18mobSacB質(zhì)粒上，測(cè)序酶切正確后，電擊到野油菜黃單胞菌野生型感受態(tài)中，進(jìn)行二次交換后，通過(guò)擴(kuò)增片段大小判斷菌株是否正確。

雙突菌株的構(gòu)建即用成功構(gòu)建的單突變體菌株制備感受態(tài)，將pK18mobSacB上構(gòu)建的另一基因重組載體轉(zhuǎn)化到單突變體感受態(tài)中，進(jìn)行二次交換，并篩選出正確的雙突變體菌株。

表1 本研究中所用到的引物

1.2.4 植物致病力、胞外酶表型分析

野油菜黃單胞菌8004對(duì)于寄主 (cv. Jingfeng 1) 的致病力通過(guò)剪葉法來(lái)進(jìn)行觀測(cè)[20]。

胞外酶檢測(cè)：將菌液搖至600=0.4，取1.5 μL于含有0.1%可溶性淀粉的NYG平板上，置于28 ℃。培養(yǎng)48 h后用1︰100 I2/KI (0.08 mol/L I2，3.2 mol/L KI) 溶液染色15 min。用清水將染色液洗凈后觀察淀粉酶產(chǎn)生的透明圈即可，每個(gè)實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)。

1.2.5 總RNA制備、RT-PCR以及qRT-PCR

總RNA的制備：將菌液培養(yǎng)過(guò)夜至600= 0.4后，用XVM2培養(yǎng)基洗菌2次，用XVM2培養(yǎng)基誘導(dǎo)10 min，之后采用Trizol方法提取RNA。

RT-PCR：用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Promega, catalog # A3500) 反轉(zhuǎn)錄 RNA 為單鏈 cDNA。

qRT-PCR：反轉(zhuǎn)后的cDNA作為模板，參考上海翊圣生物科技有限公司HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix 說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系。

1.2.6 GUS轉(zhuǎn)錄融合構(gòu)建及酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)

構(gòu)建GUS轉(zhuǎn)錄融合突變體：以8004的DNA作為模板，擴(kuò)增基因起始密碼子ATG上游除去SD (Shine-Dalgarno) 序列的200 bp基因啟動(dòng)子，然后通過(guò)酶切，將其與基因、pHMⅡ載體連接，得到的重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化至野生型或突變體菌株感受態(tài)細(xì)胞中，提質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證正確即為正確菌株。

GUS酶活測(cè)定：過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)菌將其搖到600為0.4，用XVM2培養(yǎng)基洗菌2次后，在XVM2環(huán)境中誘導(dǎo)10 min，取2 mL菌液于1.5 mL進(jìn)口EP管中，離心收菌放入液氮中，保存于–80 ℃。在每管中加入300 μL PBS，重懸菌體后加入終濃度為1 mmol/L的苯甲基磺酰氟 (PMSF)，進(jìn)行非接觸式超聲，開(kāi)關(guān)各30 s，共超聲15個(gè)循環(huán)，高速離心取上清為蛋白樣品。用Coomassie Brilliant Blue G-250 Protein Assay (Bio-Rad) 試劑進(jìn)行蛋白定量，根據(jù)實(shí)際情況稀釋蛋白樣品。取稀釋好的蛋白10 μL，加入到96孔板中，迅速加入反應(yīng)液 (1 mmol/L 4-甲基傘形酮- β-D-葡萄糖苷與PBS的混合液)，加入時(shí)即開(kāi)始計(jì)時(shí)，37 ℃培養(yǎng)5 min、10 min、15 min，時(shí)間到時(shí)立即加入200 μL的0.4 mol/L Na2CO3至60 μL的反應(yīng)液中終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀 (激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm，吸收波長(zhǎng)為460 nm) 測(cè)定熒光值，用不同濃度的4-MUG 的反應(yīng)產(chǎn)物4-甲基傘形酮 (4-MU) 作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中GUS的酶活性[21]。

1.2.7 蛋白的原核表達(dá)及純化

擴(kuò)增目的片段、連接轉(zhuǎn)化到pGEM T-easy載體，測(cè)序正確后，酶切連接pET30a載體，挑取正確的質(zhì)粒電擊到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，提質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，正確的菌株即為構(gòu)建好的帶有His6標(biāo)簽的融合蛋白表達(dá)菌株。

蛋白的表達(dá)：構(gòu)建好的菌株搖培到600為0.6左右加入終濃度0.3 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)，16 ℃過(guò)夜誘導(dǎo)，收集的菌體按 3 mL/g的比例加入含20 mmol/L咪唑的1×Ni-NTA結(jié)合緩沖液中重懸。冰上超聲處理至菌體透光后，4 ℃收集上清，即可溶性蛋白提取物。按5?10 mg/mL融合蛋白Ni-NTA His·Bind (Novagen) 樹(shù)脂的量加入樹(shù)脂懸液至手動(dòng)裝好的層析柱中，將離心后的上清加入到平衡好的樹(shù)脂中，4 ℃結(jié)合2?3 h。加入含45 mmol/L咪唑的4 mL 1×Ni-NTA 漂洗緩沖液洗滌樹(shù)脂4次以洗去雜蛋白，最后用含250 mmol/L咪唑的1×Ni-NTA洗脫緩沖液洗脫特異性吸附于樹(shù)脂上的帶有His6標(biāo)簽的融合蛋白，收集此樣品，進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色驗(yàn)證。

1.2.8 Western blotting

半干轉(zhuǎn)膜：SDS-PAGE中分離完畢后，在半干轉(zhuǎn)膜儀 (Trans-Blot?SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell) 進(jìn)行半干轉(zhuǎn)膜，小心取出膜用于Western blotting。

Western blotting：用TBST (10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0，0.1% Tween) 加5% 脫脂奶粉作為封閉液，將轉(zhuǎn)膜后的 PVDF放入其中常溫封閉 1 h，或4 ℃封閉過(guò)夜。后進(jìn)行一抗孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min，之后進(jìn)行二抗孵育1 h，再用TBST洗3次，每次10 min，根據(jù)二抗標(biāo)記物HRP，選擇用ECL底物發(fā)光壓X片顯影。

1.2.9 體外Pull-down實(shí)驗(yàn)

分別純化蛋白帶有His6標(biāo)簽的HpaR和帶有MBP標(biāo)簽的XC0449蛋白，分別將兩個(gè)蛋白和混合蛋白加入到Co-IP緩沖液中(50 mmol/L Tris- HCl，pH 7.5，50 mmol/L NaCl，0.2% Triton X-100，1 mmol/L EDTA，pH 8，10% glycerol) 和50 μL能特異性吸附MBP標(biāo)簽的磁珠中，混合為終濃度為10 mmol/L的1 mL混合物，4 ℃過(guò)夜結(jié)合。15 min后離心取上清，將上清和過(guò)夜結(jié)合的磁珠以及MBP抗體4 ℃結(jié)合1 h以上。棄上清，用 PBS 洗脫2次，再用含1% Triton和1 mmol/L EDTA的PBS洗2次后，加入1×SDS上樣緩沖液煮8 min后，取上清為Elute的樣品。將每一步洗脫的上清加入1×SDS上樣緩沖液后煮，和Elute一起點(diǎn)樣進(jìn)行Western blotting分析。

1.2.10 凝膠遷移阻滯試驗(yàn) (EMSA)

以基因啟動(dòng)子區(qū)為靶標(biāo)設(shè)計(jì)引物，以野油菜黃單胞菌8004基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收得到目的片段。在40 μL體系中，加入1 pmol的探針，4 μL T4多聚核苷酸激酶 (PNK) 緩沖液以及1 μL PNK 酶，其余部分用水補(bǔ)齊后，37 ℃標(biāo)記1 h。將純化蛋白、10×EMSA結(jié)合緩沖液 (100 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5, 500 mmol/L KCl，10 mmol/L DTT)以及適量的非競(jìng)爭(zhēng)DNA探針混合在一起，混勻后室溫反應(yīng)30 min。加入300 fmol標(biāo)記好的探針至20 μL的反應(yīng)體系中，室溫反應(yīng)30 min。上樣于5%的EMSA非變形PAGE膠，電泳緩沖液為0.5×TBE，100 V預(yù)電泳30 min后上樣，120 V電泳1 h左右。將膠塊置于濾紙上，放入到透明袋中，置于磷屏上，壓3 h左右后掃描檢測(cè)。

1.2.11 微量熱涌動(dòng)實(shí)驗(yàn) (MST)

按照Monolith NTTMProtein Labeling Kit RED-NHS (Cat Nr: L001) 試劑盒的方法標(biāo)記純化的蛋白。用MST緩沖液 (50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2，0.05% Tween-20) 成倍稀釋標(biāo)記好的蛋白，使熒光值在800–1 200之間。準(zhǔn)備16個(gè)離心管，第2?16管每個(gè)管子中加入10 μL MST 緩沖液，每次需要換槍頭取小分子或者是受體蛋白等配體10 μL加入到第一個(gè)管子中，再取10 μL到第2個(gè)管子中，輕輕吸打混勻后梯度稀釋，直到最后一個(gè)管子中吸打混勻后，吸出10 μL棄之。在每個(gè)管子中加入10 μL稀釋好的標(biāo)記蛋白，每次需要更換槍頭。將每個(gè)管子中的溶液混勻，避免產(chǎn)生氣泡后，用毛細(xì)管吸取液體，上機(jī)測(cè)量Monolith NT. Label Free (Nano Temper Technologies GMBH, Germany)，LED power 根據(jù)蛋白的熒光值調(diào)整，MST power為80%。掃描結(jié)束后，用Nano Temper Analysis Software對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，導(dǎo)出數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 野油菜黃單胞菌Xcc 8004編碼9個(gè)MarR家族轉(zhuǎn)錄因子

為確定野油菜黃單胞菌8004基因組中含MarR家族蛋白的數(shù)目，利用HMMER2算法[6]和8004蛋白組序列信息搜索Pfam數(shù)據(jù)庫(kù) (E-value≤1.0)。在結(jié)果中共搜索得到9個(gè)編碼MarR家族的蛋白 (XC0273、XC0363、XC0449、XC0601、XC1457、XC2827 (HpaR)、XC2840、XC3419和XC4254)，這些蛋白都包含典型的MarR家族的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其E值在9.10E-06 至8E-20之間，推測(cè)均能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能。使用ClustalX軟件對(duì)這9個(gè)MarR家族轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行聚類分析，根據(jù)MEGA7.0中的最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖1所示。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果表明，XC2827 (HpaR) 與XC2840聚在一個(gè)分支上，而XC0449與XC0601聚在一個(gè)分支上。

2.2 MarR家族轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)與純化

利用大腸桿菌BL21 (DE3) 菌株和pET30a載體系統(tǒng)表達(dá)并純化了MarR家族轉(zhuǎn)錄因子。重組蛋白在開(kāi)放讀碼框 (Open-reading-rame，ORF) C端帶上His6標(biāo)簽，16 ℃、1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，Western blotting檢測(cè)其表達(dá)結(jié)果。用Ni-NTA His-Bind樹(shù)脂親和層析，從表達(dá)菌株的粗提液中純化上述重組蛋白，用含40 mmol/L咪唑的磷酸緩沖液沖洗雜蛋白，含250 mmol/L咪唑的磷酸緩沖液收集洗脫液，10 kDa濃縮柱濃縮并置換至蛋白保存液中。如圖2所示，除HpaR蛋白[18]以外，同時(shí)還純化得到純度在95%以上的MarR家族轉(zhuǎn)錄因子X(jué)C0449，其理論大小分別是19.7 kDa (XC0449-His6)和20.0 kDa (HpaR-His6)。

圖1 野油菜黃單胞菌中MarR家族轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng) 發(fā)育樹(shù)分析

2.3 在體外XC0449與HpaR特異性結(jié)合

實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，系統(tǒng)敲除MarR家族轉(zhuǎn)錄因子后，除HpaR[18]以外，突變體同樣導(dǎo)致細(xì)菌致病力顯著下降。既然HpaR和XC0449都參與到細(xì)菌致病途徑中，那么作為轉(zhuǎn)錄因子，它們可能通過(guò)相互作用調(diào)控同一個(gè)致病相關(guān)基因，并在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生協(xié)同或拮抗效應(yīng)。鑒于以上推測(cè)，我們首先設(shè)計(jì)了檢測(cè)HpaR和XC0449互作的體外實(shí)驗(yàn)。如圖3A所示，微量熱泳動(dòng) (Microscale thermophoresis，MST) 實(shí)驗(yàn)表明，體外XC0449蛋白與HpaR能發(fā)生中等強(qiáng)度的特異性結(jié)合，其解離常數(shù) (d) 為 (1.03±0.3) μmol/L，而與其他的MarR家族轉(zhuǎn)錄因子在體外并不結(jié)合 (圖3B)。推測(cè)XC0449蛋白可能在體內(nèi)對(duì)HpaR的轉(zhuǎn)錄活性有特異性的影響。進(jìn)一步表達(dá)并純化N端帶有MBP標(biāo)簽的0449融合蛋白，進(jìn)行體外驗(yàn)證蛋白-蛋白互作的Pull-down實(shí)驗(yàn)。分別將純化的HpaR-his6蛋白、MBP-XC0449蛋白以及能特異性吸附MBP標(biāo)簽的磁珠三者混合并在低溫下孵育過(guò)夜，通過(guò)蛋白-蛋白相互作用獲得結(jié)合在磁珠上的蛋白復(fù)合體，中等離子強(qiáng)度的緩沖液清洗后，SDS上樣緩沖液裂解蛋白復(fù)合體，用鼠源His6單克隆抗體，Western blotting檢測(cè)復(fù)合體中HpaR-his6蛋白的存在。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣表明，在體外XC0449能與HpaR相互作用 (圖3C)。

圖2 MarR家族轉(zhuǎn)錄因子的純化蛋白XC0449和HpaR

圖3 微量熱泳動(dòng)實(shí)驗(yàn) (MST) 和體外Pull-down實(shí)驗(yàn)證明XC0449和HpaR之間存在相互作用

2.4 XC0449調(diào)控Xcc致病力

為進(jìn)一步探究基因功能以及與可能存在的遺傳上下位關(guān)系，構(gòu)建了基因讀碼框刪除突變體以及與基因雙突變體并進(jìn)行致病力等表型分析。結(jié)果如圖4A所示，單突變體能顯著降低對(duì)寄主甘藍(lán)的致病性，其致病水平下降至野生型的50%左右，而與雙突變體致病表型則與單突變體相似，幾乎完全喪失。這一結(jié)果提示在遺傳上，位于基因的上游或處于另外一條致病力調(diào)控的途徑上。胞外蛋白酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與雙突變體表型與單突變體相似，與野生型相比，胞外蛋白酶活性均顯著上升，而單突變體則無(wú)明顯變化，表明不參與調(diào)控蛋白酶(圖4B)。

圖4 hpaR與XC0449表型分析

2.5 XC0449協(xié)同HpaR調(diào)控下游基因的表達(dá)

既然HpaR和XC0449在體外能相互作用，并都參與到細(xì)菌致病過(guò)程中，那它們是否可能共同調(diào)控同一個(gè)致病相關(guān)基因？結(jié)合與單突和雙突的表型結(jié)果以及實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的調(diào)控元的ChIP-seq組學(xué)數(shù)據(jù)，初步確定編碼多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶的作為下游靶基因做后續(xù)驗(yàn)證。如圖5A所示，凝膠遷移實(shí)驗(yàn) (Electrophoretic mobility shift assay，EMSA) 表明，體外XC0449和HpaR蛋白均能直接結(jié)合基因的啟動(dòng)子區(qū)。進(jìn)一步分析XC0449和HpaR與啟動(dòng)子結(jié)合后的競(jìng)爭(zhēng)條帶發(fā)現(xiàn)，在加入100×未標(biāo)記的PXC0705探針后，與HpaR結(jié)合的標(biāo)記探針條帶強(qiáng)度明顯減弱，而與XC0449結(jié)合的標(biāo)記探針條帶則沒(méi)發(fā)生明顯變化，說(shuō)明HpaR競(jìng)爭(zhēng)啟動(dòng)子的能力要強(qiáng)于XC0449。在加入1 000×未標(biāo)記的PXC0705探針后，與XC0449結(jié)合的標(biāo)記條帶才發(fā)生強(qiáng)度明顯減弱且位置下移，也說(shuō)明XC0449與PXC0705的結(jié)合能力更強(qiáng)。

圖5 EMSA、qPCR及GUS檢測(cè)HpaR和XC0449對(duì)于XC0705的直接調(diào)控

結(jié)合遺傳上位分析的結(jié)果，推測(cè)體內(nèi)在轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)相互作用調(diào)控同一下游基因的過(guò)程中，HpaR起著主要作用，而XC0449則協(xié)同調(diào)控HpaR發(fā)揮功能。如圖5B所示的qPCR結(jié)果表明，在三型分泌系統(tǒng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基XVM2中誘導(dǎo)10 min后，和野生型相比，在和單突變體中，的表達(dá)量均顯著下降，分別降至野生型中表達(dá)量的78%和58%，且雙突變體中表達(dá)量下降最為嚴(yán)重，降至野生型的37%，說(shuō)明XC0449和HpaR均能正調(diào)控的表達(dá)，且兩者能協(xié)同作用使得對(duì)下游基因的調(diào)控具有疊加效應(yīng)。我們進(jìn)一步構(gòu)建了的GUS轉(zhuǎn)錄融合突變體，在XVM2培養(yǎng)基或MMX基本培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生長(zhǎng)10 min后，單突變體中的GUS酶活均顯著降低，單突變體在XVM2中有顯著降低，在MMX中無(wú)顯著變化，但和雙突變體表現(xiàn)則與qPCR類似，即協(xié)同調(diào)控使得下游基因的表達(dá)出現(xiàn)了疊加效應(yīng)。

3 討論

MarR家族轉(zhuǎn)錄因子早在古生菌和細(xì)菌分化之前就已出現(xiàn)，并且在這些物種中普遍存在。在Ensembl (http://asia.ensembl.org/index.html) 中MarR家族轉(zhuǎn)錄因子已在超過(guò)44 000種細(xì)菌和古生菌中收錄了超過(guò)335 000條注釋，平均每個(gè)基因組大約有7個(gè)MarR家族轉(zhuǎn)錄因子。且物種的基因組越大，生活方式越復(fù)雜，包含的MarR家族轉(zhuǎn)錄因子一般就越多[5]。這說(shuō)明MarR家族轉(zhuǎn)錄因子在微生物進(jìn)化過(guò)程中，在響應(yīng)環(huán)境變化并維持自身生存方面發(fā)揮著重要作用。本研究生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，8004基因組一共編碼9個(gè)MarR家族轉(zhuǎn)錄因子，提示在植物病原細(xì)菌致病過(guò)程中面臨的復(fù)雜環(huán)境及其可能的依賴于MarR家族轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)對(duì)策略。MarR家族轉(zhuǎn)錄因子作為感應(yīng)各種環(huán)境變化的傳感器，可以調(diào)控多種細(xì)胞過(guò)程，包括毒力、抗生素、抗脅迫反應(yīng)、活性氧反應(yīng)以及有害化合物的降解等等[22-28]。如弗氏志賀菌中MarR家族轉(zhuǎn)錄因子SlyA在酸脅迫環(huán)境下通過(guò)激活下游谷氨酸脫酸系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)，最終維持細(xì)菌的生存[29]。當(dāng)前，MarR家族轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)研究的熱點(diǎn)在于MarR蛋白與環(huán)境刺激相關(guān)的小分子配體的結(jié)合影響其與DNA雙鏈的結(jié)合并改變其結(jié)構(gòu)及活性，從而導(dǎo)致下游基因的表達(dá)量的適應(yīng)性變化[30]。

除了小分子，MarR家族轉(zhuǎn)錄因子還有可能與哪些生物大分子結(jié)合并影響其生化活性？已有研究表明，MarR家族轉(zhuǎn)錄因子HpaR (XC2827) 在植物病原細(xì)菌8004侵染寄主甘藍(lán)并致病的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。本研究系統(tǒng)性分析了8004基因組中編碼的9個(gè)MarR家族轉(zhuǎn)錄因子，并利用親和層析純化了其中的XC0449和HpaR (XC2827)[18]。體外MST和Pull-down實(shí)驗(yàn)均表明，基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子能與HpaR相互作用，并協(xié)同調(diào)控下游致病相關(guān)基因的表達(dá)。

在體外驗(yàn)證XC0449蛋白能結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)的EMSA實(shí)驗(yàn)中，在加入1 000×未標(biāo)記的PXC0705探針后與XC0449結(jié)合的標(biāo)記條帶發(fā)生位置下移，而非探針位移條帶的曝光量減小或游離的標(biāo)記探針條帶。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，EMSA膠中出現(xiàn)多個(gè)條帶或者條帶位置的變化，是由于蛋白與探針結(jié)合過(guò)程中，往往會(huì)形成單聚體、二聚體甚至多聚體的形式，因而能在非變形膠上處于不同位置[33]。對(duì)此，推測(cè)加入1 000×競(jìng)爭(zhēng)性探針后蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，由高聚體解聚成低聚體，因而在變性膠中電泳時(shí)泳動(dòng)速度更快，顯示為條帶位置的下降。

編碼多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶(Endopolygalacturonase)，在植物病原真菌及細(xì)菌中的主要功能是在病原菌侵染寄主過(guò)程中通過(guò)分泌到胞外、降解植物細(xì)胞壁從而保證細(xì)菌的成功入侵，因而是細(xì)菌重要的毒力因子[31-32]。本實(shí)驗(yàn)室的系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)了直接調(diào)控表達(dá)的兩個(gè)MarR家族轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)菌致病過(guò)程中能協(xié)同激活的表達(dá)，最終調(diào)控細(xì)菌毒力及胞外蛋白酶合成，從而形成完整的調(diào)控通路。

本研究的結(jié)果為今后研究和了解MarR家族轉(zhuǎn)錄因子打下了基礎(chǔ)，同時(shí)也為研究其他重要調(diào)控基因的相互作用提供了方法和思路。

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MarR family transcription regulator HpaR and XC0449 coordinately regulate the virulence ofpv.

Yajun Li1,2, Aining Li1, Fanfan Meng2, Hongyu Zhang2, Wei Qian2, Wei He1, and Chaoying Deng2

1 The College of Forestry, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China 2 State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101,China

MarR family transcription regulators are ubiquitous among bacteria and archaea. They extensively control multiple cellular processes and elaborately regulate the expression of genes involved in virulence, stress response and antibiotics at translational level. Inpv., insertional inactivation of MarR family transcription regulator HpaR (XC2827) resulted in significantly decrease in virulence and increase in the production of the extracellular proteases. Here, we reported that the genome of8004 encodes nine MarR family transcription regulators. The MarR family transcription regulators, HpaR (XC2827) and XC0449, were heterologous expressed and purified.MST and Pull-down assay confirmed the physical interaction between HpaR and XC0449. Phenotypical assay determined that deletion ofresulted in substantial virulence attenuation.EMSA,qRT-PCR and GUS activity assay identified that HpaR and XC0449 coordinately act as the transcriptional activator to regulate the expression of the virulence-associated gene, and eventually control the bacterial virulence and the production of extracellular proteases.

transcription regulation, MarR family transcriptional factor,pv., virulence

January 31, 2019;

February 28, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31600062, 31400545, 31370127).

Chaoying Deng. Tel: +86-10-64806152; E-mail: dengcy@im.ac.cn

Wei He. Tel: +86-10-62338127; E-mail: hewei@bjfu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos. 31600062，31400545，31370127) 資助。

李雅君, 李愛(ài)寧, 孟繁凡, 等. MarR家族轉(zhuǎn)錄因子HpaR和XC0449協(xié)同調(diào)控野油菜黃單胞菌致病性. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(8): 1500–1510.Li YJ, Li AN, Meng FF, et al. MarR family transcription regulator HpaR and XC0449 coordinately regulate the virulence of Xanthomonas campestris pv. campestris. Chin J Biotech, 2019, 35(8): 1500–1510.

(本文責(zé)編 陳宏宇)