高效液相色譜法同時(shí)測定博落回注射液中血根堿和白屈菜紅堿的含量

趙有軒，張傳津，張志民，章安源

（山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，濟(jì)南250022）

博落回注射液主要含有血根堿和白屈菜紅堿等生物堿，具有抗菌消炎、潤腸止瀉的功能，主要用于仔豬黃白痢的防治［1-3］。博落回注射液現(xiàn)收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2017 年版［4］）中藥卷中，質(zhì)量控制主要是采用薄層色譜法對其中的血根堿和白屈菜紅堿進(jìn)行鑒別，結(jié)合紫外-可見分光光度法測定吸光度值作限度檢查，未對這兩種有效成分進(jìn)行含量測定。該制劑為罌粟科博落回（Macleaya cordata（Willd.）R.Br.）的果實(shí)經(jīng)提取分離制成的生物堿硫酸鹽水溶液。因博落回果原料稀缺，制劑工藝相對復(fù)雜，導(dǎo)致該產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。為有效控制該產(chǎn)品質(zhì)量，本文經(jīng)過探索嘗試，建立了高效液相色譜法同時(shí)測定博落回注射液中血根堿和白屈菜紅堿含量的方法［4-11］。結(jié)果顯示：本方法具有操作簡單、分離迅速、靈敏度高等特點(diǎn)，可以用于博落回注射液中血根堿和白屈菜紅堿的測定。

1 材料與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，配PDA檢測器（安捷倫，美國）；U-3900紫外分光光度計(jì)（日立，日本）；BP211D分析天平 （賽多利斯，德國）；PB-10酸度計(jì)（賽多利斯，德國）；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)（密理博，美國）。

1.2 藥品與試劑 鹽酸血根堿，批號：510001-201101，含量：99.3%，來源：中國食品藥品檢定研究院；白屈菜紅堿，批號：111718-200501，含量：100%，來源：中國藥品生物制品檢定所。甲醇，乙腈均為色譜純；三乙胺、磷酸和鹽酸均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL／min；流動(dòng)相：乙腈-0.2%三乙胺溶液（磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5），二極管陣列檢測器，檢測波長：270 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液制備 稱取鹽酸血根堿100 mg，置于10 mL容量 瓶中，稱取白屈菜紅堿100 mg，置于另一10 mL容量瓶中，分別加甲醇-1.0%鹽酸溶液（50 ∶50）溶解，稀釋至刻度，即分別得血根堿和白屈菜紅堿對照品貯備液。

2.2.2 供試品溶液制備 博落回注射液三批，分別為：批號-2018122411，來源：山東華爾康獸藥有限公司；批號-20180901，來源：山東圣旺藥業(yè)股份有限公司；批號-20180201，來源：山西省芮城科龍獸藥有限公司。分別精密量取博落回注射液5 mL，加甲醇-1.0%鹽酸溶液（50 ∶50）稀釋至100 mL，搖勻，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn)色譜圖 在上述色譜條件下，確定陰性對照色譜圖，血根堿和白屈菜紅堿的色譜圖以及博落回注射液色譜圖，如下圖1，圖2，圖3所示。

2.4 線性關(guān)系考察 吸取上述對照品溶液逐級稀釋，分別制成 0.5、1、5、10、100 μg／mL 的血根堿溶液和 0.25、0.5、2.5、5、50 μg／mL 的白屈菜紅堿溶液，分別取10 μL進(jìn)樣，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，血根堿、白屈菜紅堿濃度X（μg／mL）為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。血根堿的回歸方程為Y＝33.932X-2.512，R2＝1.000；白屈菜紅堿的回歸方程為 Y ＝69.419X-7.380，R2＝1.000，相關(guān)系數(shù)良好。 （見圖 4、圖5）

2.5 添加回收試驗(yàn) 精密量取博落回注射液1 mL，置20 mL容量瓶中，分別加2 mL血根堿對照品貯備液和1 mL白屈菜紅堿對照品貯備液，加甲醇-1.0%鹽酸溶液（50 ∶50）稀釋至刻度，取10 μL上機(jī)檢測，血根堿的回收率在95% ～100%之間，見表1；白屈菜紅堿的回收率在97% ～99%之間，見表2，均滿足準(zhǔn)確度的要求。

圖1 陰性對照色譜圖Fig 1 Chromatogram of negative control

圖2 對照品中血根堿和白屈菜紅堿色譜圖Fig 2 Chromatogram of sanguinarine and chelerythrine in reference solution

圖3 博落回注射液中的血根堿和白屈菜紅堿色譜圖Fig 3 Chromatogram of sanguinarine and chelerythrine in Macleaya Cordata injection

圖4 血根堿線性曲線Fig 4 Standard curve of sanguinarine

圖5 白屈菜紅堿線性曲線Fig 5 Standard curve of chelerythrine

表1 血根堿添加回收結(jié)果Tab 1 Results of recovery for sanguinarine

表2 白屈菜紅堿添加回收結(jié)果Tab 2 Results of recovery for chelerythrine

2.6 精密度試驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下對照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)6針，計(jì)算血根堿和白屈菜紅堿峰面積的 RSD，其中血根堿為0.56%，白屈菜紅堿為0.22，精密度良好。 如表3，表4所示。

表3 博落回注射液中血根堿精密度試驗(yàn)（n＝6）Tab 3 Precision test of sanguinarine in Macleaya Cordata injection （n＝6）

表4 博落回注射液中血白屈菜紅堿精密度試驗(yàn)（n＝6）Tab 4 Precision test of chelerythrine Macleaya Cordata injection （n＝6）

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下對照品溶液，按照2.1 項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h 下進(jìn)樣，測定不同時(shí)間下的峰面積，RSD（n＝5），其中血根堿0.52%，白屈菜紅堿0.23%，表明對照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 樣品測定 取2.2.2項(xiàng)下的3批博落回注射液，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算血根堿和白屈菜紅堿的含量，三批的血根堿含量分別是 97.65、100.32、100.96 μg／mL，白屈菜紅堿含量分別是 50.99、49.03、48.53 μg／mL。

3 討論與結(jié)論

3.1 流動(dòng)相的選擇 按照《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003年版［3］）上博落回提取物的液相標(biāo)準(zhǔn)選擇梯度洗脫，流動(dòng)相 A：乙腈，流動(dòng)相 B：0.2%三乙胺（磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5），發(fā)現(xiàn)在白屈菜紅堿位置處基線漂移嚴(yán)重，影響了白屈菜紅堿的峰形，根據(jù)參考文獻(xiàn)［6］，改成等度洗脫，流動(dòng)相乙腈 -0.2%三乙胺（磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5），洗脫效果良好。

3.2 pH的選擇 根據(jù)《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003年版［3］）和參考文獻(xiàn)［6］，選擇 pH2.0，2.5，3.0 幾個(gè)值進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)pH在2.0時(shí)，血根堿峰有拖尾，pH在3.0時(shí)，基線不平穩(wěn)，而pH在2.5時(shí)，分離效果好，峰形最好，基線平穩(wěn)，可達(dá)到最佳分離效果。

3.3 波長選擇 分別取血根堿和白屈菜紅堿對照品溶液，經(jīng)紫外-可見分光光度計(jì)法測定吸收波長，顯示血根堿在270和330 nm處有最大吸收，白屈菜紅堿在270和320 nm處有最大吸收，在270 nm下同時(shí)測定血根堿和白屈菜紅堿，結(jié)果顯示在270 nm下有較高吸收值，且分離度良好。所以選擇270 nm作為檢測波長。

《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2017年版［4］）上只有鑒別的方法，能定性，但是無法定量。根據(jù)本方法建立的液相方法可以快速測定血根堿和白屈菜紅堿，省去了薄層鑒別的繁瑣處理過程，達(dá)到快速測定含量的目的。相對于參考文獻(xiàn)［6，8］，優(yōu)化了液相色譜條件，為了增加對照品的溶解性，改變了稀釋劑，經(jīng)過一系列優(yōu)化和探索，回收率和精密度均有明顯變好，峰形較之前有明顯改善。

綜上所述，本方法具有操作簡單、分離迅速、靈敏度高等特點(diǎn)，可用于博落回注射液中血根堿和白屈菜紅堿的測定。