口蝦蛄金屬硫蛋白提取工藝的優(yōu)化

嚴(yán)國(guó)，梅光明，顧捷，孟春英

1(浙江海洋大學(xué) 食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山，316021) 2(浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山，316021) 3(浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山，316021)

金屬硫蛋白(metallothionein, MT)是一類富含半胱氨酸(Cys)的低分子量(6 000～7 000 Da)蛋白質(zhì)，其半胱氨酸硫醇基團(tuán)對(duì)重金屬具有結(jié)合能力，能夠結(jié)合多達(dá)20個(gè)單價(jià)或7個(gè)二價(jià)重金屬離子，在金屬穩(wěn)態(tài)和重金屬毒性、DNA損傷和氧化應(yīng)激的保護(hù)中起重要作用[1-3]，由MARGOSHES等[4]在1957年首次從馬腎中發(fā)現(xiàn)并分離出來(lái)。目前已從多種生物體中分離純化得到MT，包括哺乳動(dòng)物(如人、大鼠、小鼠及家兔等)和一些細(xì)菌及真菌[5]。MT易與金屬結(jié)合還具備氧化還原能力，主要表現(xiàn)為參與生物體內(nèi)微量金屬元素的儲(chǔ)存、運(yùn)輸及代謝；對(duì)非必需重金屬也具有螯合作用；此外在調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)、清除自由基、防止組織氧化損傷、拮抗生理和生化反應(yīng)等方面也有很重要的意義，并為其他金屬蛋白和金屬酶類提供活性中心[6-10]。因此MT在功能保健食品開發(fā)中具有十分廣泛的應(yīng)用。

口蝦蛄(Oratosquillaoratoria)屬甲殼綱，是一種多年生大型底棲甲殼類無(wú)脊椎動(dòng)物，在我國(guó)及日本、菲律賓沿海均有分布，資源量較大，2014年我國(guó)口蝦蛄產(chǎn)量達(dá)29.4萬(wàn)t，是我國(guó)沿海地區(qū)深受歡迎的高值甲殼類產(chǎn)品。浙江省海洋水產(chǎn)研究所水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)機(jī)構(gòu)近年來(lái)持續(xù)的監(jiān)控工作表明口蝦蛄重金屬鎘元素污染嚴(yán)重(>GB 2762—2017[11]中的0.5 mg/kg限量規(guī)定)，超標(biāo)率達(dá)80%以上，砷、銅和鋅等元素也較多。大量研究證明，金屬元素的脅迫一般會(huì)誘導(dǎo)生物體內(nèi)MT的表達(dá)，在重金屬(Ag、Cd、Cu、Hg、Zn)等誘導(dǎo)下，生物體內(nèi)MT含量會(huì)顯著增加，且這種誘導(dǎo)與環(huán)境中金屬濃度具有一定的相關(guān)性[12]。任玉娟等[13]研究鎘對(duì)背角無(wú)齒蚌組織中MT含量的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)利用鎘脅迫可不同程度地使背角無(wú)齒蚌鰓和消化腺M(fèi)T含量升高。彭愛紅等[14]利用不同濃度和種類的鋅鹽脅迫海洋小球藻生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其體內(nèi)MT的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)采用鋅離子濃度為50 μmol/L的葡萄糖酸鋅對(duì)小球藻進(jìn)行脅迫培養(yǎng)時(shí)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的Zn-MT含量達(dá)到最高。VINCENT等[15]研究發(fā)現(xiàn)，金屬硫蛋白隨著不同劑量的Cd暴露持續(xù)增加?？谖r蛄作為鎘及其他金屬元素富集能力較強(qiáng)的典型生物，推測(cè)其將是提取MT的良好材料，且MT可能對(duì)其在重金屬富集過程中起關(guān)鍵作用。目前對(duì)其MT的研究還沒有相關(guān)的報(bào)道，本研究以口蝦蛄為原料，對(duì)口蝦蛄MT的提取工藝進(jìn)行研究，一方面為海洋生物資源的開發(fā)和利用提供新的思路，另一方面也為后續(xù)開展口蝦蛄富集鎘機(jī)理研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

口蝦蛄于浙江省舟山市豐茂菜市場(chǎng)購(gòu)買，平均體長(zhǎng)(15.5±0.5) cm，平均體重(26.2±0.4)g。

5,5’-二硫硝基苯甲酸(DTNB)，J&K Science公司；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，美國(guó)Sigma公司；兔肝MT-I、MT-II標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%)，博泰生物有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)、HCl、Na2HPO4等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；IKA EIS-D6恒溫磁力攪拌器，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司；MS 2漩渦混合器，德國(guó)IK公司；Avanti JXN-30高速冷凍型離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；AL204 型電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；UV 31型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；PB 10 型pH計(jì)，賽多斯北京儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

新鮮口蝦蛄在0～4 ℃條件下洗凈去殼，取全部組織勻漿后作為樣品。先通過單因素考察，再利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件，對(duì)提取液濃度、pH值、提取溫度和液料比等進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.1 口蝦蛄MT的提取[16]

取口蝦蛄樣品，按一定量的液料比加入Tris-HCl緩沖液攪拌提取，提取液在4 ℃下以13 000 r/min高速冷凍離心25 min后，棄除沉淀，并測(cè)定上清液中MT含量。

1.3.2 MT粗品制備

(1)收集1.3.1中提取的上清液，于80 ℃水浴加熱5 min，以去除熱不穩(wěn)定大分子蛋白，快速冷卻至室溫后再于4 ℃下離心分離(13 000 r/min，25 min，下同)；

(2)收集上清液后，加入3倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，-20 ℃過夜沉淀；

(3)取沉淀物在4 ℃下離心分離，棄上清液后加入23 mL Tris-HCl緩沖液，室溫下溶解3～5 h后，再于4 ℃下離心分離，收集上清液即為MT粗提液；

(4)冷凍干燥后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 單因素試驗(yàn)

為了研究單因素條件對(duì)MT提取效果的影響，研究液料比[(2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、10∶1(mL∶g)]、提取溫度(4、20、30、40、50、60、70、80、90 ℃)、Tris-HCl緩沖液的pH值(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)、Tris-HCl緩沖液提取液濃度(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mol/L)和提取時(shí)間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h)5個(gè)因素對(duì)口蝦蛄中MT提取含量影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

本研究在單因素試驗(yàn)的前提下，使用Design-Expert 8.06軟件中的Box-Behnken中心組合原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，研究液料比、提取液濃度、提取液pH和提取溫度4個(gè)因素對(duì)MT提取量的影響，設(shè)計(jì)L(43)試驗(yàn)，優(yōu)化提取條件。

表1 響應(yīng)面法優(yōu)化分析因素和水平表

1.3.5 DTNB法測(cè)定口蝦蛄MT含量

樣品測(cè)定和MT標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照吳云輝等[17]測(cè)定兔肝中MT含量的DTNB比色法進(jìn)行。

(1)MT標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：先配制質(zhì)量濃度為1 μg/μL的MT標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取不同體積的MT標(biāo)準(zhǔn)溶液加入4 mL離心管中，依次加入10 μL HCl(1.2 mol/L)和200 μL EDTA(0.1 mol/L)，于暗處反應(yīng)10 min脫去金屬；再加入5 mmol/L DTNB充分渦旋3 min，使MT與DTNB形成黃色絡(luò)合物，最后用Tris-HCl緩沖液(pH=7.5)稀釋至4 mL，在412 nm波長(zhǎng)下用比色法測(cè)定顯色產(chǎn)物硫代硝基苯甲酸陰離子(TNBA)的量來(lái)確定MT含量。

(2)線性回歸分析表明，MT含量在0～50 μg，回歸方程為(1)。線性關(guān)系良好，可根據(jù)此回歸方程計(jì)算樣品中MT含量。

y=0.019 7x+0.01(R2=0.998 1)

(1)

(3)實(shí)際樣品測(cè)定：取1.3.1的MT提取上清液1 mL，按1.3.5中(1)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Origin 9.1、Excel、及Design-expert.V8.0.6分析處理，試驗(yàn)結(jié)果均為3次重復(fù)性試驗(yàn)平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

Tris-HCl緩沖液性質(zhì)穩(wěn)定，與生理體液具有很好的相容性，選擇Tris-HCl緩沖溶液提取，能保持MT的穩(wěn)定[18-19]。由圖1可知，液料比在2～5時(shí)，MT提取量隨著提取液體積的增加而增大，在5～10，提取量大小趨于平緩，口蝦蛄中提取的MT含量維持在0.205 mg/g左右。說明在液料比達(dá)到5時(shí)，提取液已能將口蝦蛄中MT充分提取，綜合考慮試驗(yàn)成本，后續(xù)試驗(yàn)最佳液料比選用5進(jìn)行。

圖1 液料比對(duì)MT提取含量影響

Fig.1 Effect of material-liquid ratio on MT extraction content

圖2所示為提取液濃度對(duì)MT提取含量影響，口蝦蛄中的MT提取效果隨緩沖液濃度的增大而依次減小。其中在0.01～0.02 mol/L時(shí)變化較快，0.03～0.06 mol/L時(shí)變化相對(duì)平緩，在0.02 mol/L時(shí)呈現(xiàn)最大值0.213 mg/g。因此初步確定最佳提取液濃度為0.02 mol/L。Tris-HCl緩沖液不僅可以作為提取溶劑，還能為離體蛋白提供相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境，防止蛋白發(fā)生變性作用。黨蕊葉等[20]在進(jìn)行兔肝MT提取液的穩(wěn)定性研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，緩沖液濃度在0.01、0.02 mol/L時(shí)有利于MT的提取，與本研究的結(jié)果一致。

圖2 提取液濃度對(duì)MT提取含量影響

Fig.2 Effect of extract concentration on MT extraction content

如圖3所示，在pH 6.0～9.0中，pH對(duì)于MT的提取效果具有較大影響，MT提取量呈先增加(pH 6.0～8.0)后降低(pH 8.0～9.0)的趨勢(shì)，當(dāng)提取pH達(dá)到8.0時(shí)，MT提取效果最好，最大提取量為0.225 mg/g，因此初步確定最佳提取液pH值為8.0。水生生物MT的等電點(diǎn)(isoelectric point, pI)在pH 3.5～6.0時(shí)，如果緩沖液的pH與目標(biāo)蛋白的pI相同，蛋白質(zhì)就會(huì)因溶解度降低而聚集[21-22]。同時(shí)Tris-HCl溶液的pH對(duì)MT的穩(wěn)定性影響很大，pH過大或過小都不利于MT的穩(wěn)定，所以當(dāng)pH遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)有利于MT的提取。

圖3 提取液pH對(duì)MT提取含量影響

Fig.3 Effect of extract pH on MT extraction content

溫度對(duì)提取效果影響見圖4，提取溫度在4～50 ℃，提取效果呈遞增趨勢(shì)，隨著提取溫度的升高，溶劑的分子擴(kuò)散速度增強(qiáng)，提取率逐漸增加，并在50 ℃時(shí)得到最大提取量為0.22 4 mg/g；當(dāng)溫度大于50 ℃之后，MT提取量開始呈下降趨勢(shì)，特別是在60 ℃之后迅速下降，因此初步確定50 ℃為最佳提取溫度。

圖4 提取溫度對(duì)MT提取含量的影響

Fig.4 Effect of extraction temperature on MT extraction content

如圖5所示，在0.5～4.0 h對(duì)口蝦蛄中MT進(jìn)行提取時(shí)，發(fā)現(xiàn)0.5～1 h提取量逐漸增加，在提取時(shí)間1.0～4.0 h，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，MT的提取量逐漸降低。MT為胞內(nèi)功能性蛋白，其結(jié)構(gòu)內(nèi)富含的大量還原態(tài)巰基，是其發(fā)揮抗氧化活性最重要的作用基團(tuán)，推測(cè)MT的提取量逐漸降低的原因可能是隨著提取時(shí)間的過分延長(zhǎng)，巰基發(fā)生氧化[23]。所以當(dāng)達(dá)到1 h時(shí)，MT提取量最大值為0.219 mg/g，因此確定最佳提取時(shí)間為1 h。

圖5 提取時(shí)間對(duì)MT提取含量的影響

Fig.5 Effect of extraction time on MT extraction content

2.2 響應(yīng)面法對(duì)提取工藝優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在分析單因素試試驗(yàn)結(jié)果后設(shè)計(jì)了響應(yīng)面試驗(yàn)，選擇4個(gè)對(duì)MT提取量影響顯著的因素(提取液濃度、提取液pH、提取溫度和液料比)設(shè)計(jì)四因素三水平的Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)值為MT提取量，開展29組實(shí)驗(yàn)(24組因?qū)嶒?yàn)和5組中心實(shí)驗(yàn))，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

利用Design-expert.V8.0.6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，擬合得到的二次多元回歸模型如下公式(2)：

R=0.24-0.013A-3.833E-003B-4.667E-003C-

0.014D-0.013AB+4.750E-003AC+4.250E-

003D+2.500E-004BC-7.500E-003BD+

8.000E-003CD-0.035A2-0.022B2-0.024C2-

0.013D2

(2)

從表3可知，F(xiàn)=10、P<0.01，表明本研究中的二次模型極其顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型的失擬項(xiàng)的F=4.05、P>0.05，影響不顯著，說明該模型具有很好的擬合度。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 提取含量二次多項(xiàng)模型方差分析表

注：**表示P<0.01，差異極顯著；*表示P<0.05，差異顯著，“-”表示未測(cè)出。

從表4變異系數(shù)可以看出，模型決定系數(shù)R2=0.909 1，說明該模型能解釋90.91%的響應(yīng)結(jié)果變化，其擬合度良好，誤差小，能較好地分析預(yù)測(cè)口蝦姑體內(nèi)MT提取量；此外，CV=5.66%<10%，說明此研究具有較高的可信度和精確度；該模型精密度(adeq precision)>4，說明該模型可預(yù)測(cè)。因此，對(duì)口蝦蛄MT提取擬合的回歸方程符合以上檢驗(yàn)原則，適應(yīng)性較好。

表4 變異系數(shù)

由回歸方程的系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，因素A提取液pH和因素D料液比的P<0.01，說明提取液pH和D料液比對(duì)口蝦蛄中MT提取含量的影響極顯著，對(duì)于A2、B2，C2其P值均<0.01，說明A2、B2、C2對(duì)口蝦蛄中MT含量的影響也極顯著，另AB、D2的P值<0.05，說明AB、D2對(duì)口蝦蛄中MT含量具有顯著的影響，而其他因素的影響則不顯著。通過比較分析，在影響MT提取量的因素中，其影響提取效果的大小順序依次為：液料比>提取液pH>提取液濃度>提取溫度。

2.2.2 交互因子效應(yīng)分析

根據(jù)所得的二元二次回歸方程分析2個(gè)因素之間的交互影響，得到交互因子的響應(yīng)面和等高線圖，如圖6～圖11所示。響應(yīng)面的陡度或平緩度可以反映出實(shí)驗(yàn)條件變化對(duì)響應(yīng)值的影響，等高線形狀可以反映相互作用強(qiáng)度，等高線呈橢圓形，則2個(gè)因素之間相互作用強(qiáng)烈，圓形則表明2因素之間交互作用較弱，等高線排列越緊密，表明對(duì)MT提取有很大的影響[24]。在同一區(qū)域中，若MT的提取量相同，則MT提取的最大值就是橢圓的中心點(diǎn)，其大小從中心到邊緣遞減。根據(jù)圖6～圖11可知，所有曲面圖都呈現(xiàn)良好的拋物線形狀，表明各因素都有明顯的相互作用，且每個(gè)曲面圖的開口都向下，證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有最大值。如圖7所示，從提取液pH和提取溫度交互作用的響應(yīng)面圖可看出，隨著提取液pH值和提取溫度增加，MT提取量均呈先上升，上升至最大值后下降的拋物線趨勢(shì)；說明在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的提取液pH值(7.0～9.0)、提取溫度(40～60 ℃)，該模型存在最大值，即存在最佳的提取液pH和提取溫度。同樣，MT的提取量隨著提取溫度、提取液pH、液料比和提取液濃度這4個(gè)因素的變化呈相應(yīng)的拋物線變化趨勢(shì)，即這4個(gè)因素都能在實(shí)驗(yàn)的范圍內(nèi)使得MT提取量達(dá)到最佳值。因此，在本研究中各因素水平范圍內(nèi)有最優(yōu)的提取條件組合，對(duì)口蝦蛄中MT也能獲得最大的提取量，通過該模型和響應(yīng)面曲線圖，可以確定最佳工藝參數(shù)范圍。

圖6 提取液pH和提取溫度對(duì)MT提取量的影響

Fig.6 Effects of extraction solution pH and extraction temperature on MT extraction amount

圖7 提取液pH和提取液濃度對(duì)MT提取量的影響

Fig.7 Effects of pH extraction and extract concentration on MT extraction

圖8 提取液pH和液料比對(duì)MT提取量的影響

Fig.8 Effects of extraction solution pH and ratio of material to liquid on MT extraction

圖9 提取溫度和提取液濃度對(duì)MT提取量的影響

Fig.9 Effects of extraction temperature and concentration of extract on MT extraction amount

圖10 液料比和提取溫度對(duì)MT提取量的影響

Fig.10 the Effects of the ratio of material to liquid and extraction temperature on the extraction amount of MT

圖11 提取液濃度和液料比對(duì)MT提取量的影響

Fig.11 Effects of extraction concentration and ratio of material to liquid on MT extraction

2.2.3 響應(yīng)面法最佳提取工藝驗(yàn)證

依據(jù)Design-expert.V 8.0.6分析數(shù)據(jù)所得，口蝦蛄中MT最佳提取工藝條件為：Tris-HCl提取液濃度為0.02 mol/L、提取液pH為7.74、提取溫度為51.04 ℃、液料比為4、提取時(shí)間為1 h，最佳響應(yīng)預(yù)測(cè)結(jié)果為0.243 mg/g。結(jié)合實(shí)際，選擇Tris-HCl提取液濃度為0.02 mol/L、提取液pH為7.8、液料比為4、提取溫度為51℃、提取時(shí)間1 h，在此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得的MT含量為0.232 mg/g，與預(yù)測(cè)值相差0.011 mg/g，說明該模型誤差小，具有可行性，能較好地預(yù)測(cè)口蝦蛄中MT提取含量。工藝優(yōu)化方法的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)取決于優(yōu)化目標(biāo)，在口蝦姑MT的提取過程中，通過對(duì)比分析，液料比在口蝦蛄中MT的提取中作為較大的影響因素；還發(fā)現(xiàn)A2、B2、C2其P值均<0.01，AB、D2的P值<0.05，對(duì)口蝦蛄中MT的提取量都具有顯著影響。因此，各因素跟響應(yīng)值之間不僅僅是單一的線性關(guān)系。通過響應(yīng)面法更好地解析各因素與響應(yīng)值的相關(guān)性，尤其通過各因素的交互作用，能反映出最佳的提取工藝條件。姚冬兒等[24]利用響應(yīng)面法對(duì)褶牡蠣中MT工藝優(yōu)化時(shí)，結(jié)果顯示模型值與理論值之間誤差較小，獲得了良好的提取效果，為后續(xù)海洋源MT的提取開發(fā)提供了參考。李冰等[25]利用響應(yīng)面法對(duì)超聲波輔助提取酵母源MT-like的工藝進(jìn)行優(yōu)化后，增大了MT提取效率和產(chǎn)量，對(duì)今后的酵母源MT-like的工業(yè)化生產(chǎn)具有借鑒意義。

3 結(jié)論

本研究?jī)?yōu)化了以口蝦蛄為原料提取MT的工藝，以料液比、提取液pH、提取溫度和提取液濃度為因子的數(shù)學(xué)模型，進(jìn)行優(yōu)化，所得的最佳提取工藝為：提取液濃度為0.02 mol/L、提取液pH為7.8、液料比為4、加熱溫度為51℃、提取時(shí)間1 h，此條件下MT的提取含量為0.232 mg/g，與預(yù)測(cè)值相差0.011 mg/g，說明響應(yīng)面法適用于口蝦蛄MT提取工藝進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。這為后續(xù)對(duì)口蝦蛄MT進(jìn)行分離、純化研究提供基礎(chǔ)，也為海洋生物資源的開發(fā)和利用提供新的思路。