HPLC 法同時(shí)測(cè)定新會(huì)柑種子中7 種成分

鄭國(guó)棟， 楊秀娟， 巢穎欣， 胡坪君， 陳柏忠， 蔡 軼， 韋敏燕*

（1. 廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 廣東 廣州511436； 2. 廣東新寶堂生物科技有限公司， 廣東 江門529000）

陳皮為蕓香科植物橘及其栽培變種的干燥成熟果皮, 作為藥食同源的材料, 主要包括廣陳皮、 川陳皮、 浙陳皮、 建陳皮和贛陳皮。 其中廣陳皮為茶枝柑Citrus reticulata ‘Chachi’ （新會(huì)柑或大紅柑）的干燥成熟果皮[1], 主產(chǎn)于江門市新會(huì)地區(qū), 為廣東省十大道地藥材之一, 也是首批立法保護(hù)的8種嶺南中藥材之一, 具有理氣健脾、 和胃止嘔、 燥濕化痰等功效[2]。

廣陳皮產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速, 僅新會(huì)當(dāng)?shù)亟y(tǒng)計(jì), 2017年廣陳皮的種植規(guī)模已達(dá)7 萬(wàn)畝, 總產(chǎn)柑果超8.5萬(wàn)噸, 扣除果皮后果肉年產(chǎn)近6 萬(wàn)噸, 果籽近2 000噸。 盡管果肉與果籽產(chǎn)量極大, 但對(duì)新會(huì)柑的應(yīng)用主要集中于果皮。 由于其柑肉味酸籽多, 故其果肉和果籽的處理方式通常為挖土掩埋或是直接扔入溝渠等露天場(chǎng)所, 不僅造成了極大的資源浪費(fèi), 也對(duì)環(huán)境造成了污染。

將柑橘果籽（種子） 作為中藥橘核Citrus reticulata Semen 應(yīng)用, 其具有理氣、 散結(jié)、 止痛等功效[3]。 現(xiàn)代藥理研究表明, 橘核還具有鎮(zhèn)痛、 抗癌以及抗感染等藥理活性[4]。 課題組對(duì)新會(huì)柑果皮（廣陳皮） 的化學(xué)成分、 藥理活性以及質(zhì)量控制等已作了大量研究[5-8], 但國(guó)內(nèi)外尚無(wú)新會(huì)柑果籽（種子） 的相關(guān)研究報(bào)道。 因此, 為了更好地開發(fā)利用新會(huì)柑, 本研究首次建立了HPLC 法同時(shí)測(cè)定新會(huì)柑種子中7 種成分, 以期為其資源的合理開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

Shimadzu LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司）； UV 2300 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）； MS205DU 分析天平（十萬(wàn)分之一, 瑞士梅特勒-托利多公司）； 超聲波清洗機(jī)KQ-800KDE （昆山市超聲儀器有限公司）。

新會(huì)柑柑果采至廣東省江門市新會(huì)區(qū), 由廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院蔡軼副教授鑒定為蕓香科柑橘屬茶枝柑Citrus reticulata ‘Chachi’ 的果實(shí), 經(jīng)剝離果皮, 收集種子, 洗凈、 曬干得干燥成熟種子, 其樣品保存于廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室。 信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

辛弗林 （批號(hào)MUST-17041915）、 沒(méi)食子酸（批號(hào)MUST-17022801）、 橙皮苷 （批號(hào) MUST-15070211）、 檸檬苦素 （批號(hào)MUST-17030220）、川陳皮素（批號(hào)MUST-15110911）、 橘皮素（批號(hào)MUST-151110912, 含有量≥98%） 均購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司； 3, 5, 6, 7, 8, 3′, 4′-七甲氧基黃酮（批號(hào)151123, 含有量≥98%, 四川維克奇生物科技有限公司）。 乙腈（色譜純, 含有量≥98%美國(guó)霍尼韋爾公司）； 甲醇、 乙酸乙酯均為分析純； 水為怡寶純凈水。

2方法與結(jié)果

2.1 HPLC 法測(cè)定7 種成分含有量

2.1.1 供試品溶液 分別稱取4 批新會(huì)柑種子適量, 打粉, 粉末過(guò)3 號(hào)篩, 精密稱取粉末0.2 g 于100 mL 錐形瓶中, 加入20 mL 甲醇, 超聲提?。?20 W、 40 kHz） 30 min, 過(guò)濾, 即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液 精密稱取一定量的7 種對(duì)照品至50 mL 量瓶中, 加甲醇溶解并定容, 使制成質(zhì)量濃度分別為辛弗林37.560 μg/mL、 沒(méi)食子酸1.200 μg/mL、 橙皮苷341.700 μg/mL、 檸檬苦素392.980 μg/mL、 川陳皮素71.040 μg/mL、 3, 5,6, 7, 8, 3′, 4′-七甲氧基黃酮9.960 μg/mL 和橘皮素49.320 μg/mL 的混合對(duì)照品貯備液, 冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?臨用前, 加甲醇稀釋至適宜濃度, 即得。2.1.3 色譜條件 DIKMA Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）； 流動(dòng)相磷酸水（A） -（甲醇∶乙腈=1 ∶1, B）, 梯度洗脫, 程序見(jiàn)表2；檢測(cè)波長(zhǎng)辛弗林（224 nm）, 沒(méi)食子酸（218 nm）,橙皮苷（283 nm）, 檸檬苦素（209 nm）, 川陳皮素、 3, 5, 6, 7, 8, 3′, 4′-七甲氧基黃酮、 橘皮素（330 nm）； 柱溫30 ℃； 體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。 色譜圖見(jiàn)圖1。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.4 波長(zhǎng)選擇 分別精密稱取一定量7 種對(duì)照品于量瓶中, 加入甲醇溶解并定容, 備用。 以甲醇為空白對(duì)照溶液, 在190～900 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描, 以對(duì)照品溶液和供試品溶液均有較大吸收為指標(biāo)選擇測(cè)定波長(zhǎng), 最終7 種成分的檢測(cè)波長(zhǎng)分別確定為辛弗林（224 nm）, 沒(méi)食子酸（218 nm）,橙皮苷（283 nm）, 檸檬苦素（209 nm） 和川陳皮素、 3, 5, 6, 7, 8, 3′, 4′-七甲氧基黃酮、 橘皮素（330 nm）。

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照品貯備液, 加入甲醇稀釋, 配制成6 個(gè)質(zhì)量濃度水平。 在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析, 每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)3 次。 分別以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）,峰面積值為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸, 結(jié)果見(jiàn)表3。檢測(cè)限（LOD） 和定量限（LOQ） 分別是當(dāng)信噪比（S/N） 為3 和10 時(shí)化合物的質(zhì)量濃度。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 分別選取低、 中、 高3 個(gè)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液, 在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣3 次, 測(cè)得7 種成分RSD 分別為1.0%、 1.7%、 1.7%、 0.4%、 1.2%、 0.5% 和1.1%, 表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 選擇第S1 批樣品, 按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下, 于0、 2、 4、 8、 12、 24、 48 h 進(jìn)樣, 測(cè)得7 種成分RSD 分別為0.7%、 1.3%、0.5%、 2.3%、 1.4%、 0.3% 和0.2%, 表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取第S1 批的新會(huì)柑種子粉末, 按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣, 測(cè)得7 種成分的含 有 量 分 別 為0.041、 0.004、 0.423、 20.480、0.405、 0.069、 0.303 mg/g； RSD 分別為1.2%、2.2%、 0.5%、 2.5%、 1.9%、 0.5% 和0.2%, 表明該方法重復(fù)性良好。

表3 各成分線性關(guān)系（n=3）Tab.3 Linear relationships of various constituents （n=3）

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含有量的第S1 批新會(huì)柑種子粉末6 份, 每份0.2 g, 分別加入一定量的混合對(duì)照品, 按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,測(cè)定7 種成分含有量, 計(jì)算加樣回收率。 7 種成分平 均 回 收 率 分 別 為 98.546%、 101.703%、100.298%、 98.719%、 101.769%、 100.516%、100.032%； RSD 分 別 為 2.1%、 2.6%、 1.5%、1.5%、 1.5%、 1.3%、 2.0%。

2.1.10 樣品含有量測(cè)定 分別精密稱取4 批新會(huì)柑種子粉末各0.2 g, 按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 分別取適量經(jīng)0.22 μm 針頭濾膜過(guò)濾, 在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣, 測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.4 Results of content determination of various constituents （n=3）

2.2 UV 法測(cè)定總黃酮、 多甲氧基黃酮及總酚酸

2.2.1 總黃酮[9]分別稱取4 批新會(huì)柑種子適量,打粉, 粉末過(guò)3 號(hào)篩, 精密稱取粉末0.2 g, 加入20 mL 甲醇超聲（320 W、 40 kHz） 提取30 min,提取1 次, 以橙皮苷為對(duì)照, 在283 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定, 采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算得總黃酮含有量, 結(jié)果見(jiàn)表4。

2.2.2 多甲氧基黃酮[10]分別稱取4 批新會(huì)柑種子適量, 打粉, 粉末過(guò)3 號(hào)篩, 精密稱取粉末0.2 g, 加入20 mL 乙酸乙酯超聲（320 W、 40 kHz）提取30 min, 提取2 次, 合并2 次提取液, 以川陳皮素為對(duì)照, 在330 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定, 采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算得多甲氧基黃酮含有量, 結(jié)果見(jiàn)表4。

2.2.3 總酚酸[11]分別稱取4 批新會(huì)柑種子適量, 打粉, 粉末過(guò)3 號(hào)篩, 精密稱取粉末0.2 g,加入20 mL 甲醇超聲 （320 W、 40 kHz） 提取30 min, 提取1 次, 以沒(méi)食子酸為對(duì)照, 在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定, 采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算得總酚酸含有量, 結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

在測(cè)定檸檬苦素的含有量時(shí), 王巍靜、 羅靜等[12-13]采用石油醚等對(duì)其進(jìn)行脫脂處理。 考慮到脫脂處理會(huì)對(duì)低極性待測(cè)成分的含有量測(cè)定帶來(lái)干擾, 因此, 課題組采用超聲提取法, 直接用甲醇提取, 還比較了脫脂與否對(duì)檸檬苦素含有量測(cè)定的影響, 發(fā)現(xiàn)兩者并無(wú)顯著性差異。 因此, 本實(shí)驗(yàn)選用甲醇超聲提取。

已有研究[14]表明新會(huì)柑果皮（新會(huì)陳皮） 中以黃酮類成分為主, 其中以橙皮苷含有量最高。 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明, 新會(huì)柑種子則以檸檬苦素類成分為主, 其具有抗菌、 抗炎、 鎮(zhèn)痛、 抗癌、 降壓等多種藥理活性[15-17], 因此, 可考慮從中提取檸檬苦素類成分, 對(duì)新會(huì)柑種子予以開發(fā)利用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 除檸檬苦素外, 新會(huì)柑種子還含有部分辛弗林等生物堿類、 沒(méi)食子酸等酚酸類以及黃酮類成分。 辛弗林具有舒張氣管平滑肌、 肝保護(hù)及改善新陳代謝等作用[18-20]； 沒(méi)食子酸具有降脂、 抗菌等作用[21-22]； 黃酮類具有改善糖脂代謝、 抗氧化、 心肌保護(hù)等作用[23-24]。 本研究結(jié)果進(jìn)一步表明新會(huì)柑種子具有良好的藥理活性, 是1種有效的藥用資源。

致謝：衷心感謝新會(huì)區(qū)人民政府、 新會(huì)陳皮行業(yè)協(xié)會(huì)等單位在樣品采集及基地建設(shè)方面對(duì)本研究工作的大力支持和幫助。