柚皮素合成關(guān)鍵基因表達(dá)水平對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物積累水平的量化影響

焦亭亭，周景文，徐沙

柚皮素合成關(guān)鍵基因表達(dá)水平對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物積累水平的量化影響

焦亭亭1,2，周景文1,2，徐沙1,2

1 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122 2 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122

柚皮素是一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等多種藥理活性，也是其他黃酮類化合物合成的重要前體，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前，微生物法生產(chǎn)柚皮素等黃酮類化合物由于代謝通路不平衡等原因?qū)е庐a(chǎn)量較低，在很大程度上限制了其工業(yè)應(yīng)用。文中以一株產(chǎn)柚皮素的釀酒酵母菌株Y-01為研究對(duì)象，利用啟動(dòng)子和拷貝數(shù)控制柚皮素合成代謝途徑關(guān)鍵酶4-香豆酸：CoA連接酶(4CL)、查爾酮合成酶(CHS) 和查爾酮異構(gòu)酶(CHI) 編碼基因的表達(dá)水平，考察這些基因的表達(dá)水平對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物積累水平的量化影響。結(jié)果表明，柚皮素產(chǎn)量與4CL或CHI編碼基因的表達(dá)量之間關(guān)聯(lián)性較低，而與基因的表達(dá)量存在顯著的正相關(guān)性。通過(guò)調(diào)控基因的表達(dá)水平，獲得一株高產(chǎn)柚皮素的釀酒酵母工程菌株Y-04，產(chǎn)量較出發(fā)菌株Y-01提高了4.1倍。研究結(jié)果表明，CHS是柚皮素合成過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)，合理調(diào)控CHS表達(dá)可以顯著促進(jìn)釀酒酵母積累柚皮素。相關(guān)結(jié)果為采用代謝工程強(qiáng)化微生物合成柚皮素等重要黃酮類化合物提供了重要的理論參考。

柚皮素，表達(dá)量，關(guān)鍵基因，啟動(dòng)子，拷貝數(shù)

柚皮素 (4?,5,7-三羥基二氫黃酮) 是一種重要的二氫黃酮類化合物。柚皮素及其衍生物普遍存在于高等植物中，例如西紅柿和柑橘類水果。藥理研究表明，柚皮素及其衍生物具有抗炎、抗氧化、抗病毒、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等各種活性[1]。此外，柚皮素也是大多數(shù)黃酮類化合物的合成前體，可以用于合成具有更多生理活性和應(yīng)用價(jià)值的重要黃酮類化合物。目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的柚皮素制備方法主要有植物提取法、化學(xué)合成法和微生物法。由于植物提取法存在植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、含量低、代謝產(chǎn)物復(fù)雜等問(wèn)題，導(dǎo)致成本較高，嚴(yán)重阻礙了柚皮素的研究和應(yīng)用[2-3]?；瘜W(xué)合成法涉及有毒化學(xué)品和極端反應(yīng)條件，除成本較高外，還無(wú)法保證關(guān)鍵手性基團(tuán)的天然等同性[4]。由于微生物法生產(chǎn)黃酮不受季節(jié)限制，具有完全的天然等同性等特點(diǎn)，是目前被認(rèn)為最有前景的發(fā)展方向。

柚皮素的生物合成途徑從芳香族氨基酸開(kāi)始，主要由4種酶參與，即酪氨酸解氨酶 (TAL) /苯丙氨酸解氨酶 (PAL)、4-香豆酸∶CoA連接酶 (4CL)、查爾酮合成酶 (CHS) 和查爾酮異構(gòu)酶 (CHI)。其中，TAL將L-酪氨酸轉(zhuǎn)化為對(duì)香豆酸；4CL催化1分子CoA和1分子對(duì)香豆酸形成對(duì)香豆酰輔酶A；CHS負(fù)責(zé)將3分子丙二酰輔酶A和1分子對(duì)香豆酰輔酶A轉(zhuǎn)化為柚皮素查爾酮；CHI催化柚皮素查爾酮異構(gòu)化為柚皮素。為了提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，研究人員首先關(guān)注于篩選高活性酶和改善酶的性質(zhì)并獲得了一系列具有較高催化活性的酶[5-6]。大量的代謝工程實(shí)例表明，高效的黃酮生物合成途徑還需要調(diào)節(jié)高活性酶的表達(dá)水平。目前，基于不同強(qiáng)度啟動(dòng)子和不同拷貝數(shù)的模塊化優(yōu)化策略已經(jīng)用于平衡代謝流，并顯著強(qiáng)化了生松素[7]和柚皮素[8]等黃酮類物質(zhì)的積累。但是，該策略需要篩選具有梯度強(qiáng)度的啟動(dòng)子文庫(kù)，并且在多基因途徑中這些啟動(dòng)子的天文數(shù)目組合在實(shí)際操作中是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。因此，在構(gòu)建平衡途徑的啟動(dòng)子-關(guān)鍵基因組合之前，探究途徑中目標(biāo)物質(zhì)產(chǎn)量與關(guān)鍵酶編碼基因表達(dá)量的關(guān)系是必要的。為此，文中以一株可以積累柚皮素的釀酒酵母Y-01為研究對(duì)象，利用不同強(qiáng)度啟動(dòng)子和整合位點(diǎn)，梯度過(guò)量表達(dá)酶活較高香芹菜4CL、矮牽牛CHS和紫苜宿CHI[8]，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-PCR) 方法檢測(cè)它們的表達(dá)水平，獲得柚皮素產(chǎn)量與這3個(gè)關(guān)鍵酶表達(dá)量之間的關(guān)系。結(jié)果表明，CHS是黃酮合成過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)，合理調(diào)控CHS表達(dá)有利于酵母中柚皮素的積累。研究結(jié)果對(duì)后續(xù)代謝工程強(qiáng)化微生物合成柚皮素等重要黃酮類化合物具有重要的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

大腸桿菌JM109用于質(zhì)粒構(gòu)建和保存。釀酒酵母Y-01用于整合片段及表達(dá)，釀酒酵母S288C用于基因擴(kuò)增。文中使用的主要菌株如表1所示。

表1 本研究所用的主要菌株

from,from,from

1.1.2 培養(yǎng)基

LB (Luria Broth) 液體培養(yǎng)基 (/L)：10 g NaCl，10 g蛋白胨，5 g酵母提取物，pH 7.0。

YNB (Yeast Nitrogen Base) 培養(yǎng)基 (/L)：200 g/L葡萄糖母液100 mL，67.4 g/L YNB (Yeast nitrogen base without amino acids) 母液100 mL，并添加所需的缺陷氨基酸 (Trp、His、Leu) 各10 mL，終濃度均為50 mg/L，加蒸餾水至1 L，過(guò)濾除菌，4 ℃冰箱保存。

YPSe培養(yǎng)基 (/L)：20 g蛋白胨，10 g酵母提取物，10 g蔗糖，10 mL無(wú)水乙醇。

1.1.3 主要試劑

各種抗生素和氨基酸，包括氨芐青霉素、遺傳霉素、色氨酸、組氨酸、亮氨酸，均購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司。柚皮素標(biāo)樣購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自O(shè)xoid公司。乙腈 (質(zhì)譜純) 購(gòu)自Merck公司。其他本實(shí)驗(yàn)中使用的各種分析化學(xué)試劑如無(wú)特別說(shuō)明均購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)。各種一步克隆酶、連接酶、感受態(tài)制備試劑盒、pMD19-T Simple Vector購(gòu)自大連寶生物 (TaKaRa) 有限公司。細(xì)菌質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自于生工生物工程 (上海) 股份有限公司。膠回收試劑盒購(gòu)自Fermentas公司。引物合成以及DNA測(cè)序服務(wù)均由生工生物工程 (上海) 股份有限公司提供。

1.1.4 搖瓶培養(yǎng)條件

從平板上挑取改造后產(chǎn)柚皮素釀酒酵母的單菌落，在含有20 mL YNB培養(yǎng)基 (添加Trp和Leu) 的250 mL搖瓶中于30 ℃、220 r/min培養(yǎng)18 h。然后以10% (/) 的接種量轉(zhuǎn)接到20 mL YPSe發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時(shí)加入10 g/L CaCO3及終濃度500 mg/L對(duì)香豆酸，于30 ℃、220 r/min培養(yǎng)84 h。

1.2 方法

1.2.1 釀酒酵母基因組整合框構(gòu)建

為了使代謝途徑基因協(xié)同表達(dá)，首先確定代謝途徑關(guān)鍵基因過(guò)量表達(dá)對(duì)產(chǎn)物柚皮素含量的影響。選擇6個(gè)不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子 (P、P、P、P、P、P) 分別表達(dá)、、基因，并選取了基因組上LEU2和核糖體DNA (rDNA) 作為整合位點(diǎn)。啟動(dòng)子P、P、P、P通過(guò)實(shí)驗(yàn)室原有質(zhì)粒為模板擴(kuò)增獲得，P、P和基因整合的上下游同源臂 (上下游同源臂各500–1 000 bp) 以S288C基因組為模板擴(kuò)增得到，以HIS5作為營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)簽。先將上下游同源臂、HIS5標(biāo)簽盒通過(guò)同源重組連接在T載上，在實(shí)驗(yàn)室已有質(zhì)粒pY26-P--P--P-、pY26-P--P-- P-、pY26-P--P--P-上分別擴(kuò)增P--T、P--T和P--T片段，通過(guò)同源重組的方法得到質(zhì)粒T- LEU2up-P--T-HIS5-LEU2down、T-LEU2up- P--T-HIS5-LEU2down、T-LEU2up-P--T-HIS5-LEU2down、T-25Sup-P--T- HIS5-5Sdown、T-25Sup-P--T-HIS5- 5Sdown、T-25Sup-P--T-HIS5-5Sdown，然后分別將另外5個(gè)啟動(dòng)子與這6個(gè)質(zhì)粒中啟動(dòng)子P通過(guò)同源重組的方法替換，得到另外30個(gè)質(zhì)粒。再通過(guò)引物Pf_LEU2和Pr_LEU2分別擴(kuò)增3個(gè)基因在LEU2位點(diǎn)上的整合片段，引物Pf_25S和Pr_5S分別擴(kuò)增3個(gè)基因在rDNA區(qū)域的整合片段。文中所用主要引物見(jiàn)表2。

采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將這36個(gè)片段分別整合到菌株Y-01的基因組上，用YNB培養(yǎng)基 (添加Trp和Leu) 篩選，30 ℃恒溫培養(yǎng)3–4 d至長(zhǎng)出單菌落。挑取單菌落至YNB液體篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，13 500 r/min離心5 min去上清，收集菌體提取釀酒酵母基因組，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到與實(shí)際大小相符的特異性條帶，則證明菌株構(gòu)建成功。

1.2.2 基因轉(zhuǎn)錄水平的測(cè)定

取發(fā)酵液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期的釀酒酵母細(xì)胞，采用熱酚法提取總RNA[9]。利用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒 (TaKaRa) 去除總RNA中的基因組DNA后，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用TB Green? Premix Ex? Ⅱ試劑盒處理樣品，在LightCycler 480Ⅱ熱循環(huán)儀系統(tǒng) (Roche，Mannheim，Germany) 上進(jìn)行定量PCR (qPCR) 測(cè)定。以基因作為內(nèi)參基因，用引物Pf_Actin和Pr_Actin進(jìn)行qPCR值的歸一化。、和分別用引物Pf_4CL/Pr_4CL、Pf_CHS/Pr_CHS和Pf_CHI/Pr_CHI進(jìn)行擴(kuò)增。最后采用2?ΔΔCt方法[10]獲得、和的mRNA表達(dá)水平來(lái)表征它們的相對(duì)表達(dá)量。

表2 本研究中所用的主要引物

1.2.3 基因整合拷貝數(shù)的測(cè)定

酵母基因組DNA的提取按照Thermo公司GeneJET Genomic DNA Purification Kit中酵母基因組DNA提取說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

以前的研究表明在不同條件下外源基因在基因組上單拷貝克隆具有遺傳穩(wěn)定性[11-12]，而很少有研究能夠確定多拷貝克隆的遺傳穩(wěn)定性。由于一株菌株中多拷貝克隆位點(diǎn)起源于同一基因座處的多個(gè)同源重組事件，外源基因通常在基因組上串聯(lián)重復(fù)可能導(dǎo)致整合基因的不穩(wěn)定[13]。為了確定基因、和整合到酵母rDNA區(qū)域菌株的遺傳穩(wěn)定性，將以rDNA為整合位點(diǎn)的所有釀酒酵母重組菌株在YNB缺陷型平板上劃線，培養(yǎng)3–4 d至長(zhǎng)出單菌落，挑取單菌落至20 mL新鮮的液體YNB缺陷型培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h，然后按1%接種量轉(zhuǎn)移到新鮮的20 mL YPD中并在相同條件下溫育24 h。該過(guò)程再重復(fù)5次，總生長(zhǎng)時(shí)間為144 h，即傳代72代。

從原始的非傳代菌株和傳代72次菌株中提取基因組DNA，通過(guò)qPCR檢測(cè)基因組中關(guān)鍵酶的整合拷貝數(shù)。對(duì)帶有目的基因、和的T載體分別進(jìn)行梯度稀釋，制備目的基因質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，取基因組DNA各1 μL為模板，用熒光引物對(duì)目的基因進(jìn)行qPCR，將得到的t值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，求出DNA樣品中起始模板的拷貝數(shù)。利用相同的方法計(jì)算看家基因(編碼葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶，在基因組以單拷貝的形式存在) 的起始模板的拷貝數(shù)。因?yàn)樵诒磉_(dá)菌株中都導(dǎo)入了質(zhì)粒pY26-P--P--P-，因此要除去質(zhì)粒中目的基因的拷貝數(shù)。利用上述同樣的方法制作該質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以質(zhì)粒中作為目標(biāo)基因。因此，基因組中關(guān)鍵酶的整合拷貝數(shù)計(jì)算公式為：N=(N1?N2)/N0+1(N1代表基因組中目的基因的起始模板的拷貝數(shù)，N2代表基因組中基因起始模板的拷貝數(shù)，N0代表基因組中看家基因起始模板的拷貝數(shù)，1代表基因組染色體上原有一個(gè)拷貝數(shù))。

1.2.4 柚皮素的提取與檢測(cè)

發(fā)酵結(jié)束后，收集發(fā)酵液并加入同體積的無(wú)水乙醇萃取柚皮素，劇烈振蕩混勻后，13 500 r/min離心5 min取上清，有機(jī)相濾膜過(guò)濾后使用Agilent 1260高效液相色譜儀進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)，采用C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm) 進(jìn)行色譜分離，色譜柱溫度控制在25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，流動(dòng)相為超純水 (0.3%乙酸) 和乙腈 (0.3%乙酸)，流速為1 mL/min。柚皮素通過(guò)乙腈/水的梯度洗脫進(jìn)行分離：0–10 min，色譜條件為10%–40%的乙腈 (體積/體積)；10–15 min，色譜條件控制為40%–60%的乙腈；15–17 min，色譜條件控制在60%–10%的乙腈[14]。柚皮素的檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm，以標(biāo)準(zhǔn)品柚皮素濃度為橫坐標(biāo)，紫外區(qū)吸收峰峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 4CL過(guò)量表達(dá)對(duì)柚皮素產(chǎn)量的影響

以Y-01為出發(fā)菌株，將在不同強(qiáng)度啟動(dòng)子 (P、P、P、P、P、P) 控制下的基因分別整合在基因組LEU2位點(diǎn)和rDNA區(qū)域。每株菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵得到柚皮素的產(chǎn)量，qPCR得到轉(zhuǎn)錄水平上的相對(duì)表達(dá)量，從而獲得柚皮素產(chǎn)量與轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)系。

每株菌做3個(gè)平行，并重復(fù)3次，以確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性，從而獲得36組數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖1所示，柚皮素的產(chǎn)量與的相對(duì)表達(dá)量幾乎沒(méi)有相關(guān)性 (=?0.2，=1.62×10–3)，并且在基因組上單拷貝整合時(shí)有利于柚皮素的積累。以LEU2為整合位點(diǎn)，在啟動(dòng)子P控制下，柚皮素的最高產(chǎn)量為165.9 mg/L (Y-02)，比Y-01 (46.1 mg/L) 提高了2.6倍；在啟動(dòng)子P控制下，獲得最低產(chǎn)量81.1 mg/L (Y-03)，比Y-01增加了75.9%。以rDNA區(qū)域?yàn)檎衔稽c(diǎn)過(guò)量表達(dá)，柚皮素產(chǎn)量在21.5 mg/L到97.0 mg/L之間變化，最低產(chǎn)量 (Y-12) 比Y-01減少了一半。結(jié)果表明過(guò)量表達(dá)并不一定能提高柚皮素的產(chǎn)量。

圖1 柚皮素產(chǎn)量與4cl轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)系

2.2 CHS過(guò)量表達(dá)對(duì)柚皮素產(chǎn)量的影響

以上述相同的方法分析CHS過(guò)量表達(dá)對(duì)柚皮素產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖2所示，柚皮素的產(chǎn)量與轉(zhuǎn)錄水平有一定的線性正相關(guān)性 (=0.8，=6.24×10–10)，并且單拷貝數(shù)克隆時(shí)更有利于柚皮素的積累。以LEU2為整合位點(diǎn)時(shí)，在強(qiáng)啟動(dòng)子 (P、P、P) 控制下過(guò)量表達(dá)，轉(zhuǎn)錄水平和柚皮素產(chǎn)量均較高，轉(zhuǎn)錄水平在0.8到1.0之間，柚皮素產(chǎn)量在185.3 mg/L到235.9 mg/L之間。當(dāng)受P啟動(dòng)子控制時(shí)，柚皮素最高產(chǎn)量為235.9 mg/L (Y-04)，較Y-01提高了4.1倍；當(dāng)受P啟動(dòng)子控制時(shí)，最低產(chǎn)量為114.0 mg/L (Y-05)，較Y-01的產(chǎn)量提高了1.5倍。以rDNA為整合位點(diǎn)過(guò)量表達(dá)，柚皮素產(chǎn)量在36.5–174.9 mg/L之間變化，最低產(chǎn)量 (Y-14) 比Y-01降低了20.8%。結(jié)果表明，在一定程度上過(guò)量表達(dá)更有利于柚皮素的大量積累。

圖2 柚皮素產(chǎn)量與chs轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)系

2.3 CHI過(guò)量表達(dá)對(duì)柚皮素產(chǎn)量的影響

以上述相同的方法分析CHI過(guò)量表達(dá)對(duì)柚皮素產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖3所示，柚皮素的產(chǎn)量與轉(zhuǎn)錄水平的線性關(guān)系較小 (=0.4，=3.14×10–5)，并且CHI在基因組單拷貝克隆時(shí)更利于柚皮素的積累。

圖3 柚皮素產(chǎn)量與chi轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)系

當(dāng)LEU2作整合位點(diǎn)時(shí)，在啟動(dòng)子P控制下，柚皮素最高產(chǎn)量達(dá)到168.5 mg/L (Y-06)，比Y-01提高了2.7倍；在啟動(dòng)子P控制下，柚皮素最低產(chǎn)量為115.0 mg/L (Y-07)，比Y-01提高了1.5倍。以rDNA為整合位點(diǎn)過(guò)量表達(dá)，柚皮素的產(chǎn)量在81.9 mg/L到128.2 mg/L之間變化，最低產(chǎn)量 (Y-20) 比Y-01增加了77.7%。結(jié)果表明，過(guò)量表達(dá)提高了柚皮素的產(chǎn)量。

2.4 多拷貝克隆菌株傳代穩(wěn)定性的驗(yàn)證

結(jié)果如圖4所示，基因組整合重組菌Y-08、Y-09、Y-10、Y-11、Y-12及Y-13未傳代與傳代72代后拷貝數(shù)差異分別為9.0%、5.9%、23.6%、9.5%、10.1%、15.7% (圖4A)；基因組整合重組菌Y-14、Y-15、Y-16、Y-17、Y-18及Y-19未傳代與傳代72代后拷貝數(shù)差異分別為12.5%、1.3%、0.5%、5.8%、1.7%、2.2% (圖4B)；基因組整合重組菌Y-20、Y-21、Y-22、Y-23、Y-24及Y-25未傳代與傳代72代后拷貝數(shù)差異分別為6.4%、5.1%、7.9%、11.6%、5.7%、10.6% (圖4C)。上述結(jié)果表明，多拷貝克隆菌株傳代72代后拷貝數(shù)差異基本在15%以下，表明了在本實(shí)驗(yàn)條件下多拷貝克隆菌株具有遺傳穩(wěn)定性。

3 討論

文中以產(chǎn)柚皮素釀酒酵母Y-01為出發(fā)菌株，首次考察了關(guān)鍵酶4CL、CHS和CHI分別過(guò)量表達(dá)對(duì)柚皮素產(chǎn)量的影響。當(dāng)在強(qiáng)啟動(dòng)子P控制下并插入到LEU2位點(diǎn)時(shí)，達(dá)到最高產(chǎn)量235.9 mg/L，比目前報(bào)道的以釀酒酵母為宿主異源合成柚皮素最高產(chǎn)量113.0 mg/L[15]提高了1.1倍。在以前的研究中，因柚皮素合成需要3分子的丙二酰輔酶A，而胞內(nèi)游離丙二酰輔酶A濃度由于脂肪酸生物合成的內(nèi)在緊密調(diào)節(jié)維持在低水平，使丙二酰輔酶A一直被認(rèn)為是黃酮合成的限制性前體因子。一般采用過(guò)量表達(dá)乙酰輔酶A羧化酶 (Acc1)[16]、敲除丙二酰輔酶A的競(jìng)爭(zhēng)途徑[17]和基于反義RNA策略[18]及CRISPRi系統(tǒng)調(diào)控[19]等方法提高胞內(nèi)丙二酰輔酶A含量，使細(xì)胞內(nèi)丙二酰輔酶A最大程度地流向目標(biāo)途徑以提高目標(biāo)化合物產(chǎn)量。但是，最新報(bào)道顯示在釀酒酵母中異源合成柚皮素的前期階段，丙二酰輔酶A并不是柚皮素合成的限速前體，關(guān)鍵酶之間的協(xié)同表達(dá)更有利于柚皮素的積累[20]。對(duì)于調(diào)控途徑基因的協(xié)同表達(dá)，常用的方法是過(guò)量表達(dá)關(guān)鍵基因的同時(shí)調(diào)節(jié)其表達(dá)量，包括調(diào)節(jié)基因拷貝數(shù)、啟動(dòng)子強(qiáng)度及降低蛋白質(zhì)的降解等方式[15,21]。但這些方式所調(diào)控的范圍往往較大，目前還無(wú)法對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行精確調(diào)控。近年來(lái)，越來(lái)越多的計(jì)算機(jī)輔助方法應(yīng)用于代謝通量平衡分析，如OptForce[22]、OptORF[23]和RobustKnock[24]等。許多基于計(jì)算機(jī)的途徑設(shè)計(jì)策略已成功應(yīng)用于所需化合物的生產(chǎn)，例如三乙酸內(nèi)酯[25]、琥珀酸[26]、脂肪酸[27]等。然而，由于代謝途徑涉及眾多的前體合成和相關(guān)修飾基因?qū)е氯狈?zhǔn)確的酶反應(yīng)參數(shù)，使這些調(diào)節(jié)策略的使用受到極大的限制。

目前，精確調(diào)控途徑基因之間的協(xié)同表達(dá)以平衡代謝通路還是一個(gè)巨大的難題。清楚地了解關(guān)鍵酶表達(dá)對(duì)產(chǎn)物柚皮素的影響有利于后期平衡代謝流的研究。據(jù)報(bào)道，CHS是燕麥葉中黃酮類化合物的限速酶[28]，植物可以通過(guò)調(diào)控表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)黃酮類化合物的產(chǎn)生[29-30]。而以微生物為生產(chǎn)宿主異源合成柚皮素途徑尚無(wú)明確的報(bào)道。文中提出了啟動(dòng)子和拷貝數(shù)控制代謝工程，并采用qPCR方法檢測(cè)細(xì)胞中靶基因的轉(zhuǎn)錄水平，探究了關(guān)鍵酶4CL、CHS和CHI分別過(guò)量表達(dá)對(duì)柚皮素產(chǎn)量的影響。結(jié)果顯示在一定范圍內(nèi)分別過(guò)量表達(dá)4CL、CHS和CHI均能提高柚皮素的產(chǎn)量，但是柚皮素產(chǎn)量與4CL或CHI的表達(dá)量沒(méi)有密切的聯(lián)系，而與CHS的表達(dá)量存在線性正相關(guān) (=0.8，=6.24×10–10)，并且柚皮素的產(chǎn)量在過(guò)量表達(dá)CHS時(shí)達(dá)到最大值，這表明CHS表達(dá)對(duì)柚皮素產(chǎn)量的影響最大，并推測(cè)CHS是該研究中柚皮素合成途徑的限速酶。

此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，基因單拷貝克隆的表達(dá)水平大多高于多拷貝克隆的表達(dá)水平，造成的原因可能與釀酒酵母rDNA區(qū)域的基因沉默有關(guān)[31]，外源基因插入該區(qū)域，其表達(dá)水平往往低于插入到常染色質(zhì)區(qū)域的表達(dá)水平。rDNA作為外源基因整合位點(diǎn)，插入其內(nèi)部的外源基因的遺傳穩(wěn)定性還沒(méi)有明確的結(jié)論，這可能與外源基因的拷貝數(shù)和整合形式有關(guān)[32]。文中通過(guò)qPCR檢測(cè)未傳代和傳代后菌株中外源基因拷貝數(shù)并比較兩者的差異，發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)條件下外源基因插入rDNA區(qū)域具有遺傳穩(wěn)定性。文中確立了柚皮素產(chǎn)量與關(guān)鍵酶編碼基因相對(duì)表達(dá)量的關(guān)系，并揭示了CHS是黃酮化合物合成過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)，為后續(xù)深入研究代謝工程強(qiáng)化微生物合成柚皮素等重要黃酮類化合物提供了重要的參考依據(jù)。

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Quantitative effect of the expression level of key genes in naringenin synthesis on the accumulation level of target products

Tingting Jiao1,2, Jingwen Zhou1,2, and Sha Xu1,2

1 National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Naringenin is a natural flavonoid compound with anti-inflammatory, anti-oxidation, anti-viral, anti-atherosclerosis and other pharmacological activities. It is also an important precursor of other flavonoid synthesis and with great value of application. At present, the production of flavonoids such as naringenin by microbial methods has a low yield due to imbalance of metabolic pathways, which greatly limits its industrial application. In this study, a naringenin-producing strain ofY-01 was used in the research object. The expression levels of 4-coumaric acid: CoA ligase (4CL), chalcone synthase (CHS) and chalcone isomerase (CHI) were controlled by promoter and copy numbers to investigate the quantitative effect of key enzyme expression level on the accumulation level of target products. The results showed that the correlation between naringenin production and 4CL or CHI expression was not significant while there was a positive correlation with the expression level of CHS. Strain Y-04 with high yield of naringenin was obtained by regulating the expression level ofgene, and the yield was increased by 4.1-folds compared with the original strain Y-01. This study indicated that CHS is a key regulatory target of naringenin synthesis. Rational regulation of CHSexpression can significantly promote the accumulation of naringenin. The related results provide an important theoretical reference for the use of metabolic engineering to strengthen microbial synthesis of important flavonoids such as naringenin.

naringenin, expression level, key gene, promoter, copy number

December 19, 2018;

February 28, 2019

National Natural Science Foundation of China (No. 31670095).

Sha Xu. Tel/Fax: +86-510-85914371; E-mail: xus1984@jiangnan.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31670095) 資助。

2019-03-19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190318.1121.002.html

焦亭亭, 周景文, 徐沙. 柚皮素合成關(guān)鍵基因表達(dá)水平對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物積累水平的量化影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(7): 1256–1265.

Jiao TT, Zhou JW, Xu S. Quantitative effect of the expression level of key genes in naringenin synthesis on the accumulation level of target products. Chin J Biotech, 2019, 35(7): 1256–1265.

(本文責(zé)編 陳宏宇)