實時直接質(zhì)譜對辣椒及其制品中辣度的快速評價

李偉麗，劉玉淑，伍姚，喻卉，任艷嬌，周文化，車振明，吳韜

1(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，食品生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，四川 成都，610039) 2(天津捷盛東輝保鮮科技有限公司，天津，300300)3(中南林業(yè)科技大學(xué)，特醫(yī)食品加工湖南省重點(diǎn)實驗室，湖南 長沙，410004)

辣椒作為常見的辛辣味調(diào)味品和著色劑，在全世界被廣泛種植。辣椒素類成分是辣椒中主要呈味物質(zhì)，辣椒素和二氫辣椒素約占辣椒素類總量的90%[1]。氣候、土壤和種植習(xí)慣的差異，使得市場上辣椒品種繁多，辣度存在明顯差異。此外，不同人群對辣感的可接受程度差異也較大。為了對目標(biāo)人群進(jìn)行精準(zhǔn)銷售，對辣椒及其制品的辣度進(jìn)行快速質(zhì)量監(jiān)控很有必要。目前報道的對辣椒素類化合物的測定方法主要包括紫外-可見光譜法[2]，高效液相色譜法[3]，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4]，熒光光譜法[5]，酶聯(lián)免疫法[6]，電化學(xué)分析法[7]。然而上述方法大都需要復(fù)雜的樣品前處理，或者需要經(jīng)過色譜分離，費(fèi)時費(fèi)力。

實時直接質(zhì)譜(direct analysis in real time mass spectrometry, DART-MS)是由美國CODY等[8]發(fā)明的一種開放式離子化質(zhì)譜技術(shù)。其基本原理是利用He等氣體分子在高壓放電條件下轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，使待測樣品分子發(fā)生潘寧電離，并將待測物分子離子導(dǎo)入質(zhì)譜檢測器中進(jìn)行檢測[9]。該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)在于不需要色譜分離，能夠瞬間得到分析數(shù)據(jù)。此外，樣品可以在開放式環(huán)境中直接導(dǎo)入質(zhì)譜，簡化了樣品前處理步驟，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。近年來DART-MS應(yīng)用已逐漸拓展到醫(yī)藥、化工和食品等領(lǐng)域[10-11]。迄今為止，對辣椒及其制品的辣度快速檢測尚不多見。因此，本研究擬開發(fā)一種基于DART-MS技術(shù)的辣度的高通量評價方法。

①-DART離子源；②-自動進(jìn)樣裝置；③-質(zhì)譜檢測器

圖1 DART-MS檢測系統(tǒng)

Fig.1 DART-MS determination system

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮辣椒、泡椒以及郫縣豆瓣醬樣品,購于成都郫都區(qū)某超市。

辣椒素，二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，成都瑞芬思有限公司；乙腈(色譜純)，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；高純He(≥99.999%)、高純N2(≥99.999%)，四川梅塞爾氣體產(chǎn)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DART SVP離子源，美國IonSense公司；AB SCIEX 3500三重四級桿質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX公司；VORYEX 3渦旋混勻器，德國IKA公司；Heto-HSC 500真空冷凍干燥機(jī)，上海佰蕾真生物科技有限公司；高速多功能粉碎機(jī)，永康市久品工貿(mào)有限公司；TD-5M離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；KQ-100DZ數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將樣品辣椒切成小段，凍干，高速粉碎機(jī)粉碎，經(jīng)100目標(biāo)準(zhǔn)篩過篩，稱取凍干樣品0.500 g于15 mL離心管中，加入10.0 mL乙腈溶解，渦旋60 s，常溫條件下超聲提取20 min，在4 000 r/min條件下離心15 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔有機(jī)濾膜過濾后裝入樣品瓶中。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

(1)辣椒素和二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液

精確稱取1.00 mg辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品和二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品，加入2 mL乙腈溶解，配制成0.50 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，保存于-20 ℃條件下備用。

(2)混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液的制備

移取不同體積的辣椒素和二氫辣椒素儲備液，用乙腈稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為50.0、25.0、12.5、5.0、0.5 μg/mL的辣椒素標(biāo)準(zhǔn)溶液和50.0、25.0、12.5、5.0、0.5 μg/mL二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 質(zhì)譜條件

DART SVP離子源條件：解吸氣體溫度為450 ℃；工作氣體和預(yù)備氣體分別為He和N2；氣體壓力為0.5 MPa；柵網(wǎng)電極電壓為200 V；DART離子源與質(zhì)譜儀之間的距離為2.8 cm；樣品軌道移動速度為0.6 mm/s；進(jìn)樣裝置為12通道自動進(jìn)樣模塊(圖1)；進(jìn)樣體積為3 μL。質(zhì)譜條件：正離子掃描模式，多反應(yīng)檢測掃描(MRM)模式；去簇電壓為80 V；碰撞能量為17 V。

1.4 計算方法

1.4.1 基質(zhì)效應(yīng)的計算[12]

通過公式(1)計算樣品對目標(biāo)離子強(qiáng)度的基質(zhì)效應(yīng)。

(1)

1.4.2 辣椒素類總量計算[13]

辣椒素類總量以辣椒素和二氫辣椒素含量之和除以0.9計算。

1.4.3 辣度計算及分級標(biāo)準(zhǔn)[13]

本試驗以國際通用的斯科維爾指數(shù)(scoville heat units, SHU)表示樣品的辣度，其計算如公式(2)所示：

SHU=W×0.9×(1.61×103)+W×0.1×(9.3×103)

(2)

式中：W，試樣中辣椒素總量,g/kg。

按照湖南老窯地方標(biāo)準(zhǔn)，辣度分級根據(jù)斯科維爾指數(shù)(SHU)換算，可將辣度分為十級[14]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，方差分析(ANOVA)用于顯著性分析，以P<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒素和二氫辣椒素的裂解行為

為了降低辣椒素和二氫辣椒素的檢出限，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring, MRM)進(jìn)行質(zhì)譜定量檢測。首先分別對它們的質(zhì)譜裂解行為進(jìn)行研究，確定合適的定量檢測離子對。預(yù)試驗表明，辣椒素類成分在正離子模式下的信號強(qiáng)度高于負(fù)離子模式，因此，本研究均采用質(zhì)譜正離子模式。辣椒素二級質(zhì)譜裂解行為如圖2-a所示，辣椒素的分子離子峰為m/z306。m/z137為最強(qiáng)信號峰，是由辣椒素C7-N8位置斷裂，經(jīng)過芳香環(huán)的雙鍵重排導(dǎo)致的。m/z170是辣椒素脫去芳香環(huán)部分后剩余的酰基鏈部分；m/z170脫去尾端的銨根離子得到m/z153。m/z182是芐基碳鍵斷裂得到的?；鶜埢肿?。二氫辣椒堿的最強(qiáng)信號峰也是m/z137，其裂解行為與辣椒素相似。本研究結(jié)果與辣椒素和二氫辣椒素在大氣壓化學(xué)電離源(atmospheric pressure chemical iosziaa-lion, APCI)、電噴霧電離源(electrospray ionization, ESI)下的裂解規(guī)律非常相似[15-16]，且背景雜峰較少，有利于譜圖的定性解析。因此，辣椒素選擇離子對m/z306→m/z137進(jìn)行定量檢測，而二氫辣椒素選擇離子對m/z308→m/z137進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測定量檢測。

圖2 辣椒素(a)和二氫辣椒素(b)標(biāo)準(zhǔn)品的二級質(zhì)譜圖

Fig.2 DART-MS/MS spectra of capsaicin (a) and dihydrocapsaicin (b) standards solution

2.2 DART-MS條件優(yōu)化

在DART-MS中，解吸氣體的溫度是分析物電離的關(guān)鍵因素之一[17]。本研究分別考察了氣體解吸溫度對辣椒素和二氫辣椒素一級母離子響應(yīng)強(qiáng)度的影響，結(jié)果見圖3-a。如圖3-a所示，氣體溫度從200 ℃逐漸升至450 ℃時，辣椒素和二氫辣椒素的響應(yīng)強(qiáng)度逐漸升高；當(dāng)溫度從450 ℃升至550 ℃時，辣椒素和二氫辣椒素的響應(yīng)強(qiáng)度有所下降，原因可能是辣椒素和二氫辣椒素在高溫下開始發(fā)生熱降解。綜合考慮，選用450 ℃為解吸氣體的最優(yōu)溫度。

圖3 辣椒素和二氫辣椒素的響應(yīng)強(qiáng)度隨解吸氣體(He)溫度(a)和柵網(wǎng)電極電壓(b)變化的趨勢

Fig.3 Effect of gas heater temperature(a) and grid voltage(b) on peak intensity of capsaicin and dihydrocapsaicin

柵網(wǎng)電極電壓對分析物的電離過程也具有重要作用，它對消除大氣中的反應(yīng)物離子如NO+以及減少質(zhì)譜圖上的“化學(xué)背景”具有顯著影響[18]。本試驗考察了100～400 V的柵網(wǎng)電極電壓對待測組分響應(yīng)強(qiáng)度的影響，結(jié)果見圖3-b。如圖3-b所示，辣椒素的響應(yīng)強(qiáng)度在100～400 V范圍內(nèi)先呈上升趨勢，到達(dá)峰值后逐漸降低。二氫辣椒堿的響應(yīng)強(qiáng)度在250 V時最大。綜合考慮，選擇200 V為最優(yōu)的柵網(wǎng)電極電壓。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

以峰面積為縱坐標(biāo)，辣椒素和二氫辣椒素含量為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)和相關(guān)系數(shù)R2(表1)。辣椒素和二氫辣椒素均在0.5～50 μg/mL范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)均>0.96，表明線性關(guān)系良好。檢出限均為0.1 μg/g，定量限均為0.5 μg/g。與LC-MS/MS方法測得的檢出限與定量限分別為0.075～0.15 mg/kg、0.25～0.5 mg/kg差異不明顯[19]。這表明本方法能有效地對辣椒素和二氫辣椒素進(jìn)行檢測，具有良好的靈敏度。

2.3.2 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指除樣品中被分析物以外的組分和目標(biāo)組分共同進(jìn)入離子源，在電離過程中對目標(biāo)物電離產(chǎn)生離子增強(qiáng)或者抑制效應(yīng)[20]。基質(zhì)效應(yīng)在定量分析中可能會嚴(yán)重影響結(jié)果的精密度、準(zhǔn)確性，在定性分析中發(fā)生基質(zhì)抑制效應(yīng)可降低其檢出限，影響方法的靈敏度，因此需要研究DART-MS方法的基質(zhì)效應(yīng)。

圖4 辣椒素(a)和二氫辣椒素(b)標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.4 The standard curve of capsaicin (a) and dihydro-capsaicin (b) determined by DART-MS

由于缺少商業(yè)化的空白基質(zhì)(不含辣椒素或二氫辣椒素的辣椒)，本研究采用近似的空白基質(zhì)。即采用樣品提取溶液直接溶解辣椒素或二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品，然后使用樣品提取溶液對其進(jìn)行連續(xù)稀釋。最終泡椒中辣椒素和二氫辣椒素加標(biāo)質(zhì)量濃度范圍為5.30～53.0 μg/mL，郫縣豆瓣中辣椒素和二氫辣椒素加標(biāo)質(zhì)量濃度范圍為0.5～12.5 μg/mL。

根據(jù)研究，當(dāng)|基質(zhì)效應(yīng)|≤20時，可以認(rèn)為幾乎沒有基質(zhì)效應(yīng)[21]。由表1可知，郫縣豆瓣中辣椒素和二氫辣椒素的基質(zhì)效應(yīng)分別為-6.72%和-11.83%，泡椒中辣椒素和二氫辣椒素的基質(zhì)效應(yīng)分別為-11.06%和-13.63%，表明泡椒和郫縣豆瓣醬中的基質(zhì)對辣椒素和二氫辣椒素含量有輕微抑制作用，但是影響不顯著，可以直接采用辣椒素和二氫辣椒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

表1 方法的線性參數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限及定量限

2.3.3 回收率與精密度

在上述優(yōu)化好的試驗條件下，在樣品中添加高、中、低3個濃度的目標(biāo)分析物(表2)，每個濃度平行測定6次，測定加標(biāo)回收率和精密度。

表2 方法的加標(biāo)回收率和精密度測定結(jié)果(n=6)

精密度用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。結(jié)果如表2所示，整體上辣椒素的平均回收率在79.74%～97.74%，RSD在0.80%～8.89%，二氫辣椒素的平均回收率在85.60%～98.71%，RSD在2.69%～9.54%。與LC-MS/MS方法測得的回收率與精密度分別為96.8%～104.0%、1.5%～4.5%相比，DART-MS方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性稍差[19]。但根據(jù)SANTE/11945/2015歐盟指南[22]，回收率在70%～120%，RSD≤20%表明具有較好的回收率和精密度。因此，DART-MS方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性較好，可用于快速檢測樣品中辣椒素和二氫辣椒素的含量。

2.4 辣椒及其制品中辣度的測定

采用上述建立的DART-MS/MS快檢方法對4種辣椒以及5種辣椒制品中的辣椒素和二氫辣椒素含量進(jìn)行測定(表3)。結(jié)果表明，4種鮮辣椒樣品均具有顯著差異(P<0.05)，辣度分級在6～8級。其中，紅色二荊條辣椒的辣度最高，辣度最低的是美人椒。辣度最高的樣品是辣度最低樣品的3.74倍。人們普遍認(rèn)為小米椒辣度最高，有研究通過高效液相法測定小米椒、二荊條辣椒中辣椒素總含量分別為3.8～6.58 mg/g、0.45 mg/g，小米椒比二荊條辣椒辣度高14倍以上[23]。而本試驗結(jié)果表明，小米椒的辣度不及紅色二荊條辣椒。有研究采用高效液相色譜法測定不同種源地、椒形的辣椒中的辣椒素含量，發(fā)現(xiàn)種植在炎熱、潮濕地域的辣椒品種的辣度(7～10級)極顯著高于干燥、日溫差較大地域(5～6級)；小型椒(米椒、泡椒和朝天椒)辣度(9級)大于線椒(8級)[24]。由此可知辣椒辣度受多方面因素的影響，在評價辣度時需綜合考慮。在辣椒制品中，泡椒是由野山椒泡制發(fā)酵而成，其辣度達(dá)到7級。郫縣豆瓣4的辣度是郫縣豆瓣1的2倍以上。目前郫縣豆瓣標(biāo)簽中尚無辣度標(biāo)準(zhǔn)，豆瓣醬的辣味主要來源于原料中的辣椒，不同廠家的原料來源、配比、制作工藝和發(fā)酵時間等因素都會影響辣椒素含量。因此，需要綜合考慮多種因素對辣椒制品中辣度的影響。

表3 辣椒及其制品中辣椒素和二氫辣椒素的含量

注：同列肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論

首次采用DART-MS/MS技術(shù)，建立了快速、簡便、穩(wěn)定性較好地檢測辣椒及其制品中的辣椒素類物質(zhì)的方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗證。結(jié)果表明，DART-MS方法可以用于快速檢測辣椒及其制品的辣度。由于辣椒素與二氫辣椒素屬于同系物，其理化性質(zhì)相近，傳統(tǒng)高效液相色譜檢測需要較長的色譜分離過程才能將其分開，單次進(jìn)樣分析一般需要10～40 min[4,25]。而DART-MS方法無前期分離過程，直接進(jìn)樣，單次樣品測定時間小于30 s，可以大幅縮短分析周期。此外，DART-MS方法與傳統(tǒng)的色譜方法相比，具有操作簡單、環(huán)保(無需有機(jī)溶劑作為流動相)、譜圖簡潔等優(yōu)點(diǎn)。研究結(jié)果對辣椒原料及其加工制品的過程監(jiān)控、工藝優(yōu)化及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升等具有重要意義。