抑制AKT通路對?？颂婺崮退幍姆切〖?xì)胞肺癌細(xì)胞遷移能力的影響

楊旸，王一喆，鄭春雷，侯科佐，王曉楠，胡雪君

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.呼吸疾病研究所老年病呼吸感染科；2.腫瘤內(nèi)科，遼寧省抗腫瘤藥物與生物治療重點實驗室，沈陽 110001）

研究［1-2］顯示，肺癌是對人類健康威脅較大的惡性腫瘤之一，80%～85%的肺癌為非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）；NSCLC發(fā) 病 率及死亡率逐年攀升。NSCLC發(fā)現(xiàn)時往往已為晚期，失去了手術(shù)治療機(jī)會，靶向治療已成為晚期NSCLC治療的主要方法之一。以吉非替尼和厄洛替尼為代表的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）—酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKI）已成為EGFR突變型晚期NSCLC的一線治療藥物。EGFR-TKI類藥物明顯提高EGFR突變的NSCLC患者的生存率，但耐藥問題是阻礙患者療效的最大障礙［3］。肺癌的首要死因是腫瘤細(xì)胞侵襲周圍組織和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［4］，近年來的研究［5］表明，NSCLC發(fā)生EGFR-TKI耐藥后更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

既往研究［6］表明接受TKI治療的細(xì)胞耐藥后往往更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，耐藥細(xì)胞遷移能力增強與其上皮細(xì)胞間質(zhì)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）表型獲得相關(guān)，近期研究［7］表明耐藥細(xì)胞干性表型的增強促進(jìn)其轉(zhuǎn)移及侵襲，但TKI耐藥細(xì)胞的轉(zhuǎn)移機(jī)制目前尚不十分明確。已有研究［8］表明AKT信號通路活化在介導(dǎo)EGFR激酶抑制劑耐藥性方面起關(guān)鍵作用，但其是否促進(jìn)TKI耐藥細(xì)胞轉(zhuǎn)移并不十分清楚。?？颂婺崾俏覈谝粋€擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的EGFR-TKI，在晚期NLCLC治療領(lǐng)域發(fā)揮良好抗腫瘤作用，目前對于埃克替尼耐藥機(jī)制尚不十分清楚，2017年有研究［9］表明人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）水平降低可能與NSCLC細(xì)胞對?？颂婺崦舾行越档拖嚓P(guān)，另有研究［10］表明卡斯塔斯B細(xì)胞淋巴瘤譜系B-b（casitas B cell lymphoma-b，CBL-b）低表達(dá)介導(dǎo)EGFR突變的NSCLC?？颂婺崮退帯１狙芯刻接懸种艫KT通路對?？颂婺崮退幍腘SCLC細(xì)胞遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI1640 培養(yǎng)基（美國Gibco公司），EGFR、p-EGFR、AKT、p-AKT（美國Cell Signaling Technology公司），β-actin抗體（美國Santa Cruz公司），LY294002（美國Cell Signaling Technology公司），?？颂婺幔ㄕ憬愡_(dá)藥業(yè)公司贈予，藥物粉末于DEMSO中溶解，貯存濃度為10 mmol/L，-20 ℃保存）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C9購自中科院上海細(xì)胞庫，PC9細(xì)胞株于5%CO2、37 ℃恒溫箱內(nèi)，在含10%胎牛血清（以色列Biological Industries公司）、1%青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。所有實驗均采用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3 耐藥系建立

PC9細(xì)胞持續(xù)暴露于初始濃度為0.05 μmoL/L的?？颂婺崛芤褐?，并逐漸增加藥物濃度，直到藥物濃度達(dá)到10 μmoL/L。穩(wěn)定存活于?？颂婺崛芤海?0 μmoL/L）中的細(xì)胞即為耐藥細(xì)胞（PC9/IcoR）。耐藥細(xì)胞培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清（以色列Biological Industries公司）及1%青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，2～3 d傳代1次。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力

取對數(shù)生長期的PC9或PC9/IcoR細(xì)胞胰酶消化，以3 000/孔接種于96孔板，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的?？颂婺幔?.1、1、10、20 μmoL/L），每種藥物濃度設(shè)置4個復(fù)孔，另設(shè)4個溶劑復(fù)孔作為對照，培養(yǎng)72 h后每孔加入20 μL MTT（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄上清，每孔加入200 μL二甲基亞砜，震蕩15 min。酶標(biāo)儀檢測570 nm波長的吸光度值，計算抑制率。

1.5 Transwell法檢測細(xì)胞遷移能力

采用6.5 mm直徑、10 μm厚度、8 μm孔徑的聚碳酸酯多孔濾膜（24孔板Transwell小室）。將PC9或PC9/IcoR細(xì)胞（3.0×104個）懸浮于無血清RPMI1640培養(yǎng)液（200 μL）中，并種植在小室的上層。下室加入含2.5%血清RPMI1640培養(yǎng)液（500 μL）。埃克替尼、LY294002以及?？颂婺崤cLY294002聯(lián)用的耐藥細(xì)胞藥物預(yù)處理4 h，分別于上室及下室加入相應(yīng)濃度的藥物。小室于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后，清洗并風(fēng)干，小室膜用瑞士吉姆薩染色法染色固定1 h。清洗晾干后顯微鏡下觀察照相，每個小室隨機(jī)選取3個視野計數(shù)，實驗至少重復(fù)3次。

1.6 Western blotting檢測蛋白表達(dá)

將細(xì)胞冰上裂解，超聲離心后取上清，BCA法測定蛋白濃度，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。5% 脫脂牛奶封閉1 h后分別加入稀釋好的1抗4 ℃環(huán)境過夜，1×PBS洗滌4次，加入二抗封閉40 min，1×PBS洗滌4次后ECL發(fā)光試劑盒顯色，凝膠成像系統(tǒng)照相，分析灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所得數(shù)據(jù)均為3次獨立實驗結(jié)果，采用±s表示。2組之間比較采用t檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 埃克替尼對PC9和PC9/IcoR細(xì)胞增殖能力影響

結(jié)果顯示，不同濃度（0、0.1、1、10、20 μmol/L）埃克替尼作用于PC9細(xì)胞 72 h，PC9細(xì)胞增殖抑制率分別為0、（15.02±3.14）%、（48.13±1.41）%、（64.89±0.96）%、（78.02±2.68）%；與對照組（0 μmol/L?？颂婺幔┍容^，PC9細(xì)胞增殖明顯抑制（P＜ 0.05），其增殖抑制率隨濃度增加而升高。不同濃度（0、0.1、1、10、20 μmol/L）?？颂婺嶙饔糜赑C9/IcoR 細(xì)胞72 h，PC9/IcoR細(xì)胞增殖抑制率分別為0、（2.96±0.32）%、（6.08±1.25）%、（9.19±0.83）%、（28.03±9.51）%；PC9/IcoR細(xì)胞增殖在不同濃度?？颂婺崴幬镒饔孟戮词艿矫黠@影響（P＞ 0.05），提示PC9/IcoR細(xì)胞對?？颂婺岬拿舾行越档?。

2.2 PC9和PC9/IcoR細(xì)胞遷移能力比較

結(jié)果顯示，穿過聚碳酸酯多孔濾膜的PC9細(xì)胞、PC9/IcoR細(xì)胞數(shù)量分別為132.67±14.57、234.33±22.28，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。與PC9細(xì)胞比較，耐藥細(xì)胞PC9/IcoR的遷移能力明顯增強。見圖1。

圖1 PC9細(xì)胞和PC9/IcoR細(xì)胞遷移能力的比較 瑞氏吉姆薩法×200Fig.1 Comparison of the migration ability between PC9 cells and PC9/IcoR cell Giemsa staining×200

2.3 PC9和PC9/IcoR細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，與PC9細(xì)胞比較，耐藥細(xì)胞PC9/IcoR中EGFR和AKT的磷酸化水平均明顯升高，提示AKT通路活化可能使耐藥細(xì)胞遷移能力增強（圖2）。

圖2 PC9細(xì)胞和PC9/IcoR細(xì)胞的蛋白表達(dá)Fig.2 Protein expression of PC9 cells and PC9/IcoR cells

2.4 LY294002對PC9/IcoR細(xì)胞AKT通路的影響

AKT通路抑制劑LY294002（20 μmol/L）作用于PC9/IcoR細(xì)胞24 h后，AKT磷酸化水平明顯降低；LY294002與?？颂婺幔?0 μmol/L）聯(lián)合作用24 h后，AKT通路抑制最明顯（圖3）。提示20 μmol/L LY294002可顯著抑制PC9/IcoR細(xì)胞的AKT活化。

圖3 抑制AKT對PC9/IcoR細(xì)胞蛋白表達(dá)影響Fig.3 Protein expression of PC9/IcoR cells after inhibiting AKT

2.5 抑制AKT通路對PC9/IcoR細(xì)胞遷移能力的影響

為探討AKT活化在PC9/IcoR轉(zhuǎn)移中的作用，AKT通路抑制劑LY294002（20 μmol/L）單獨或與?？颂婺幔?0 μmol/L）聯(lián)合作用PC9/IcoR細(xì)胞24 h后，Transwell法檢測細(xì)胞遷移能力。結(jié)果顯示，對照組（單純PC9/IcoR細(xì)胞）、?？颂婺峤M（?？颂婺?PC9/IcoR細(xì) 胞）、LY294002組（LY294002+PC9/IcoR細(xì)胞）、?？颂婺? LY294002組（?？颂婺?LY294002+PC9/IcoR細(xì)胞）細(xì)胞遷移數(shù)量分別為234.05±22.61、200.33±20.08、90.45±18.88、19.67±6.42。與對照組比較，?？颂婺峤M對細(xì)胞遷移能力沒有明顯影響（P＞0.05）；LY294002組可明顯抑制細(xì)胞遷移能力（P＜0.05）；?？颂婺? LY294002組對細(xì)胞遷移能力的抑制作用更明顯（P＜ 0.05）。提示AKT通路活化使PC9/IcoR細(xì)胞的遷移能力增強。見圖4。

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個非常復(fù)雜的過程，關(guān)于耐藥腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移機(jī)制至今知之甚少，可能與腫瘤微環(huán)境改變、細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)之間的相互作用、細(xì)胞間黏附缺失及腫瘤細(xì)胞耐藥后干性表型增強有關(guān)［11-13］。NSCLC接受EGFR-TKI治療后發(fā)生獲得性耐藥的細(xì)胞系轉(zhuǎn)移及侵襲能力均增強，而且更易獲得EMT表型［14］。本研究結(jié)果顯示，與PC9親本細(xì)胞比較，PC9/IcoR耐藥細(xì)胞遷移能力明顯增強，提示腫瘤細(xì)胞的侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是?？颂婺崮退幍奶卣髦?。

圖4 抑制AKT對PC9/IcoR細(xì)胞遷移能力影響 瑞氏吉姆薩法×200Fig.4 Effect of AKT inhibition on the migration ablity of PC9/IcoR cells Giemsa staining×200

PI3K/AKT通路在細(xì)胞生長、分化、增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮不可替代的作用。研究［15］表明，AKT通路活化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。已有研究［16］顯示PI3K/AKT信號通路在乳腺癌和胰腺癌等多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中均被活化。PI3K/AKT信號通路抑制劑可以抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。AKT通路在不同類型的TKI，包括EGFR-TKI的阻力中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。MET擴(kuò)增、HGF產(chǎn)生和PIK3CA突變均可以阻斷TKI類介導(dǎo)的AKT抑制，進(jìn)而產(chǎn)生EGFR-TKI耐藥。在NSCLC中，PI3K/AKT通路異?；罨荅GFR-TKI獲得性耐藥的原因之一［17］，在肝癌中PI3K/AKT通路活化介導(dǎo)索拉非尼耐藥［18］。單獨使用AKT通路抑制劑或與吉非替尼聯(lián)用已證明可以在體外和體內(nèi)克服HGF介導(dǎo)的吉非替尼耐藥［19］。本研究結(jié)果顯示，與PC9親本細(xì)胞系比較，PC9/IcoR耐藥細(xì)胞系中EGFR、AKT等蛋白活化水平明顯升高，這一現(xiàn)象與耐藥細(xì)胞系遷移能力增強變化趨勢一致，提示AKT活化可能與遷移相關(guān)。用PI3K/AKT通路抑制劑LY294002作用于PC9/IcoR耐藥細(xì)胞系后，AKT通路活性被抑制同時耐藥細(xì)胞遷移能力明顯降低，且AKT通路抑制劑LY294002聯(lián)用?？颂婺岷驪C9/IcoR細(xì)胞系遷移能力幾乎完全抑制。這些結(jié)果均說明阻斷AKT信號通路可以逆轉(zhuǎn)埃克替尼耐藥細(xì)胞的遷移。

綜上所述，AKT活化促進(jìn)PC9/IcoR耐藥細(xì)胞遷移，抑制AKT通路活性可以抑制?？颂婺崮退幍腘SCLC細(xì)胞的遷移。本研究僅從促進(jìn)耐藥細(xì)胞遷移角度闡述AKT通路的作用，并未探討AKT通路活化對PC9/IcoR耐藥細(xì)胞增殖、凋亡等方面的作用。關(guān)于AKT信號通路在埃克替尼耐藥的NSCLC中促進(jìn)遷移的具體機(jī)制、AKT通路對耐藥細(xì)胞增殖、凋亡等方面的影響以及抑制AKT通路能否逆轉(zhuǎn)?？颂婺崮退帉⒃诮窈蟮难芯恐羞M(jìn)一步論證。