裂殖壺菌合成二十二碳六烯酸機(jī)理研究進(jìn)展

楊 浩，金小琬，唐嘉淇，黃健庭，陳天曉，楊雪薇，黎雙飛

(深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東省植物表觀遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518055)

二十二碳六烯酸(DHA)屬于ω-3不飽和脂肪酸家族中的重要成員，含有多個(gè)順式的“戊碳雙烯”結(jié)構(gòu)和5個(gè)活潑的亞甲基[1]。DHA對(duì)人體的生理調(diào)節(jié)和保健具有重要作用。DHA是大腦細(xì)胞膜的重要構(gòu)成成分，可輔助腦細(xì)胞發(fā)育，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞軸突的延伸和新突起的形成有重要作用，能延緩大腦及神經(jīng)衰老。研究表明，高齡大鼠腦內(nèi)的DHA水平低于幼齡鼠，隨著腦內(nèi)DHA水平的恢復(fù)，高齡大鼠學(xué)習(xí)與記憶的能力可提高至接近幼齡鼠[2]。此外，DHA還能抑制血小板聚集，使血栓形成受阻、血液黏度下降，改善血液循環(huán)，治療高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化[3]。DHA可以通過抑制類花生酸的生物合成、調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)通路、影響轉(zhuǎn)錄因子和基因表達(dá)、增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化等方法，抑制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)其分化、凋亡，提高患者的存活率，對(duì)多種癌細(xì)胞發(fā)揮抑制效應(yīng)[4]。

DHA的主要來源是深海魚油(金槍魚油，松魚油[5])。然而，深海魚油產(chǎn)品存在一定缺陷：①市售魚油中的DHA結(jié)構(gòu)屬于乙酯型，對(duì)于嬰兒來說，這種DHA的結(jié)構(gòu)不能被很好吸收與利用[6]；②魚油中DHA與EPA的比例約4∶ 1，該比例能達(dá)到最佳的抗動(dòng)脈粥樣硬化效果[7]，但不利于嬰幼兒的生長發(fā)育[6]；③產(chǎn)品的魚腥味讓眾多消費(fèi)者難以接受。相比動(dòng)物來源，從海洋真菌(如破囊壺菌、裂殖壺菌)中獲取的DHA具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：①微藻類與菌類中所獲取的DHA均為甘油三酯型，對(duì)消化酶的抗性較高，更利于人體吸收利用；②無特殊氣味，其安全性較高，其DHA與EPA的比例大于20∶ 1，不會(huì)對(duì)花生四烯酸產(chǎn)生競爭性抑制，更適合嬰幼兒的使用[6]。與微藻相比，通過裂殖壺菌與破囊壺菌高密度發(fā)酵既可以提高產(chǎn)量，生長速度也較快，不飽和脂肪酸組成較少，是極具工業(yè)前景的DHA來源[8]。

1 裂殖壺菌合成DHA的主要途徑研究

1.1 聚酮合成酶(Polyketide synthase,PKS)途徑

聚酮合成酶(Polyketide synthase,PKS)途徑最早發(fā)現(xiàn)于產(chǎn)EPA的海洋細(xì)菌ShewanellapneumatophoriSCRC-2378中。隨后Mertz等通過同位素標(biāo)記法，得出DHA和EPA是由一個(gè)類似聚酮合成酶的基因簇催化而成的，稱為聚酮合成酶(PKS)途徑[9]。PKS途徑有如下幾個(gè)階段：①脂酰-ACP與丙二酸單酰-ACP在3-酮脂酰-ACP合成酶的作用下縮合生成3-酮脂酰-ACP；②3-酮脂酰-ACP在3-酮脂酰-ACP還原酶作用下加氫還原生成3-羥脂酰-ACP；③3-羥脂酰-ACP在烯脂酰-ACP-脫水酶/異構(gòu)酶的作用下脫去H2O引入雙鍵生成烯脂酰-ACP；④烯脂酰-ACP在烯脂酰-ACP-還原酶(ER)作用下脫氫生成酮脂酰-ACP[10]。裂殖壺菌體內(nèi)PKS途徑合成DHA如圖1所示。

目前，部分裂殖壺菌PKS合成途徑中的相關(guān)基因?qū)崿F(xiàn)了克隆、重組和外源表達(dá)。李清[12]分別對(duì)裂殖壺菌OUCl68的pks1和pks2基因進(jìn)行了克隆，結(jié)果表明：pks1基因?qū)儆赑KS途徑8個(gè)酶域中的脫水/異構(gòu)酶(DH)；pks2基因整個(gè)序列包含兩個(gè)Ketoacyl-synthase的超家族，一個(gè)Acyl transferase超家族，一個(gè)TIM_phosphatebinding超家族。周兵兵[13]通過電轉(zhuǎn)化將含有丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入裂殖壺菌AurantiochytriumlimacinumOUC168，獲得了裂殖壺菌pks1基因部分酶域過表達(dá)菌株，轉(zhuǎn)化菌株生物量提高14.6%，DHA含量提高37.90%。李志平等[14]對(duì)裂殖壺菌Schizochytriumsp．FJU-512?；d體蛋白(ACP)基因的克隆載體pET-30a/acp，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的成功表達(dá)。婁菲等[15]研究發(fā)現(xiàn)，低溫發(fā)酵使裂殖壺菌S31的PFA1、PFA2、PFA3基因表達(dá)水平增長，促進(jìn)了PKS途徑，提高油脂中不飽和脂肪酸的含量。Huang等[16]對(duì)裂殖壺菌的cDNA文庫中8 500多個(gè)基因進(jìn)行克隆測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)與PKS具有重大相關(guān)性的多功能域酶，這些基因以中至高豐度表達(dá)。Cheng等[17]克隆了來自Schizochytriumsp.TIO1101的?；d體蛋白轉(zhuǎn)酰酶(fabD，MCAT，EC2.3.1.39)的cDNA全長，MCAT可以在體外與丙二酰輔酶A結(jié)合并催化丙二?；cACP結(jié)構(gòu)域結(jié)合，生物量和脂肪酸積累分別增長了16.8%和62%。綜上所述，通過將裂殖壺菌PKS合成途徑中的關(guān)鍵作用酶，如丙二酰轉(zhuǎn)移酶、?；d體蛋白等基因重組到裂殖壺菌中，可顯著提高DHA合成，這為基因工程構(gòu)建高效合成DHA的優(yōu)勢(shì)菌株提供了重要思路。

圖1 裂殖壺菌體內(nèi)PKS途徑合成DHA示意圖[11]

1.2 脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FAS)途徑

脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FAS)是一個(gè)由多種酶構(gòu)成的多酶復(fù)合體，在FAS的作用下，乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A經(jīng)過縮合、還原、脫水、還原的循環(huán)，催化合成軟脂酸(16∶ 0)，以酰基載體蛋白作為延長碳鏈的共價(jià)位點(diǎn)，再經(jīng)碳鏈延長酶作用，最終分別形成二十碳四烯酸(ARA)、二十二碳五烯酸(DPA)或二十碳五烯酸(EPA)、DHA等多不飽和脂肪酸[18]。催化脂肪酸生物合成的酶系具有兩種類型FASⅠ和FASⅡ，F(xiàn)ASⅠ存在于哺乳動(dòng)物和酵母中，其中全部的酶活性都分別編碼在一條多肽鏈上，每一步脂肪酸合成反應(yīng)都是由這個(gè)大的蛋白的不同功能域催化完成；FASⅡ存在于細(xì)菌和植物中，是由一系列小的分離的蛋白組成，每一步脂肪酸合成反應(yīng)均是由截然不同的單功能酶催化完成的[19]。微生物體內(nèi)PUFAs的傳統(tǒng)脂肪酸合成途徑如圖2所示。

圖2 微生物體內(nèi)PUFAs的傳統(tǒng)脂肪酸合成途徑(FAS system)示意圖[11]

陳偉[20]比較了葡萄糖和甘油兩種碳源培養(yǎng)條件下裂殖壺菌S056合成DHA的差異，研究發(fā)現(xiàn)甘油為碳源可以使FAS基因過量表達(dá)，DHA含量顯著提高，增幅達(dá)31.75%。程鈺蓉等[21]研究發(fā)現(xiàn)1 mmol/L的丙酮酸脫氫酶可顯著改變Aurantiochytriumsp.SD116的乙酰輔酶A在合成飽和脂肪酸的FAS途徑和合成不飽和脂肪酸的PKS途徑分配比率，導(dǎo)致不飽和脂肪酸含量下降。Metz等[22]通過對(duì)裂殖壺菌的脂肪酸合成酶(FAS)進(jìn)行基因定點(diǎn)突變，突變株不能合成DHA，只能合成游離的脂肪酸，說明FAS合成酶是裂殖壺菌脂肪酸合成所必需的。綜上所述，通過對(duì)裂殖壺菌FAS途徑中的關(guān)鍵作用酶，如FAS合成酶、乙酰輔酶A、脫飽和酶基因進(jìn)行外源表達(dá)和定點(diǎn)突變，證明了FAS途徑是存在于裂殖壺菌中，且能顯著影響DHA合成的一種途徑。

2 培養(yǎng)條件對(duì)裂殖壺菌合成DHA的影響

2.1 營養(yǎng)源對(duì)裂殖壺菌合成DHA的影響

2.1.1 碳源

碳源類型與濃度會(huì)對(duì)裂殖壺菌合成DHA的量產(chǎn)生較大的影響。研究表明，以葡萄糖作為單一碳源時(shí)，一定范圍內(nèi)碳源質(zhì)量濃度的升高(20～80 g/L)，促進(jìn)細(xì)胞的生長和總油脂產(chǎn)生，但過高的碳源濃度不利于細(xì)胞中總油脂的積累[23]。蔣曉艷[24]研究表明甘油有利于Schizochytriumsp. 20888生物量(4.5 g/L)和總脂(1.5 g/L)增長，葡萄糖則利于DHA(350 mg/L)含量增加。李婧[25]研究表明AurantiochytriumlimacinumSR21以葡萄糖和甘油為混合碳源；混合碳源(初始30 g/L葡萄糖進(jìn)料，第3天補(bǔ)加40 g/L葡萄糖+10 g/L甘油，第4天補(bǔ)加20 g/L甘油)的DHA發(fā)酵效率顯著提高，經(jīng)過5 d發(fā)酵，生物量達(dá)41.73 g/L，總脂含量63.85%，DHA含量48.51%，DHA 產(chǎn)量達(dá)12.93 g/L。裂殖壺菌不能利用多糖和二糖作為碳源；當(dāng)選擇單糖作為碳源時(shí)，適當(dāng)?shù)钠咸烟菨舛扔欣贒HA的積累；甘油也可以作為碳源促進(jìn)裂殖壺菌的生長和總油脂的積累；采用葡萄糖和甘油作為混合碳源，比單一碳源更有利于DHA的合成。

2.1.2 氮源

氮源類型與濃度會(huì)顯著影響裂殖壺菌DHA的合成。在培養(yǎng)初期，氮源被大量用于菌體合成，細(xì)胞數(shù)量迅速增加。當(dāng)?shù)聪闹烈欢ǔ潭葧r(shí)，油脂開始大量積累。過高的初始氮源質(zhì)量濃度有利于細(xì)胞的增殖，生物量會(huì)增加，但不利于油脂的合成和DHA的積累[26]。蔣曉艷[24]比較了不同質(zhì)量濃度的谷氨酸鈉對(duì)裂殖壺菌Schizochytriumsp. 20888生長及油脂合成的影響，結(jié)果表明谷氨酸鈉質(zhì)量濃度為8 g/L時(shí)，DHA的累積量最多。康晶等[27]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用玉米糖漿用作Schizochytriumsp.FJU-512的氮源時(shí)，DHA含量最高達(dá)4.1 g/L，酵母粉或谷氨酸作氮源時(shí)，油脂含量最高達(dá)15.1 g/L。劉源[23]研究發(fā)現(xiàn)，碳氮比過高，不利于脂質(zhì)和類胡蘿卜素的合成；碳氮比過低，有利于生物量和類胡蘿卜素含量的提高，但不利于脂質(zhì)積累，且DHA的比例較低。由此可知，氮源種類對(duì)DHA的積累影響顯著，以有機(jī)氮源如谷氨酸鈉、玉米糖漿、酵母粉作為氮源可促進(jìn)油脂的合成；此外，碳氮比也會(huì)顯著影響脂質(zhì)和類胡蘿卜素的合成。

2.2 溫度

溫度對(duì)調(diào)控裂殖壺菌胞內(nèi)代謝及DHA合成有顯著影響。溫度從20℃升高到30℃,裂殖壺菌菌體生長良好；油脂含量在20～30℃之間呈先升高后下降的趨勢(shì)，但均高于15℃時(shí)的水平。37℃下菌迅速衰亡,且油脂含量也較低[28]。王澍等[26]研究發(fā)現(xiàn)，采取雙階段控溫，菌種在26℃下培養(yǎng)48 h后，再將發(fā)酵溫度降到22℃培養(yǎng)120 h，DHA含量為43.62%,相對(duì)26℃條件下提高7.6%。婁菲等[15]發(fā)現(xiàn)，將溫度升高至30℃將降低裂殖壺菌S31 DHA含量，F(xiàn)AS基因的轉(zhuǎn)錄水平高于PKS基因的轉(zhuǎn)錄水平; 將發(fā)酵溫度降低至20℃將增加其DHA含量，PKS基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于FAS基因的轉(zhuǎn)錄水平。綜上可知，低溫能促進(jìn)微生物合成不飽和脂肪酸，這是因?yàn)榈蜏啬茉黾友醯目扇苄?，產(chǎn)生大量胞內(nèi)分子氧，同時(shí)關(guān)鍵酶活性增強(qiáng)，有利于需氧參與的長鏈脂肪酸的去飽和作用。由于微生物培養(yǎng)前期主要是其增殖期，菌體快速生長，后期是油脂積累過程，兩個(gè)階段可以用不同的溫度控制，以達(dá)到最佳發(fā)酵目的。

2.3 無機(jī)鹽及微量元素

無機(jī)鹽作為微生物生長繁殖過程中較為重要的營養(yǎng)物質(zhì)，在構(gòu)成酶活性中心組分、維持細(xì)胞形態(tài)和氧化還原電位等方面具有重要作用。除了對(duì)磷、硫、鎂、鉀等的正常需求以外，裂殖壺菌作為海洋微生物，對(duì)氯化鈉的需求及含量相對(duì)較為敏感。類海水環(huán)境的氯化鈉質(zhì)量濃度20 g/L，利于菌體的生長和 DHA 的積累[20]。滲透脅迫對(duì)裂殖壺菌發(fā)酵產(chǎn)DHA的性能影響較大[29]，研究表明20 g/L NaCl最有利于裂殖壺菌HX-308細(xì)胞生長和DHA積累。裂殖壺菌產(chǎn)DHA需要比較適中的滲透壓環(huán)境，過高或過低都不利于裂殖壺菌發(fā)酵產(chǎn)DHA。在培養(yǎng)基中適量添加 Mn2+、Zn2+、CO2+對(duì)裂殖壺菌的生長速度和 DHA 的累積有顯著促進(jìn)作用[30]，通過調(diào)節(jié)微量元素組合(MnCl2·4H2O 32 mg/L；ZnSO4·7H2O 30 mg/L；CoCl2·6H2O 1.2 mg/L)，裂殖壺菌生物量提高了61.38%，DHA含量提高了47.85%。綜上所述，滲透脅迫及無機(jī)鹽的添加能顯著影響裂殖壺菌的細(xì)胞生長和DHA合成。

2.4 其他前體物質(zhì)或促進(jìn)劑

多不飽和脂肪酸合成的前體物質(zhì)及促進(jìn)劑對(duì)裂殖壺菌DHA合成的促進(jìn)作用顯著。Yokochi等[31]研究發(fā)現(xiàn)SchizochytriumlimacinumSR21能夠利用油酸和亞麻籽油之類的前體物質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞的生物量及油脂積累。王申強(qiáng)等[32]研究表明，同時(shí)添加0.3 mg/L生物素、1 g/L 蘋果酸、0.4 mg/L洛伐他汀時(shí),能夠顯著提高裂殖壺菌發(fā)酵產(chǎn)DHA的產(chǎn)量。在適宜的濃度下，細(xì)胞分裂素6-芐基腺嘌呤(BA)和糠基腺嘌呤(KT)，赤霉素(GA)，以及植物生長素吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)和吲哚乙酸(IAA)對(duì)裂殖壺菌生物量和DHA含量都有不同程度的促進(jìn)作用，其中BA對(duì)DHA合成影響最大，而KT促進(jìn)作用最不明顯[33]。維生素的添加對(duì)裂殖壺菌發(fā)酵產(chǎn)DHA的量有一定的影響，研究發(fā)現(xiàn)：VB12對(duì)菌體內(nèi)油脂含量和油脂內(nèi)DHA含量影響較大，對(duì)生物量沒有明顯影響；VB1對(duì)菌體生物量影響較大，對(duì)菌體內(nèi)油脂含量和油脂內(nèi)DHA含量沒有明顯影響；VB6和VB3則對(duì)這三者都有明顯影響[34]。綜上所述，通過添加棕櫚油、油酸、亞麻籽油等DHA前體物質(zhì)或者適量的促進(jìn)劑(BA、KT、GA等)，對(duì)裂殖壺菌DHA含量有促進(jìn)作用。

3 裂殖壺菌基因組或轉(zhuǎn)錄組研究

3.1 裂殖壺菌基因組測(cè)序

基因組測(cè)序是對(duì)未知基因組序列的物種進(jìn)行個(gè)體的基因組測(cè)序，即是分析包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部DNA分子的堿基序列，可以確定重組DNA的方向與結(jié)構(gòu)，對(duì)突變進(jìn)行定位、鑒定和比較研究。第一代測(cè)序技術(shù)從固定的引物組合成DNA，并在特定堿基處終止其隨機(jī)合成，以獲得分別以A、C、T和G結(jié)尾的不同長度的一系列核苷酸，但該操作煩瑣且昂貴，并且不能滿足大規(guī)模測(cè)序的需要。第二代測(cè)序技術(shù)以焦磷酸測(cè)序?yàn)槔兄咄?、低成本的?yōu)點(diǎn)。通過在由4種酶(TP硫酸化酶，DNA聚合酶，腺苷三磷酸雙磷酸酶和熒光素酶)組成的相同催化反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行酶聯(lián)發(fā)光反應(yīng)，對(duì)已知的短序列進(jìn)行測(cè)序分析?；诩{米孔水平的單分子閱讀平臺(tái)的第三代測(cè)序技術(shù)每次可以讀取數(shù)百萬個(gè)序列。因此，就測(cè)序讀取長度而言，第三代測(cè)序技術(shù)從第一代和第二代測(cè)序技術(shù)邁出了一大步，但其尚未被廣泛使用[35-36]。在基礎(chǔ)生物學(xué)研究及應(yīng)用領(lǐng)域(如微生物學(xué)、合成生物學(xué)、生物系統(tǒng)學(xué))，基因組測(cè)序已成為不可缺少的手段。

目前進(jìn)行基因組測(cè)序的裂殖壺菌及獲得的與脂肪酸合成相關(guān)結(jié)果如表1所示。

綜上所述，通過研究裂殖壺菌全基因組可明晰DHA的生物合成途徑及關(guān)鍵酶基因，為研究DHA的形成和調(diào)節(jié)機(jī)制提供重要依據(jù)，為高效合成DHA及基因工程改造菌株奠定理論基礎(chǔ)。

3.2 裂殖壺菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是通過新一代高通量測(cè)序技術(shù)，得到特定細(xì)胞在某一狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出的所有RNA序列信息。轉(zhuǎn)錄組研究是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn)，是研究基因表達(dá)的主要手段，同時(shí)也是連接基因組遺傳信息與生物功能的蛋白質(zhì)組的重要紐帶。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是目前研究最多的，也是生物體最重要的調(diào)控方式。目前用于研究轉(zhuǎn)錄組的方法主要包括：①基于雜交的方法，如cDNA芯片，寡核苷酸芯片等；②基于測(cè)序技術(shù)，如Sanger測(cè)序的SAGE(Serial analysis of gene expression)和MPSS(Massively parallel signature sequencing)，全長cDNA文庫和EST(Expressed sequence tag)文庫測(cè)序分析；③RNA-Seq是第二代測(cè)序技術(shù)。與其他測(cè)序技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：高通量，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，不僅可以獲得數(shù)個(gè)甚至數(shù)十億個(gè)堿基序列，而且可以實(shí)現(xiàn)覆蓋所有轉(zhuǎn)錄組的要求；高分辨率，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可以高精度地區(qū)分單堿基，可以有效避免微陣列雜交的熒光模擬信號(hào)引起的背景噪聲，交叉反應(yīng)等問題；高靈敏度，這種測(cè)序技術(shù)可以檢測(cè)細(xì)胞中稀有轉(zhuǎn)錄物的稀有拷貝[45]。

目前進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的裂殖壺菌及獲得的與脂肪酸合成相關(guān)結(jié)果如表2所示。

表1 進(jìn)行基因組測(cè)序的裂殖壺菌及獲得的與脂肪酸合成相關(guān)結(jié)果

表2 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的裂殖壺菌及獲得的與脂肪酸合成相關(guān)結(jié)果

綜上所述，目前對(duì)不同限制條件下的菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，DHA合成關(guān)鍵酶基因的上調(diào)(FAS基因，編碼乙酰輔酶A羧化酶基因等)或下調(diào)(脂肪酸合酶，3種多不飽和脂肪酸合酶亞基等)都會(huì)對(duì)DHA合成產(chǎn)生顯著影響。

4 結(jié)束語

裂殖壺菌合成DHA主要有聚酮合成酶(Polyketide synthase,PKS)途徑和脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FAS)途徑。通過基因工程技術(shù)，使DHA合成途徑中的關(guān)鍵酶基因在裂殖壺菌中過表達(dá)可促進(jìn)DHA合成；培養(yǎng)條件的優(yōu)化，如碳源、氮源、碳氮比、溫度、滲透壓、微量元素、前體物質(zhì)及促進(jìn)劑等對(duì)DHA的合成影響顯著；利用生物信息學(xué)技術(shù)如基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，為明晰裂殖壺菌DHA的生物合成途徑及關(guān)鍵作用酶提供了重要的數(shù)據(jù)支撐，為構(gòu)建基因工程藻株奠定了理論基礎(chǔ)。近年來，DHA的需求逐年增加，DHA相關(guān)產(chǎn)品市場(chǎng)潛力巨大。但我國企業(yè)存在產(chǎn)能低下，產(chǎn)品純度不高，國際競爭力較低等瓶頸問題。當(dāng)下，我們除了優(yōu)化高密度發(fā)酵參數(shù)以外，也要關(guān)注優(yōu)良菌種的選育，從源頭上解決我國DHA純度低、難分離、高成本的現(xiàn)象。