• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    中試制備臨床級別第三代慢病毒

    2019-08-22 08:56:02段德明季永飄周夢潔高基民
    生物工程學(xué)報 2019年7期
    關(guān)鍵詞:細胞培養(yǎng)滴度質(zhì)粒

    段德明,季永飄,周夢潔,高基民

    中試制備臨床級別第三代慢病毒

    段德明,季永飄,周夢潔,高基民

    溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 溫州 325035

    基因治療是一個快速發(fā)展的領(lǐng)域,其中關(guān)于慢病毒介導(dǎo)的外源基因?qū)胙芯康米顬閺V泛。隨著研發(fā)技術(shù)的不斷發(fā)展,在安全性方面慢病毒已經(jīng)從第一代發(fā)展至第三代,而如何工程化獲得高滴度慢病毒仍是當今技術(shù)一大瓶頸。運用Fibra-Cel片狀載體作為HEK293T細胞載體基質(zhì),聯(lián)合多個無菌細胞轉(zhuǎn)瓶在滾瓶機上培養(yǎng),對貼壁細胞進行規(guī)模放大化生產(chǎn)。通過對第三代慢病毒包裝過程中影響慢病毒滴度的因素進行逐一篩選,使病毒滴度達到最優(yōu)。研究結(jié)果成功運用Fibra-Cel片狀載體作為HEK293T細胞粘附載體基質(zhì),作為一種貼壁細胞規(guī)模放大的方法,篩選出了利用滾瓶機制備第三代慢病毒的最優(yōu)條件,規(guī)?;a(chǎn)了3批慢病毒。在時間上,將慢病毒的生產(chǎn)時間從質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到病毒收集的120 h縮短至54 h;在成本上,利用滾瓶機代替生物反應(yīng)器實現(xiàn)了無需反復(fù)滅菌、全程一次性產(chǎn)品的安全有效低成本的運行,為慢病毒的規(guī)模化制備提供了技術(shù)上的支持,為臨床應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。

    慢病毒,規(guī)?;苽?,F(xiàn)ibra-Cel,基因治療,CAR-T

    20世紀90年代,慢病毒載體作為一種安全替代品開始漸漸取代γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,由于慢病毒載體既能將基因插入到分裂細胞也能插入到非分裂細胞[1-2]中,且目的基因在宿主細胞中長期而穩(wěn)定的表達,使其迅速成為基因修飾和細胞治療中的重要工具。

    隨著對慢病毒的不斷研究和開發(fā),慢病毒從第一代開展至第三代,第一個改進是該載體系統(tǒng)病毒只有HIV-1 Gag、Pol、Rev和VSV-G蛋白,沒有活性LTR、Tat或輔助蛋白,可以顯著增加其生物安全性。第二個改進就是從表達質(zhì)粒中的3′ LTR中刪除了U3區(qū)域內(nèi)的TATA盒、Sp1和NF-kB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點[3-6],這些載體稱為自滅活載體 (Self-inactivating vector,SIN),其長末端重復(fù)序列的增強子或啟動子被刪除,從理論上降低了附近基因被激活的風(fēng)險。在逆轉(zhuǎn)錄之后,U3區(qū)域內(nèi)的3′ LTR缺失被轉(zhuǎn)移到原病毒DNA的5′ LTR的U3區(qū)域,引起LTR啟動子的轉(zhuǎn)錄失活,阻止了全長載體的RNA的表達,這種改進降低了野生型HIV病毒感染后載體活化的可能性[7-9]。第3個改進就是在慢病毒載體骨架上加入了土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(Wood chuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element, WPRE),它可增強mRNA轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性,提高第三代載體的表 達[10-12]。Salk的報道中指出,在慢病毒載體中添加WPRE后,轉(zhuǎn)導(dǎo)效率提高了5倍[13-15]。

    慢病毒載體的運用十分廣泛,在轉(zhuǎn)向臨床實驗時會需要大量的慢病毒載體,而將生產(chǎn)工藝放大則顯得極為重要??梢酝ㄟ^擴展方法(增加生產(chǎn)單元) 即單純的擴大“2D”培養(yǎng)方法,也可以通過采用懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)實現(xiàn),后者比貼壁細胞更容易放大規(guī)模,而懸浮化貼壁依賴型細胞會降低細胞的體積/密度比,對于商品制造者來說,載體基質(zhì)培養(yǎng)具有諸多優(yōu)點。在簡單的懸浮培養(yǎng)、流化床或填充床系統(tǒng)中使用載體基質(zhì),每1 mL可能得到2×108個細胞。選擇正確的載體基質(zhì)取決于培養(yǎng)細胞的類型和培養(yǎng)的目的。本研究在已經(jīng)成熟的“2D”培養(yǎng)方法基礎(chǔ)上,縱向擴展——“3D”懸浮細胞培養(yǎng),對懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)體系如細胞密度、載體基質(zhì)濃度、轉(zhuǎn)瓶速度、聚醚酰亞胺(Polyetherimide)∶DNA比例、總質(zhì)粒濃度、丁酸鈉濃度以及培養(yǎng)時間進行優(yōu)化,獲得最佳的慢病毒規(guī)模化制備條件,為臨床應(yīng)用奠定了堅定的基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與材料

    細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM-MEM、RPMI1640及細胞培養(yǎng)其他成分HEPES、D-PBS,購自美國Gibco公司;去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自美國Axygen公司;Fibra-Cel購自Eppendorf公司;Cytodex1、Cytodex3購自GE Healthcare公司;polybrene、PEI購自Sigma公司;內(nèi)毒素檢測試劑盒購自廈門鱟試劑生物科技公司;雙鏈DNA定量試劑盒購自上海聯(lián)邁生物。

    1.2 儀器與設(shè)備

    流式細胞分析系統(tǒng) (BD FACS Aria),細胞培養(yǎng)箱 (Thermo),超速離心機 (Beckman Coulter),熒光顯微鏡,冷凍真空干燥機、超低溫冰箱和核酸蛋白電泳系統(tǒng),臺式高速離心機 (Eppendorf 5415D),凝膠成像系統(tǒng)為 Bio-Rad公司。

    1.3 方法

    1.3.1 質(zhì)粒提取

    質(zhì)粒加到感受態(tài)Stbl3里,依次冰上放置5 min,42 ℃水浴鍋熱激90 s,冰上放置5 min后,三區(qū)劃線的方法涂布于氨芐平板上。37 ℃培養(yǎng)12–16 h后取出平板后挑取單個菌落接種至含0.1%氨芐的LB液體培養(yǎng)基,37 ℃、250 r/min轉(zhuǎn)速的搖床中培養(yǎng)14–16 h。

    收獲細菌,6 000×、4 ℃離心15 min,然后依次加入10 mL Buffer P1、P2、P3,劇烈晃動離心管4–6次后室溫過濾,加2.5 mL緩沖液ER至溶菌液,冰上孵育30 min,10 mL QBT潤洗QIAGEN-tip 500柱子,用15 mL緩沖液QN洗脫DNA,加入10.5 mL異丙醇使DNA沉淀下來,混勻,15 000×、4 ℃離心30 min,棄上清,5 mL 70%乙醇,15 000×、4 ℃離心10 min,棄上清后烘干質(zhì)粒。檢測質(zhì)粒DNA的濃度并記錄,保存于?20 ℃。

    1.3.2 Fibra-Cel的處理和回收

    用電子天平稱取一定量的Fibra-Cel載體,1 g載體加入5 mL的PBS,混勻密封,4 ℃過夜后,121 ℃高壓滅菌30 min,4 ℃保存。

    將用過的載體基質(zhì)移至玻璃器皿,用清水洗滌3次。向洗滌后的載體基質(zhì)中加入0.1 mol/L醋酸浸泡4–6 h,再用清水洗滌3–5次,烘干滅菌后備用。

    1.3.3 細胞鋪板于Fibra-Cel載體基質(zhì)

    配制DMEM完全培養(yǎng)基,從4 ℃取出PBS、已水化高壓的Fibra-Cel載體基質(zhì)常溫復(fù)溫。提前將滾瓶機打開,紫外照射30 min,溫度調(diào)至37 ℃,CO2濃度調(diào)至5%。取1 L的未處理細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶,放入6 g Fibra-Cel載體基質(zhì)。取3×108細胞,300 mL完全培養(yǎng)基于已加Fibra-Cel的細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶。將細胞培養(yǎng)瓶放至滾瓶機上,8 r/min旋轉(zhuǎn)2 h。

    1.3.4 慢病毒包裝

    準備a、b兩個無菌的離心管,分別加入5 mL的PBS,在a管中加入一定比例的PEI,在b管中加入目的質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒靜置5 min后將a管中試劑加入b管中,輕輕混合均勻。室溫孵育20 min后,將混合物移至細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育。

    1.3.5 慢病毒滴度檢測

    96孔板每孔鋪0.2×106–0.5×106Jurkat細胞, 200 μL/孔,以1∶10的比例將病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)入細胞,32 ℃、1 200×離心90 min。4 h 后用DPBS將細胞洗一次后鋪于12孔板,轉(zhuǎn)導(dǎo)48 h后用流式細胞術(shù)檢測。將陽性細胞群圈出后,計算病毒滴度。病毒滴度=(*)/(*) [=病毒滴度 (TU/mL),=流式細胞術(shù)檢測的陽性細胞比例 (如=0.2即陽性細胞占20%),=轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞數(shù),=轉(zhuǎn)導(dǎo)時病毒稀釋倍數(shù),=轉(zhuǎn)導(dǎo)時的體積]。

    1.3.6 雙鏈DNA (dsDNA) 定量檢測

    向一次性微量比色皿中依次加入梯度性Tris-EDTA緩沖液和2 μg/mL小牛胸腺 DNA 標準濃縮液,隨后加入1 mL PicoGreen定量試劑,混勻后,于室溫避光孵育2–5 min,并以1×TE緩沖液為空白對照,以此結(jié)果作標準曲線,向96孔板中加入TE和2 μg/mL小牛胸腺DNA標準濃縮液,隨后加入100 μL PicoGreen定量試劑,混勻,于室溫避光孵育2–5 min,熒光酶標儀中檢測各濃度熒光值,Ex/Em=480 nm/520 nm。

    1.3.7 BSA殘留檢測

    在酶標板上設(shè)標準品濃度分別為90、60、30、15、7.5 μg/L。封板膜封板后置37 ℃溫育30 min后小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 s后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。然后顯色,先加入顯色劑A 50 μL,再加入顯色劑B 50 μL,輕輕振蕩混勻,37 ℃避光顯色15 min,每孔加終止液50 μL,終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零,450 nm波長依序測量各孔的吸光度 (450)。根據(jù)標準曲線計算BSA殘留量。

    1.3.8 統(tǒng)計學(xué)分析

    2 結(jié)果與分析

    2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

    包裝質(zhì)粒為本實驗室的第三代慢病毒質(zhì)粒,如圖1所示,載體質(zhì)粒含有報告基因Zsgreen。慢病毒包裝后成功轉(zhuǎn)染細胞,表達綠色熒光蛋白,這使得它們易于檢測。

    2.2 細胞培養(yǎng)載體的選擇

    為使細胞在轉(zhuǎn)瓶內(nèi)能懸浮化生長,我們評估了細胞的培養(yǎng)載體類型。固定接種5×105個/mL細胞,分別考察微載體 Cytodex l、Cytodex3和Fibra-Cel對細胞增殖的影響。每組考察實驗設(shè)3個平行實驗。經(jīng)過48 h的微載體培養(yǎng),細胞密度均有所增加,顯微鏡下觀察細胞在載體上的生長情況 (圖2A)。利用微載體Cytodex 1培養(yǎng)HEK293T細胞,細胞增殖不顯著;Cytodex 3細胞密度均增加為最初接種時的近4–5倍,而利用片狀載體Fibra-Cel近 7–9倍,且穩(wěn)定轉(zhuǎn)染導(dǎo)致的慢病毒載體滴度最高 (圖2B)。因此,本實驗確定使用片狀載體Fibra-Cel進行HEK293T細胞規(guī)?;囵B(yǎng)的細胞載體基質(zhì)。

    2.3 細胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化

    細胞的生長狀態(tài)直接影響了慢病毒的生產(chǎn)滴度,故大規(guī)模生產(chǎn)慢病毒載體需要高產(chǎn)量的HEK293T細胞[16]。為了優(yōu)化出HEK293T細胞在Fibra-Cel載體基質(zhì)上富集程度,我們以20 g/L片狀載體Fibra-Cel,在2 r/min、4 r/min、6 r/min、8 r/min、10 r/min轉(zhuǎn)速下,使細胞與載體基質(zhì)充分接觸著床后,消化載體基質(zhì),計算細胞數(shù)量并統(tǒng)計細胞富集率(圖3A),通過顯微鏡下觀察細胞在載體上的生長情況 (圖3B)。結(jié)果顯示,在8 r/min轉(zhuǎn)速的轉(zhuǎn)瓶中旋轉(zhuǎn)2 h,可保證HEK293T細胞高效率的著床于載體基質(zhì)上,且細胞密度在106/mL和2×106/mL時有相近的富集率。

    2.4 病毒包裝條件優(yōu)化

    為了進一步開發(fā)無菌細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶作為生產(chǎn)慢病毒載體的平臺,我們優(yōu)化了包裝病毒的條件,包括丁酸鈉的濃度、PEI與DNA的質(zhì)量比、總質(zhì)粒 (μg/mL) 的濃度,并且以此條件成功包裝出高滴度并具有生物學(xué)功能的慢病毒。

    圖1 載體質(zhì)粒及第三代慢病毒包裝質(zhì)粒系統(tǒng)

    圖3 細胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化

    2.4.1 生產(chǎn)培養(yǎng)基中丁酸鈉濃度對慢病毒包裝滴度的影響

    丁酸鈉是一種有效的組蛋白去乙?;种苿?,使組蛋白高度乙?;?,從而可以引起染色質(zhì)的解聚,使轉(zhuǎn)染的DNA的轉(zhuǎn)錄和表達更高[17-19]。在細胞鋪板載體基質(zhì)48 h后,我們更換DMEM培養(yǎng)基,單一變量變化,使用丁酸鈉0 mmol/L、3 mmol/L、6 mmol/L、9 mmol/L、12 mmol/L的培養(yǎng)基包裝病毒,收集48 h的上清液,流式細胞術(shù)確定慢病毒的功能滴度。結(jié)果顯示 (圖4A),培養(yǎng)基中丁酸鈉濃度為3 mmol/L時慢病毒滴度最高,但與未添加丁酸鈉的培養(yǎng)基相比未有統(tǒng)計學(xué)差異。為減少慢病毒生產(chǎn)后下游處理,未選擇丁酸鈉作為增加慢病毒包裝條件。

    圖4 病毒包裝條件的優(yōu)化

    2.4.2 PEI對慢病毒包裝滴度的影響

    傳統(tǒng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法有磷酸鈣質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、PEI、LIP2000和POLYJET等,其中PEI兼具成本低、轉(zhuǎn)染效率高、影響轉(zhuǎn)染效率因素少等優(yōu)點,故本研究選用PEI為規(guī)模化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)染陽離子聚合物。PEI可與DNA的磷酸酯鍵形成離子相互作用,形成濃縮的PEI-DNA復(fù)合物。在一定量的DNA的情況下,我們推測不同的PEI/DNA比例對病毒滴度有影響。細胞在載體基質(zhì)上培養(yǎng)48 h后,分別以PEI∶總質(zhì)粒質(zhì)量比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1包裝慢病毒。結(jié)果顯示 (圖4B),在PEI∶總質(zhì)粒質(zhì)量比為3∶1、4∶1時,可獲得 107TU/mL 的慢病毒,統(tǒng)計學(xué)分析兩者無明顯差異。由于PEI具有一定的細胞毒性,在生產(chǎn)或純化慢病毒時缺少檢測及定量PEI的方法來判定PEI是否會和慢病毒共純化,以及共純化的水平是否會破壞慢病毒的感染能力和穩(wěn)定性,因此選擇PEI∶總質(zhì)粒質(zhì)量比為3∶1作為規(guī)?;b所用的比值。

    2.4.3 總質(zhì)粒量對慢病毒包裝滴度的影響

    有研究表明,當從培養(yǎng)皿擴大到細胞工廠時,質(zhì)??倽舛瓤梢园幢壤糯骩20],利用懸浮細胞瞬時轉(zhuǎn)染大規(guī)模生產(chǎn)慢病毒是可行的,且擁有良好的產(chǎn)量。但在轉(zhuǎn)移到中試生產(chǎn)之前,該技術(shù)還需要進一步完善。優(yōu)化的主要瓶頸是轉(zhuǎn)染過程本身,PEI無法沉降到細胞轉(zhuǎn)瓶中Fibra-Cel載體基質(zhì)的細胞層上,而細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶中定義的最佳質(zhì)粒濃度是有限的,故需要對總質(zhì)粒的量進行優(yōu)化。

    實驗結(jié)果表明,將總質(zhì)粒濃度從0.8 mg/mL增加到1.6 mg/mL,可以將Fibra-Cel上產(chǎn)生的慢病毒的滴度提高大約兩倍 (圖4C)。隨著總質(zhì)粒濃度的繼續(xù)增加,慢病毒包裝的生物功能滴度呈下降趨勢。

    2.5 關(guān)鍵時間點的探索

    2.5.1 細胞鋪板不同時間后轉(zhuǎn)染

    接下來,我們優(yōu)化了兩個關(guān)鍵的時間變量:轉(zhuǎn)染混合物的加入時間和慢病毒包裝后的收集時間。

    為了探索細胞形態(tài)對慢病毒生產(chǎn)的影響,我們以1×106/mL細胞密度接種于Firba-Cel載體基質(zhì),在細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶中以8 r/min的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)混勻2 h后,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)0 h、2 h、48 h、72 h后將質(zhì)粒加入細胞培養(yǎng)基中,進行慢病毒生產(chǎn)。結(jié)果顯示 (圖5A),在HEK293T細胞落在載體基質(zhì)并培養(yǎng)2 h后即刻進行慢病毒包裝,慢病毒原液滴度可達18×106TU/mL。一般情況下,我們認為當細胞粘附于載體基質(zhì)上,細胞骨架完全伸開密度達80% 時可獲得較優(yōu)的滴度。實驗結(jié)果表明,細胞在貼壁的早期階段所產(chǎn)生的慢病毒滴度最高,這可能和細胞的細胞膜通透性有關(guān)。

    2.5.2 第一次收取病毒時間

    HEK293T細胞表面廣泛表達LDL-R,當細胞上清內(nèi)的病毒VSV-G可以識別并結(jié)合HEK293T細胞表面LDL-R,HEK293T細胞通過胞吞的形式再次使病毒進入細胞,從而使上清中的病毒數(shù)量減少。當上清中的實際病毒數(shù)量 (生產(chǎn)的病毒總數(shù)?進入細胞的病毒數(shù)) 最大時,即可獲最大慢病毒滴度。

    圖5 在Fibra-Cel上擴增和轉(zhuǎn)染HEK293T細胞

    我們分別于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的10 h、19 h、24 h、36 h、38 h、48 h收取上清。結(jié)果顯示,在 38 h時,上清中的實際病毒數(shù)量達到最大值 (圖5C),隨著時間增加,細胞所產(chǎn)病毒減少,進入細胞的病毒數(shù)增加,上清病毒反而降低。HEK293T細胞以300 mL規(guī)模接種到細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶中的Fibra-Cel上,葡萄糖48 h內(nèi)水平降低更多,表明代謝活躍細胞隨著時間的推移而增多(圖5B)。

    2.5.3 第二次收取病毒時間

    在某些情況下,可通過增加收集次數(shù)來提高最終慢病毒的質(zhì)量。我們在收集第一次病毒原液后,更換10% FBS的DMEM,再次放入培養(yǎng)箱產(chǎn)毒,分別于8 h、12 h、16 h、20 h、24 h后收集第二次上清。結(jié)果顯示 (圖5D),在換液12 h后,獲得病毒原液的生物學(xué)功能滴度最高。

    2.6 GMP生產(chǎn)

    GMP (Good manufacture practices),即藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范,用上述優(yōu)化條件作為規(guī)模化慢病毒生產(chǎn)的標準工作程序 (圖6),并生產(chǎn)3批高滴度GMP級GFP慢病毒載體產(chǎn)物 (表1)。這3批慢病毒進行濃縮后檢測支原體、真菌、細菌、內(nèi)毒素、殘留DNA、BSA殘留均符合歐盟國際標準 (表2),病毒濃縮后保存于?80 ℃。

    圖6 臨床制造流程圖

    表1 滾瓶機中生產(chǎn)慢病毒

    表2 主要質(zhì)控指標

    3 討論

    近年來,慢病毒載體的發(fā)展非常迅速,從第一代到第三代的四質(zhì)粒系統(tǒng)[21-23],隨著科學(xué)家對于載體質(zhì)粒的不斷優(yōu)化,慢病毒的安全性也得到了很大程度的提高[12,24-26]。但是,在臨床試驗開展的整體過程中,不僅要求慢病毒要有十分高的安全性,還要求慢病毒有足夠多的具有生物學(xué)功能的病毒顆粒,因此對慢病毒生產(chǎn)時的滴度和生產(chǎn)后的下游加工提出了更高的要求。

    我們在此描述了使用PEI瞬時轉(zhuǎn)染生產(chǎn)高安全性第三代慢病毒載體的可擴展制造平臺開發(fā)?;跐L瓶機聯(lián)合多個透氣表面未處理的無菌細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶封閉系統(tǒng)處理技術(shù),一臺滾瓶機亦可產(chǎn)0.3–500 L病毒原液,且無需在每批運行之間進行滅菌或必要的清潔。

    轉(zhuǎn)染的規(guī)?;a(chǎn)需要仔細分析和優(yōu)化處理步驟,轉(zhuǎn)染過程和載體收集都是有時間依賴性的,并且受到本研究中所證明的許多變量的影響。有報告指出,若未能在最佳“感受”條件下生產(chǎn)慢病毒,最高可導(dǎo)致生產(chǎn)力降低10倍以上[27-28],此外培養(yǎng)時間也對轉(zhuǎn)染具有很大程度的影響。在測試的變量中,我們發(fā)現(xiàn)幾個關(guān)鍵的影響因素,其中包括在細胞收獲前用于轉(zhuǎn)染細胞的密度。我們確定轉(zhuǎn)染前培養(yǎng)的HEK293T細胞的最佳細胞接種密度為106/mL。然而,細胞密度對病毒滴度的影響是否適用于其他載體類型以及這是否對慢病毒載體具有特異性仍有待研究。其他變量發(fā)現(xiàn)影響病毒滴度的因素包括轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)基更換的時間和轉(zhuǎn)染過程中使用的質(zhì)粒濃度。我們的實驗結(jié)果顯示,第一次收取的最佳時間為38 h,第二次收取的最佳時間為12 h。同時,1.6 μg/mL是規(guī)?;苽渲修D(zhuǎn)染的最佳質(zhì)粒濃度。其中通過轉(zhuǎn)染HEK293T細胞產(chǎn)生慢病毒載體的結(jié)果顯示,質(zhì)粒的量從每瓶1.6 μg/mL增加至2.0或2.4 μg/mL 時,實際上卻大大降低了病毒滴度。最后,我們總結(jié)了使用瞬時轉(zhuǎn)染大規(guī)模生產(chǎn)慢病毒載體的新型制造平臺的優(yōu)化參數(shù)并生產(chǎn)3批慢病毒載體。

    病毒的質(zhì)量控制主要包括外觀、可見異物、目的載體鑒別、pH、純度、病毒滴度、無菌檢查、工藝相關(guān)雜質(zhì) (如DNA殘留、牛血清白蛋白殘留,核酸殘留等) 及細菌內(nèi)毒素等。生產(chǎn)的3批慢病毒的各項質(zhì)控均符合歐盟的標準值,而針對每一個特定的病毒載體,需根據(jù)病毒載體及其生產(chǎn)工藝的特點建立特定的質(zhì)量控制檢測及要求,建立相應(yīng)的病毒載體參比品。

    工藝開發(fā)需要嚴謹?shù)臈l件摸索和優(yōu)化,基于瞬態(tài)轉(zhuǎn)染的平臺一旦開發(fā)成功,就可以發(fā)揮其最大的靈活性,以節(jié)省成本和時間。本實驗的探索實現(xiàn)了慢病毒的規(guī)?;苽?,利用滾瓶機實現(xiàn)了無需反復(fù)滅菌、全程一次性產(chǎn)品的安全有效低成本的運行,在快速發(fā)展的基因治療領(lǐng)域中,可用于慢病毒載體的大規(guī)模臨床生產(chǎn)。

    [1] Brown PO. Integration of retroviral DNA//Swanstrom R, Vogt PK, eds. Retroviruses. Berlin: Springer, 1990, 157: 19–48

    [2] Céfa? D, Simeoni E, Ludunge KM, et al. Multiply attenuated, self-inactivating lentiviral vectors efficiently transduce human coronary artery cellsand rat arteries. J Mol Cell Cardiol, 2005, 38(2): 333–344.

    [3] Zufferey R, Nagy D, Mandel RJ, et al. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery. Nat Biotechnol, 1997, 15(9): 871–875.

    [4] Naldini L, Bl?mer U, Gage FH, et al. Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93(21): 11382–11388.

    [5] Dull T, Zufferey R, Kelly M, et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol, 1998, 72(11): 8463–8471.

    [6] Zufferey R, Dull T, Mandel RJ, et al. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficientgene delivery. J Virol, 1998, 72(12): 9873–9880.

    [7] Gait MJ, Karn J. RNA recognition by the human immuno-deficiency virus Tat and Rev proteins. Trends Biochem Sci, 1993, 18(7): 255–259.

    [8] Cockrell AS, Kafri T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol, 2007, 36(3): 184–204.

    [9] Delenda C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med, 2004, 6 Suppl 1: S125–S38.

    [10] Zufferey R, Donello JE, Trono D, et al. Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors. J Virol, 1999, 73(4): 2886–2892.

    [11] Espinoza DA, Fan X, Yang D, et al. Aberrant clonal hematopoiesis following lentiviral transduction of HSPC in a rhesus macaque. Mol Ther, 2019, doi: 10.1101/525691.

    [12] Engelman AN, Singh PK. Cellular and molecular mechanisms of HIV-1 integration targeting. Cell Mol Life Sci, 2018, 75(14): 2491–2507.

    [13] Popa I, Harris ME, Donello JE, et al. CRM1-dependent function of a-acting RNA export element. Mol Cell Biol, 2002, 22(7): 2057–2067.

    [14] Hope TJ, Romain Z, Didier T, et al. RNA export element: US19970936476, 2000-10-24.

    [15] Thomas J, Hope RZ. RNA export element and methods of use: US6287814, 2001.

    [16] Yon CS, Won PS. Recombinant expression vector system for variants of coagulation factor VIII and von Willebrand factor: US20080200928. 2010-08-28.

    [17] Sena-Esteves M, Tebbets JC, Steffens S, et al. Optimized large-scale production of high titer lentivirus vector pseudotypes. J Virol Methods, 2004, 122(2): 131–139.

    [18] Joglekar AV, Sandoval S. Pseudotyped lentiviral vectors: one vector, many guises. Hum Gene Ther Methods, 2017, 28(6): 291–301.

    [19] Sakuma T, Barry M, Ikeda Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical J, 2012, 443(3): 603–618.

    [20] Geraerts M, Michiels M, Baekelandt V, et al. Upscaling of lentiviral vector production by tangential flow filtration. J Gene Med, 2010, 7(10): 1299–1310.

    [21] Kjems J, Askjaer P. Rev protein and its cellular partners. Adv Pharmacol, 2000, 48: 251–298.

    [22] Milone MC, O’Doherty U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia, 2018, 32(7): 1529–1541.

    [23] Sakuma T, Barry M, Ikeda Y, et al. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical J, 2012, 443(3): 603–618.

    [24] Jamali A, Kapitza L, Schaser T, et al. Highly efficient and selective CAR-gene transfer using CD4- and CD8-targeted lentiviral vectors. Mol Ther Methods Clin Dev, 2019, 13: 371–379.

    [25] Persons DA. Lentiviral vector gene therapy: effective and safe?. Mol Therapy, 2010, 18(5): 861–862.

    [26] Chen RJ, Folarin N, Ho VHB, et al. Affinity recovery of lentivirus by diaminopelargonic acid mediated desthiobiotin labelling. J Chromatogr B, 2010, 878(22): 1939–1945.

    [27] Strobel B, Zuckschwerdt K, Zimmermann G, et al. Standardized, scalable, and timely flexible adeno-associated virus vector production using frozen high-density HEK-293 cell stocks and CELLdiscs. Hum Gene Ther Methods, 2019, 30(1): 23–33.

    [28] Miyake K, Miyake N, Shimada T. Development of targeted gene transfer into human primary T lymphocytes and macrophages using high-titer recombinant HIV vectors. J Biotechnol, 2007, 129(3): 532–538.

    Pilot-scale preparation of clinical-grade third generation lentivirus

    Deming Duan, Yongpiao Ji, Mengjie Zhou, and Jimin Gao

    School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, Zhejiang, China

    Gene therapy is a rapidly developing field. The most widely used technique for foreign gene transfer is lentiviral-mediated gene therapy. Lentiviral vector has been developed from the first generation to the third generation in terms of safety. The preparation of lentiviruses with high titer remains difficult. In this study, a Fibra-Cel sheet carrier was used as an HEK293T cell carrier matrix, and several sterile cell culture spinners were combined and cultured on a roller bottle machine to scale up the adherent cells. The virus titer was maximized by screening the factors to optimize the lentivirus titer in the third-generation lentivirus packaging process one by one. Fibra-Cel sheet vector was successfully used as the matrix of HEK293T cell adhesion to culture adherent cells at large scale. The optimal conditions for large-scale preparation of the third-generation lentivirus by bottle roller were screened and three batches of lentiviruses were produced on pilot scale. The production time of lentivirus was shortened from 120 hours to 54 hours from plasmid transfection to virus collection; in terms of cost, a rolling bottle machine was used instead of a bioreactor, leading to lower cost and no need for repeated sterilization during the whole process. The safe, effective and low-cost operation of successful production will provide a technical base for the large-scale preparation of lentivirus and thus lay a firm foundation for its clinical application.

    lentivirus, large-scale preparation, Fibra-Cel, gene therapy, CAR-T

    April 7, 2019;

    June 14, 2019

    National Natural Science Foundation of China (Nos. 81573110, 91729101).

    Jimin Gao. Tel: +86-577-86699341; E-mail: jimingao64@yahoo.com

    國家自然科學(xué)基金 (Nos. 81573110, 91729101) 資助。

    2019-06-24

    http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190621.1426.001.html

    段德明, 季永飄, 周夢潔, 等. 中試制備臨床級別第三代慢病毒. 生物工程學(xué)報, 2019, 35(7): 1307–1316.

    Duan DM, Ji YP, Zhou MJ, et al. Pilot-scale preparation of clinical-grade third generation lentivirus. Chin J Biotech, 2019, 35(7): 1307–1316.

    (本文責(zé)編 陳宏宇)

    猜你喜歡
    細胞培養(yǎng)滴度質(zhì)粒
    不同富集培養(yǎng)方法對噬菌體PEf771的滴度影響
    重組腺相關(guān)病毒基因藥物三種滴度的比較與分析
    自身免疫性肝病診斷中抗核抗體與自身免疫性肝病相關(guān)抗體檢測的應(yīng)用價值
    酶解大豆蛋白的制備工藝研究及其在細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用研究
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
    3種陰離子交換色譜固定相捕獲細胞培養(yǎng)上清液中紅細胞生成素的效果比較
    色譜(2015年6期)2015-12-26 01:57:32
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對其增殖的影響
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y的作用
    采用PCR和細胞培養(yǎng)方法比較流感樣病例不同標本的流感病毒檢出觀察
    慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA,HBeAg和ALT滴度與恩替卡韋療效的關(guān)系
    日韩av免费高清视频| 国产成人精品久久二区二区91 | 日本欧美视频一区| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 天堂中文最新版在线下载| 成人手机av| 亚洲国产av新网站| 久久久久久久久免费视频了| a级毛片黄视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 精品午夜福利在线看| 免费观看性生交大片5| 色婷婷久久久亚洲欧美| 在线观看人妻少妇| 久久久国产精品麻豆| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 丰满乱子伦码专区| 2021少妇久久久久久久久久久| 久热久热在线精品观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 飞空精品影院首页| 看免费成人av毛片| 国产一区二区三区av在线| 午夜久久久在线观看| 人妻人人澡人人爽人人| 国产野战对白在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲av男天堂| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲精品美女久久av网站| 这个男人来自地球电影免费观看 | www日本在线高清视频| 国产在线一区二区三区精| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 国产av码专区亚洲av| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 一区二区av电影网| 久久97久久精品| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲,欧美,日韩| 婷婷色麻豆天堂久久| www.自偷自拍.com| 国产色婷婷99| 男女免费视频国产| 国产激情久久老熟女| 一本大道久久a久久精品| 国产深夜福利视频在线观看| 人体艺术视频欧美日本| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产日韩欧美视频二区| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久99精品国语久久久| xxxhd国产人妻xxx| 自线自在国产av| 亚洲在久久综合| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产在视频线精品| 日韩精品免费视频一区二区三区| 边亲边吃奶的免费视频| 精品一区二区免费观看| 人人澡人人妻人| 午夜激情av网站| 男女无遮挡免费网站观看| 国产免费福利视频在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 2021少妇久久久久久久久久久| 97在线人人人人妻| 日本-黄色视频高清免费观看| 极品人妻少妇av视频| 高清不卡的av网站| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产成人一区二区在线| 国产熟女午夜一区二区三区| 最近中文字幕高清免费大全6| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 久久久久精品人妻al黑| 26uuu在线亚洲综合色| 观看美女的网站| 妹子高潮喷水视频| 在线天堂中文资源库| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 精品一区在线观看国产| 亚洲精品中文字幕在线视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 又大又黄又爽视频免费| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 丁香六月天网| 中文天堂在线官网| 成人影院久久| 欧美日韩亚洲高清精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲欧美色中文字幕在线| 欧美激情高清一区二区三区 | 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 欧美xxⅹ黑人| 日韩av免费高清视频| 欧美日韩精品网址| 99国产精品免费福利视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 在线观看美女被高潮喷水网站| 激情视频va一区二区三区| 亚洲国产精品999| 在线观看免费日韩欧美大片| 卡戴珊不雅视频在线播放| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 老司机影院毛片| 女人精品久久久久毛片| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 深夜精品福利| 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 蜜桃在线观看..| 国产极品天堂在线| 毛片一级片免费看久久久久| av在线老鸭窝| 国产精品国产三级专区第一集| 久久久久久久久免费视频了| 18禁动态无遮挡网站| 九草在线视频观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 不卡av一区二区三区| 午夜福利乱码中文字幕| 观看av在线不卡| 国产1区2区3区精品| www.自偷自拍.com| 亚洲av欧美aⅴ国产| 欧美国产精品一级二级三级| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 激情五月婷婷亚洲| 18禁动态无遮挡网站| 国产精品一区二区在线观看99| 日韩大片免费观看网站| 三级国产精品片| 亚洲久久久国产精品| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 精品一区二区三卡| 丝袜人妻中文字幕| 毛片一级片免费看久久久久| 久久这里有精品视频免费| 只有这里有精品99| 一级毛片我不卡| 日本欧美视频一区| 欧美日韩精品成人综合77777| 美女福利国产在线| 飞空精品影院首页| 高清视频免费观看一区二区| 高清欧美精品videossex| 99热全是精品| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲第一av免费看| 岛国毛片在线播放| 一区二区三区精品91| 日韩三级伦理在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 性色av一级| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 成人影院久久| 亚洲成人手机| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 最近最新中文字幕大全免费视频 | 亚洲伊人色综图| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 久久久久网色| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产精品av久久久久免费| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 桃花免费在线播放| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲成人一二三区av| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 美女高潮到喷水免费观看| 久久久亚洲精品成人影院| 国产国语露脸激情在线看| 国产精品三级大全| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产乱人偷精品视频| 久久av网站| 一区二区三区精品91| 久久久久国产一级毛片高清牌| 久久99热这里只频精品6学生| 少妇 在线观看| 一区福利在线观看| 色网站视频免费| 日韩中字成人| 黄片播放在线免费| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲伊人久久精品综合| av国产精品久久久久影院| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 亚洲av福利一区| 一本久久精品| 999久久久国产精品视频| 人妻 亚洲 视频| 日本免费在线观看一区| 最黄视频免费看| 制服人妻中文乱码| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲精品在线美女| 国产成人精品一,二区| 久久久久久久久久久免费av| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 色哟哟·www| 国产在视频线精品| 久久人人97超碰香蕉20202| 高清视频免费观看一区二区| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 人成视频在线观看免费观看| 夫妻午夜视频| 亚洲五月色婷婷综合| 男人添女人高潮全过程视频| 大陆偷拍与自拍| 久久精品亚洲av国产电影网| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 精品人妻熟女毛片av久久网站| 欧美精品一区二区大全| 欧美日韩成人在线一区二区| 精品一区在线观看国产| 一二三四在线观看免费中文在| 国产精品不卡视频一区二区| 青草久久国产| 青春草亚洲视频在线观看| 中文字幕制服av| 国产免费现黄频在线看| 一区二区av电影网| 在线观看国产h片| 亚洲人成电影观看| 国产视频首页在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 99久久人妻综合| 欧美日韩综合久久久久久| 国产成人91sexporn| 香蕉丝袜av| 亚洲国产av新网站| www日本在线高清视频| 成年动漫av网址| 亚洲av日韩在线播放| 少妇的丰满在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 日本欧美视频一区| 久久久久久久久久久久大奶| 精品少妇久久久久久888优播| www.自偷自拍.com| 永久免费av网站大全| 我的亚洲天堂| 婷婷色av中文字幕| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产成人精品无人区| 男女边吃奶边做爰视频| 一区二区三区激情视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲av福利一区| 一二三四在线观看免费中文在| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲精品,欧美精品| 色播在线永久视频| 一二三四在线观看免费中文在| 国产欧美亚洲国产| 欧美bdsm另类| 亚洲,一卡二卡三卡| 精品亚洲成国产av| 伊人亚洲综合成人网| 精品午夜福利在线看| 天堂俺去俺来也www色官网| 黑丝袜美女国产一区| 欧美另类一区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 男女免费视频国产| 亚洲内射少妇av| 日本欧美国产在线视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 香蕉丝袜av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲国产色片| 国产精品国产av在线观看| 亚洲精品视频女| 中文字幕最新亚洲高清| 人妻系列 视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产综合精华液| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲精品美女久久av网站| 又大又黄又爽视频免费| 在线观看免费高清a一片| 青春草视频在线免费观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产精品蜜桃在线观看| 久久99蜜桃精品久久| 下体分泌物呈黄色| 大话2 男鬼变身卡| 最近手机中文字幕大全| 久久久久久久久久人人人人人人| 日日爽夜夜爽网站| 久久久久精品人妻al黑| 在线观看国产h片| 美女中出高潮动态图| 97人妻天天添夜夜摸| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲视频免费观看视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 激情视频va一区二区三区| 国产男女超爽视频在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 高清黄色对白视频在线免费看| 中文字幕最新亚洲高清| www.自偷自拍.com| 日本免费在线观看一区| 大片电影免费在线观看免费| 三级国产精品片| 91精品三级在线观看| 国产一区二区在线观看av| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 日韩欧美一区视频在线观看| 1024视频免费在线观看| 久久97久久精品| 丝袜喷水一区| 天天操日日干夜夜撸| 最近中文字幕高清免费大全6| 涩涩av久久男人的天堂| 五月伊人婷婷丁香| 国产成人欧美| 69精品国产乱码久久久| 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美bdsm另类| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 91aial.com中文字幕在线观看| 午夜激情av网站| 在线看a的网站| 一级毛片我不卡| 90打野战视频偷拍视频| 热re99久久国产66热| 久久鲁丝午夜福利片| 久久综合国产亚洲精品| 国产伦理片在线播放av一区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 尾随美女入室| 精品第一国产精品| 日韩在线高清观看一区二区三区| 久久影院123| 少妇的逼水好多| 国产精品三级大全| 少妇被粗大的猛进出69影院| √禁漫天堂资源中文www| 精品一区二区三卡| 大码成人一级视频| 久久狼人影院| 欧美国产精品一级二级三级| 考比视频在线观看| 一级毛片电影观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 搡老乐熟女国产| 考比视频在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 尾随美女入室| 日本av手机在线免费观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 黑人猛操日本美女一级片| 一区福利在线观看| www.熟女人妻精品国产| 国产精品不卡视频一区二区| 久久综合国产亚洲精品| 久久久久精品人妻al黑| 久久 成人 亚洲| 看免费成人av毛片| 毛片一级片免费看久久久久| 成人亚洲欧美一区二区av| 久久午夜福利片| 国产在线视频一区二区| 国产1区2区3区精品| 精品酒店卫生间| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲中文av在线| av在线播放精品| 在线天堂中文资源库| av在线播放精品| 九草在线视频观看| 毛片一级片免费看久久久久| 国产av精品麻豆| 精品国产国语对白av| 欧美日韩综合久久久久久| 咕卡用的链子| 日本-黄色视频高清免费观看| 婷婷色综合www| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲av中文av极速乱| 97精品久久久久久久久久精品| 麻豆av在线久日| 狂野欧美激情性bbbbbb| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 天堂俺去俺来也www色官网| 街头女战士在线观看网站| 国产精品久久久久久精品古装| 波多野结衣一区麻豆| 欧美亚洲日本最大视频资源| 最新中文字幕久久久久| 精品亚洲成a人片在线观看| 中国三级夫妇交换| 欧美97在线视频| 国产男女内射视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| av在线播放精品| 伦理电影大哥的女人| 国产成人免费无遮挡视频| 国产成人精品在线电影| 超碰成人久久| 美女大奶头黄色视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 十八禁网站网址无遮挡| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 日本免费在线观看一区| 黄色视频在线播放观看不卡| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲av综合色区一区| 欧美bdsm另类| 久久久a久久爽久久v久久| 啦啦啦在线观看免费高清www| 日韩一区二区视频免费看| 国产视频首页在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 91精品三级在线观看| 国产1区2区3区精品| 成人亚洲欧美一区二区av| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产日韩欧美视频二区| av福利片在线| 免费黄频网站在线观看国产| 新久久久久国产一级毛片| 男女啪啪激烈高潮av片| 婷婷色综合www| 国产精品.久久久| 精品第一国产精品| 久久久欧美国产精品| 亚洲av福利一区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产国语露脸激情在线看| 啦啦啦啦在线视频资源| 18在线观看网站| 水蜜桃什么品种好| 人成视频在线观看免费观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 黄频高清免费视频| 99九九在线精品视频| 国产在线免费精品| 亚洲色图综合在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 久久久久久久精品精品| 99国产综合亚洲精品| 老司机影院成人| 国产极品天堂在线| 中文字幕亚洲精品专区| 十分钟在线观看高清视频www| h视频一区二区三区| 两个人看的免费小视频| 午夜福利在线免费观看网站| 人妻少妇偷人精品九色| 波多野结衣一区麻豆| av在线app专区| 国产男女内射视频| 十八禁网站网址无遮挡| 婷婷色综合www| 亚洲精品视频女| 欧美 日韩 精品 国产| 桃花免费在线播放| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久精品久久精品一区二区三区| 欧美激情 高清一区二区三区| 啦啦啦在线免费观看视频4| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 秋霞在线观看毛片| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 波多野结衣av一区二区av| xxx大片免费视频| 黄片小视频在线播放| 嫩草影院入口| 永久免费av网站大全| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 国产xxxxx性猛交| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品一区二区在线观看99| av女优亚洲男人天堂| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 涩涩av久久男人的天堂| 国产高清国产精品国产三级| 波野结衣二区三区在线| 人妻少妇偷人精品九色| 欧美日韩精品成人综合77777| 91成人精品电影| 成人影院久久| 久久国产精品大桥未久av| 国产成人aa在线观看| 久久精品国产自在天天线| 免费少妇av软件| 国产成人av激情在线播放| 国产男女超爽视频在线观看| 免费黄色在线免费观看| 日韩制服骚丝袜av| 欧美变态另类bdsm刘玥| 99久久综合免费| 久久久亚洲精品成人影院| 久久久久久久国产电影| 亚洲国产欧美在线一区| 伦精品一区二区三区| 最近手机中文字幕大全| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 香蕉国产在线看| 少妇人妻精品综合一区二区| av网站免费在线观看视频| 曰老女人黄片| 一级片免费观看大全| a 毛片基地| a级毛片在线看网站| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲精品自拍成人| 麻豆乱淫一区二区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 欧美精品一区二区免费开放| 在线观看www视频免费| 91国产中文字幕| 国产成人欧美| 婷婷色综合大香蕉| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 日韩中字成人| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲综合色惰| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 精品午夜福利在线看| h视频一区二区三区| 国产亚洲最大av| 99国产精品免费福利视频| 亚洲精品av麻豆狂野| 夫妻性生交免费视频一级片| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产精品免费视频内射| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久久久国产欧美日韩av| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 高清黄色对白视频在线免费看| 中文字幕亚洲精品专区| 黑人猛操日本美女一级片| 国产高清不卡午夜福利| 国产精品一二三区在线看| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 日韩欧美一区视频在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 国产黄色免费在线视频| 男女午夜视频在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 欧美黄色片欧美黄色片| 中文字幕av电影在线播放| 日韩人妻精品一区2区三区| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 9色porny在线观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 夫妻午夜视频| 精品国产露脸久久av麻豆| 婷婷色av中文字幕| 亚洲精品国产一区二区精华液| 伦理电影大哥的女人| 韩国av在线不卡| 最近最新中文字幕免费大全7| 99国产精品免费福利视频| 丝袜脚勾引网站| 99热网站在线观看| 人妻一区二区av| 亚洲一区中文字幕在线| 人人妻人人澡人人看| 亚洲精品一二三| 在现免费观看毛片| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲第一青青草原| 久久久久网色| 国产一区二区在线观看av| 高清视频免费观看一区二区| 美女国产高潮福利片在线看| 欧美日韩一级在线毛片| 热99久久久久精品小说推荐| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲精品一二三| 在线 av 中文字幕|