脂質(zhì)組成對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系惡性程度的影響

齊 飚， 楊 晨， 吳 劍， 王紅章， 高 竑， 李秋平,2*

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門(mén)醫(yī)院神經(jīng)外科，廈門(mén) 361015 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200032

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)惡性腫瘤，約占成人原發(fā)性顱腦腫瘤的40%～50%。神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，患者治愈率低、預(yù)后差、總體生存期短[1-2]。臨床上對(duì)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度的判斷主要依靠世界衛(wèi)生組織(WHO)的分類(lèi)系統(tǒng)，膠質(zhì)瘤被分成4級(jí)：Ⅰ級(jí)以毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤為代表，Ⅱ級(jí)以少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤為代表，Ⅲ級(jí)以間變型膠質(zhì)細(xì)胞瘤為代表，Ⅳ級(jí)則為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)[3-4]。惡性膠質(zhì)瘤通常指GBM，占神經(jīng)膠質(zhì)瘤總數(shù)的60%～70%，目前以手術(shù)為主、放化療為輔的綜合治療療效欠佳，GBM患者的中位生存期僅為首次診斷后的12～15個(gè)月，是目前最難治療的癌癥之一[5]。

脂質(zhì)組學(xué)(lipidomics)著眼于全面系統(tǒng)地分析生命體脂質(zhì)組成，尋找疾病相關(guān)的脂質(zhì)標(biāo)志物，預(yù)測(cè)脂質(zhì)與生物化合物相互作用過(guò)程中的改變，進(jìn)而研究脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)和動(dòng)態(tài)調(diào)控在各種生命現(xiàn)象中的作用規(guī)律[6]。完整的脂質(zhì)組學(xué)流程包括脂質(zhì)提取、脂質(zhì)組鑒定和定量分析、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和數(shù)據(jù)解釋?zhuān)渲徐`敏、可靠的脂質(zhì)組分析方法是研究的難點(diǎn)和關(guān)鍵[7]。本研究擬建立并優(yōu)化Shotgun脂質(zhì)組學(xué)策略，對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172、U251和U87MG進(jìn)行規(guī)模性、整體性的脂質(zhì)組成鑒定，結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析手段，尋找與膠質(zhì)瘤惡性分化演變相關(guān)的脂質(zhì)變化和代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系：3種成瘤能力不同的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，A172在裸鼠體內(nèi)無(wú)法成瘤；U251具有裸鼠皮下成瘤能力；U87MG是高侵襲性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，在裸鼠皮下成瘤最快[8]。主要試劑：色譜級(jí)甲醇、氯仿、異丙醇、正己烷購(gòu)自Merck Millipore(USA)，色譜級(jí)甲酸、乙酸銨購(gòu)自ThermoFisher(USA)，脂質(zhì)內(nèi)標(biāo)購(gòu)自Avanti Polar Lipids(USA)，磷酸、氯化鉀購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)(中國(guó))。

2 結(jié) 果

表1 Shotgun脂質(zhì)組學(xué)ESI-MS掃描方法

PC：phosphatidylcholine，磷脂酰膽堿；PE：phosphatidylethanolamine，磷脂酰乙醇胺；PG：phosphatidylglycerol，磷脂酰甘油；PS：phosphatidylserine，磷脂酰絲氨酸；PA：phosphatidic acid，磷脂酸；PI：phosphatidylinositol，磷脂酰肌醇；SL：sulfatide，硫脂；SP：sphingolipids，鞘脂；SM：sphingomyelin，鞘磷脂

圖1 Shotgun脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析3種人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的主要脂質(zhì)組成

2.2 定量比較人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系脂質(zhì)種類(lèi)和脂肪酸側(cè)鏈分布 通過(guò)對(duì)3個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系在正負(fù)離子掃描模式下EMS圖譜進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的脂質(zhì)組成相似。為了獲悉脂質(zhì)組成與膠質(zhì)瘤細(xì)胞系轉(zhuǎn)移潛能的相關(guān)性，本研究對(duì)主要的脂質(zhì)種類(lèi)和脂肪酸側(cè)鏈分布進(jìn)行了相對(duì)定量分析。與無(wú)成瘤能力的A172細(xì)胞系相比，大多數(shù)甘油磷脂的種類(lèi)(如PC、PA和PG)在惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251和U87MG中呈現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的趨勢(shì)，其中PC和PA的表達(dá)升高有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；含d18∶1的鞘脂(d18∶1 SP)則隨著膠質(zhì)瘤成瘤能力和轉(zhuǎn)移潛能的增加表達(dá)呈顯著降低(P<0.05，圖2A)。在ESI正離子掃描模式下，三酰甘油(TG)在U251和U87MG中表達(dá)上調(diào)近1.5倍(P<0.05，圖2B)。

圖2 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中主要脂質(zhì)種類(lèi)的相對(duì)質(zhì)譜強(qiáng)度

通過(guò)對(duì)串級(jí)質(zhì)譜PI和NL掃描的數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析，獲悉脂肪酸側(cè)鏈在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的總體分布情況。C16、C18和C20系列的脂肪酸鏈?zhǔn)羌?xì)胞系脂質(zhì)組成主要的?；鶄?cè)鏈類(lèi)型。與A172相比，C15∶0的表達(dá)在惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251和U87MG中發(fā)生顯著性下調(diào)；C20∶1和C20∶4的表達(dá)發(fā)生顯著性上調(diào)(P<0.05)。C18∶1的表達(dá)在U251和U87MG細(xì)胞系中呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，C18∶3的表達(dá)則隨著膠質(zhì)瘤細(xì)胞系轉(zhuǎn)移潛能的增加而上調(diào)，但組間差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，與U251相比，C16∶0的表達(dá)在具有高轉(zhuǎn)移潛能U87MG中發(fā)生顯著性下調(diào)，C16∶0表達(dá)則下調(diào)約2.52倍(P<0.05，圖3)。

圖3 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中脂肪酸鏈分布的相對(duì)質(zhì)譜強(qiáng)度

2.3 分層聚類(lèi)分析人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系脂質(zhì)變化 對(duì)3個(gè)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中鑒定到的所有脂質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量分析，設(shè)置卡值標(biāo)準(zhǔn)為不同組間脂質(zhì)分子質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度倍數(shù)變化>1.5或<0.67且P<0.05，篩選到121個(gè)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義變化的脂質(zhì)分子。差異脂質(zhì)分子信號(hào)強(qiáng)度歸一化前后數(shù)據(jù)分布如圖4A所示。A172、U251和U87MG的變量組間差異采用單因素方差分析檢驗(yàn)(ANOVA)來(lái)排序，分層聚類(lèi)分析(HCA)如圖4B中熱圖所示，Pearson相關(guān)性用于組間距離測(cè)量，每行代表1個(gè)差異表達(dá)的脂質(zhì)分子，每列代表1個(gè)細(xì)胞樣品，每組樣品含3次生物學(xué)重復(fù)；不同色塊提示從2～-2不同的組間相關(guān)值，橙色為正相關(guān)，藍(lán)色為負(fù)相關(guān)，灰色提示缺失值。121個(gè)差異脂質(zhì)分子的相對(duì)強(qiáng)度揭示數(shù)據(jù)分為兩簇，一簇僅含A172細(xì)胞系，另一簇則包含U87MG、U251。

圖4 分層聚類(lèi)分析不同人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的差異脂質(zhì)分子

2.4 多變量統(tǒng)計(jì)分析人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系脂質(zhì)變化 主成分分析(PCA)用于對(duì)不同細(xì)胞系間的脂質(zhì)變化做多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在PCA分析中(圖5A)，第一主成分(PC1)的方差貢獻(xiàn)可占總方差的47.9%，并且將無(wú)成瘤能力的A172與具有成瘤和轉(zhuǎn)移潛能的U251和U87MG細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)；第二主成分(PC2)的方差貢獻(xiàn)占25.6%。變量投影重要性(VIP)準(zhǔn)則用于差異脂質(zhì)分子在解釋不成瘤和成瘤膠質(zhì)瘤細(xì)胞分離效果時(shí)作用的重要性，認(rèn)為VIP值大于1的差異脂質(zhì)分子在解釋分離效果時(shí)即有重要的作用。VIP值打分最高的15個(gè)差異脂質(zhì)分子見(jiàn)圖5B，其中PC 18∶1/18∶1的VIP值高達(dá)1.63，在解釋分離效果時(shí)有最重要的作用。不同的統(tǒng)計(jì)分析方法均表明差異脂質(zhì)組成能將具有成瘤和轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞系U251和U87MG與無(wú)成瘤能力的細(xì)胞系A(chǔ)172系區(qū)分開(kāi)來(lái)。

圖5 多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用于系統(tǒng)性分析不同人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的差異脂質(zhì)分子

3 討 論

脂質(zhì)是三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，是生物膜的重要成分，是生物體儲(chǔ)能的主要場(chǎng)所。脂質(zhì)也是重要的信號(hào)分子，多種脂質(zhì)分子及其代謝中間產(chǎn)物參與血管炎癥、細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附和運(yùn)動(dòng)等生理和病理過(guò)程[14]。脂質(zhì)是目前在化學(xué)結(jié)構(gòu)上最多樣化的生物有機(jī)分子，脂肪酸的長(zhǎng)度、飽和度、雙鍵位置以及順?lè)串悩?gòu)均影響脂質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)，從而影響細(xì)胞膜的功能和膜蛋白的活性[15]。基于質(zhì)譜分析的脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)靈敏度高，分辨率好，能進(jìn)行高通量檢測(cè)，并能獲取脂質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)信息。

脂質(zhì)代謝發(fā)生改變是腫瘤細(xì)胞的重要特征之一，其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展互為因果關(guān)系[16-17]。近年研究提示，具有生物活性的特征性脂質(zhì)分子和脂質(zhì)代謝通路的激活與多種實(shí)體腫瘤的進(jìn)程緊密相關(guān)。Yue等[18]在晚期和轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織單細(xì)胞水平的脂滴中發(fā)現(xiàn)異常積累的酯化膽固醇，這導(dǎo)致抑癌基因PTEN失活和促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的代謝途徑激活。Guri等[19]發(fā)現(xiàn)蛋白mTORC2能夠刺激肝臟腫瘤中神經(jīng)酰胺和心磷脂的產(chǎn)生，從而滿(mǎn)足癌細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)代謝和能量的需求。此外，結(jié)構(gòu)多樣的脂質(zhì)能與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。鑒于每種細(xì)胞類(lèi)型中含有數(shù)千種不同結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)分子，生命體很可能存在大量的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用，構(gòu)成復(fù)雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[20]。綜上，代謝物能驅(qū)動(dòng)異常的基因調(diào)控，代謝重編程對(duì)基因表達(dá)、細(xì)胞增殖與腫瘤微環(huán)境影響深遠(yuǎn)。

腫瘤細(xì)胞的高侵襲性與頻繁復(fù)發(fā)相關(guān)，細(xì)胞系在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力在一定程度上反映了惡性潛能。雖然A172、U251和U87MG來(lái)源于不同的患者，但不同的生長(zhǎng)模式和體內(nèi)成瘤能力使其成為研究膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的有價(jià)值的細(xì)胞模型。脂質(zhì)分子在腫瘤生長(zhǎng)中極為重要，并且可能與膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。脂質(zhì)表達(dá)譜的比較研究可以揭示差異功能脂質(zhì)并提供有用的信息。由于分辨率高、快速靈敏、重現(xiàn)性好以及高通量等優(yōu)點(diǎn)，Shotgun技術(shù)常用于系統(tǒng)研究生命體的整體脂質(zhì)組成及其復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)[21]。本研究通過(guò)Shotgun脂質(zhì)組學(xué)分析，共鑒定到1 541種脂質(zhì)分子，篩選到121個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異變化的脂質(zhì)分子，并通過(guò)多元變量統(tǒng)計(jì)分析揭示差異脂質(zhì)組成能將具有成瘤和轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞系U251和U87MG與無(wú)成瘤能力的細(xì)胞系A(chǔ)172系區(qū)分開(kāi)來(lái)。這些差異表達(dá)的脂質(zhì)可能與神經(jīng)膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)可能有助于開(kāi)發(fā)新的診斷標(biāo)志物和膠質(zhì)瘤的治療靶點(diǎn)。

目前報(bào)道的神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)的脂質(zhì)組學(xué)研究，主要將神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系或臨床血清/血漿樣本作為研究對(duì)象[22-23]?？茖W(xué)界尚未系統(tǒng)繪制與神經(jīng)膠質(zhì)瘤各組織學(xué)分級(jí)密切相關(guān)的脂質(zhì)組成圖譜，特別是針對(duì)組織學(xué)分級(jí)為Ⅳ級(jí)的惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤臨床標(biāo)本的脂質(zhì)組學(xué)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。我們正在積極收集神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本，通過(guò)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本進(jìn)行大規(guī)模脂質(zhì)定性定量研究，挖掘神經(jīng)膠質(zhì)瘤是否有特定的脂質(zhì)代謝特征；篩選不同組織學(xué)分級(jí)的癌組織中顯著變化的脂質(zhì)分子，以確定差異功能脂質(zhì)在人類(lèi)膠質(zhì)瘤進(jìn)程中的特異性和預(yù)后價(jià)值。綜上，我們?cè)噲D在不久的將來(lái)，實(shí)現(xiàn)在脂質(zhì)層面上對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并結(jié)合隨訪資料探討脂質(zhì)組成差異對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后的影響。