博落回和小果博落回不同部位中生物堿類成分的比較△

劉秀斌，黃嘉璐，鄭亞杰*，劉薇，2，唐昭山，曾建國，2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 分析測試中心，湖南 長沙 410128；3.湖南美可達生物資源股份有限公司，湖南 長沙 410005)

·基礎(chǔ)研究·

博落回和小果博落回不同部位中生物堿類成分的比較△

劉秀斌1，黃嘉璐1，鄭亞杰1*，劉薇1，2，唐昭山3，曾建國1，2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 分析測試中心，湖南 長沙 410128；3.湖南美可達生物資源股份有限公司，湖南 長沙 410005)

目的比較博落回屬植物博落回和小果博落回不同部位中生物堿隨生長期積累的動態(tài)量化規(guī)律，為博落回屬資源品質(zhì)評價和合理利用提供依據(jù)。方法采用HPLC對不同藥用部位中血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿和別隱品堿的含量進行測定，并對數(shù)據(jù)進行比較分校。結(jié)果在根、莖、葉和果實不同部位中，兩種植物的果實中生物堿類化合物量均為最多；莖中積累生物堿的量最少；根中積累較多的原阿片堿；生物堿在葉中的積累具有顯著的種屬特異性；另外，小果博落回果實中別隱品堿的量遠高于其他生物堿。結(jié)論該研究為博落回屬植物資源的綜合利用提供了有力的科學(xué)依據(jù)，由于生物堿類成分在該屬植物中的累積具有種屬特異性，在植物資源利用方面需要綜合考慮具體的藥用部位及其生物量。

博落回；小果博落回；生物堿；藥用部位；高效液相色譜

博落回Macleayacordata(Willd.)R.Br.和小果博落回M.microcarpa(Maxim.)Fedde.是罌粟科博落回屬(MacleayaR.Br.)多年生直立草本植物，全草入藥，具有殺蟲、消腫等功效。生物堿類化學(xué)成分，如血根堿(Sanguinarine，SAN)、白屈菜紅堿(Chelerythrine，CHE)、原阿片堿(Protopine，PRO)、別隱品堿(Allocryptopine，ALL)等是博落回與小果博落回的主要藥效成分，現(xiàn)代藥理研究表明它們具有殺菌、殺蟲、消炎、抗病毒和抗腫瘤等作用[1-4]。作為同屬植物，兩者外在形態(tài)具有明顯差異，比如博落回的果實呈倒卵形，而小果博落回的果實呈近圓形，博落回葉片的裂要深于小果博落回。由于生物堿類化學(xué)成分的分布具有組織特異性，不同部位中所含的生物堿類成分有所不同，博落回根、莖、葉和果實在不同時期所含生物堿的種類和含量不同[5-7]，小果博落回的根、莖、葉和果實中生物堿種類和所累積的含量也存在很大的差異[8-9]。博落回和小果博落回葉中生物堿含量進行比較研究，發(fā)現(xiàn)前者所含原阿片堿與別隱品堿較高，后者中白屈菜紅堿與血根堿含量較高[10]，而它們的根中富集量最高的是別隱品堿[11]。前期研究表明小果博落回與博落回中的主要生物堿(原阿片堿、別隱品堿、白屈菜紅堿、血根堿)的積累分布具有明顯的組織特異性[12]。博落回的果莢和小果博落回的葉片中主要積累血根堿和白屈菜紅堿，而博落回葉片、根和小果博落回果莢中主要積累原阿片堿和別隱品堿，兩者的莖主要作為運輸器官，積累著少量的4個生物堿。植物體內(nèi)次生代謝物隨著生長期呈動態(tài)變化，系統(tǒng)地開展博落回屬植物不同部位中生物堿類成分隨生長時間變化的研究，對全面了解該屬植物的生物堿分布情況及資源利用尤為重要。

為了更全面地了解博落回屬不同植物生物堿類成分在不同器官的分布，本研究在前期工作基礎(chǔ)上對博落回和小果博落回不同部位中4個生物堿(SAN、CHE、PRO和ALL)隨生長時間的變化進行研究，為該屬植物系統(tǒng)的品質(zhì)評價及植物資源的合理利用提供充分的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；電子分析天平[梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司]；超聲波清洗儀(昆山市超聲波儀器有限公司)；Milli-Q純化水系統(tǒng)(美國Millipore)。

1.2 材料與試藥

博落回不同部位樣品于2011年采自安徽六安，小果博落回不同部位樣品于2011年采自河南洛陽。

鹽酸血根堿(純度：99.3%)、白屈菜紅堿(純度：80.5%)、原阿片堿(純度：99.7%)購自中國食品藥品檢定研究院。別隱品堿(純度：98%)由實驗室分離純化所得。甲醇、乙腈(美國TEDIA，色譜純)，超純水由實驗室Milli-Q純化水系統(tǒng)自制，磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純)。

2 方法

2.1 色譜條件

月旭XBridge C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)，梯度洗脫見表1，流速為1 mL·min-1，進樣量為5 μL，柱溫35 ℃，檢測波長為284 nm。

表1 梯度洗脫色譜條件

2.2 樣品預(yù)處理

所采收的各部位樣品采收后進行曬干處理。

2.3 供試品溶液

取約1.0 g，精密成定，分別置于250 mL的具塞錐形瓶中，加入甲醇-1%鹽酸水溶液(50∶50)100 mL，稱定重量，超聲提取1 h(超聲溫度為35 ℃，功率為33 kHz)后取出放冷至室溫，補足失重，離心，取上清液用0.45 μm濾膜過濾，備用。

2.4 對照品溶液的制備

分別稱取鹽酸血根堿、CHE、PRO和ALL適量，置于50 mL容量瓶中，加少量甲醇超聲溶解，冷卻后以甲醇定容，配成質(zhì)量濃度約為0.5 mg·mL-1的SAN、CHE、PRO、ALL的儲備液，冰箱冷藏保存。

2.5 樣品測定

將配制好的供試品和對照品溶液，按照2.1方法進行檢測，將上述各對照品對應(yīng)的峰面積值代入各自的標準曲線方程，計算出供試品溶液的質(zhì)量濃度值，結(jié)合稀釋倍數(shù)和樣品稱樣量，計算各指標成分在樣品中的量(mg·g-1)。將不同樣品中所含各指標成分求和，計算總生物堿量(mg·g-1)。

3 結(jié)果與分析

3.1 檢測方法

參照湖南省地方標準中博落回4個生物堿的HPLC檢測方法[13]，色譜圖見圖1。

注：A.對照品；B.博落回果實。圖1 博落回果實及對照品HPLC圖

3.2 標準曲線及范圍

精密吸取2.4配制的儲備液5、2、1、0.5、0.2 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。按上述2.1色譜條件測定峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標，原阿片堿、別隱品堿、血根堿和白屈菜紅堿質(zhì)量濃度(X)為橫坐標繪制標準曲線，計算回歸方程：原阿片堿Y=6 734 305X-33 278，r=0.999 7；別隱品堿Y=5 421 540X-16 806，r=0.999 9；血根堿=5 421 540X-16 806，r=1.000；白屈菜紅堿Y=29 237 979X-195 609，r=0.999 9。結(jié)果表明原阿片堿在0.010 3～0.515 0 mg·mL-1、別隱品堿在0.010 2～0.511 0 mg·mL-1、血根堿在0.010 2～0.511 0 mg·mL-1、白屈菜紅堿在0.010 5～0.525 0 mg·mL-1均具有良好的線性關(guān)系。

3.3 樣品測定

3.3.1 總生物堿在博落回和小果博落回不同部位的含量差異 博落回和小果博落回同為罌粟科博落回屬植物，從圖2中可以看出總生物堿在兩種植物體內(nèi)的分布，均以果實中含量最高，莖中含量最低。在博落回植物中，不同部位中所含總生物堿的量由高到低依次為果實>葉>根>莖(見圖2A)，小果博落回(見圖2B)中總生物堿在不同部位的分布由高到低依次為果實>根>葉>莖。

注：A.博落回；B.小果博落回。圖2 博落回和小果博落回不同部位中總生物堿變化圖

3.3.2 根中4個生物堿的含量比較 根是博落回屬植物生物堿類化學(xué)成分的主要合成器官[12]，在植物生長周期內(nèi)持續(xù)不斷地合成生物堿類次生代謝產(chǎn)物，并輸送到其他器官組織中以抵御病蟲害的侵蝕或食草動物的啃食。通過圖3A和3B的比較發(fā)現(xiàn)，在博落回和小果博落回根中自春天葉子長出(4月)開始至地上部分干枯(10月)，盡管4個生物堿成分均呈現(xiàn)出不同的動態(tài)變化趨勢，但是4個生物堿在兩種植物根部的積累趨勢確存在一定的相似性，比如所積累的ALL>PRO>CHE≈SAN，并且積累的ALL和PRO的量均高于SAN和CHE的量，在6月和 7月份各生物堿量都達到峰值，該研究結(jié)果所反映出根中對生物堿的積累趨勢與文獻報道一致[11]。

3.3.3 莖中4個生物堿的含量比較 通常莖具有輸導(dǎo)營養(yǎng)物質(zhì)和水分，以及支撐葉、花和果實在一定空間的生長作用。從圖3C和3D中發(fā)現(xiàn)，兩種植物莖中所含4個生物堿的量差異不大?？v觀圖1，在相同植物物種的根、莖、葉和果等不同器官中，4個生物堿在莖中的分布最少，每克干物質(zhì)中所含單個生物堿類成分最高不超過8 mg·g-1，在莖質(zhì)地較幼嫩的營養(yǎng)生長期各生物堿含量相對較高，在進入花期之后略有下降。

3.3.4 葉片中4個生物堿的含量比較 葉片是植物進行光合作用、制造養(yǎng)料、進行氣體交換和水分蒸騰的重要器官，同時也是博落回屬植物合成生物堿類次生代謝產(chǎn)物的器官之一[12]。通過比較圖3E和3F，發(fā)現(xiàn)博落回葉積累的4個生物堿含量由高到低為ALL≥PRO>SAN≈CHE，小果博落回葉所積累的4個生物堿含量由高到低為SAN≥CHE>ALL≈PRO。有趣的是博落回和小果博落回葉中富集的生物堿含量高低次序相反，即在博落回葉中ALL和PRO含量高于SAN和CHE，而小果博落回葉中SAN和CHE含量高于ALL和PRO，表明生物堿的積累具有種屬差異，該研究結(jié)果與郭宇鴿等的研究結(jié)果相一致[10]。研究中發(fā)現(xiàn)6月中旬后博落回和小果博落回下部葉片部分變枯脫落，博落回和小果博落回葉在5月中旬6月初時生物量最大，博落回葉中此時PRO和ALL含量總量較高，適用于作為生產(chǎn)ALL4和PRO4的原料；小果博落回葉此時SAN和CHE含量總量最高，適用生產(chǎn)SAN和CHE的原料。

3.3.5 果實中4個生物堿的含量比較 從圖1中已知果實中特異性地富集了更多的生物堿類化合物，但是兩種植物果實中生物堿類別還存在很大的差異。比較圖3G和3H，發(fā)現(xiàn)小果博落回中所含PRO遠高于其他3個生物堿；博落回果實中差異相對較小，在7月初幼果期博落回果實中SAN和CHE含量最高，但此時生物量最少，不適合采摘，7月底博落回果實成熟后SAN和CHE總量高于原阿片堿和別隱品堿的總量，且生物量最大，因此7月底8月初的博落回果實適合用于生產(chǎn)SAN和CHE的原料。

注：A.博落回根；B.小果博落回根；C.博落回莖；D.小果博落回莖；E.博落回葉；F.小果博落回葉；G.博落回果；H.小果博落回果。圖3 博落回和小果博落回不同部位中不同生物堿隨生長時間的變化趨勢圖

4 討論

博落回和小果博落回為同屬不同種植物，在不同藥用部位和不同生長期兩者所含生物堿種類和含量存在較為顯著的差異，尤其是葉和果實。因此在藥材資源利用時需要結(jié)合采收時間和藥用部位的具體情況做出決定。

生物堿類次生代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)隨生長時間呈現(xiàn)動態(tài)變化，在不同的生長時期所在不同藥用部位中富集的生物堿量會有所不同。博落回和小果博落回均為全草入藥，但從總生物堿含量來看，果實中特異性地富集了更多生物堿。這提示在藥材種植過程中，6月后博落回和小果博落回葉片會有部分脫落造成資源的浪費，為了充分利用藥材資源，建議從6月開始采收部分博落回和小果博落回葉片，在7月底至8月初果實成熟時，再進行全草采收或分不同藥用部位進行采收。

果實是博落回和小果博落回植物中生物堿成分的主要富集器官，但是該部位在整株植物的生物量中占比很小，如果僅利用果實作為有效成分提取原料，必然會造成植物資源的巨大浪費。但實際生產(chǎn)中，從不同藥用部位或全草中提取有效成分的生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)成本也存在很大不同，所以大生產(chǎn)過程中需要根據(jù)原料的采收期和采收部位選擇不同生產(chǎn)工藝。

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DifferentiationofAlkaloidsinDifferentPartsbetweenMacleayacordataandM.microcarpa

LIU Xiubin1，HUANG Jialu1，ZHENG Yajie1*，LIU Wei1，2，TANG Zhaoshan3，ZENG Jianguo1，2

(1.NationalandLocalUnionEngineeringResearchCenterfortheVeterinaryHerbalMedicineResourcesandInitiative，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；2.CenterofAnalyticService，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；3.MicolltaBioresourceInc，Changsha410005，China)

Objective：To compare the dynamic accumulation of alkaloids in different parts ofMacleayacordataandM.microcarpain the growing period，and provide scientific basis for quality evaluation and rational resources utilization.MethodsThe contents of sanguinarine，berberine，chelerythrine and allocryptopine in different medicinal parts were determined and compared.ResultsThe accumulation of alkaloids in the fruits of two species were more than that in other parts，and stems accumulated the least alkaloids，and leaves accumulated species-specifically protopine.In addition，allocryptopine in the fruit ofM.microdatawas much more than other alkaloids.ConclusionThis study provides a strong scientific basis for comprehensive utilization ofM.cordata.Due to the specie-specific accumulation of alkaloids，it needs to consider the specific medicinal parts and biomass as utilization of its plants resources.

Macleayacordata；Macleayamicrocarpa；alkaloids；medicinal part；HPLC

國家自然科學(xué)基金(31600238)；湖南省研究生科研創(chuàng)新項目(CX2014B302)；湖南省自然科學(xué)基金(2016JJ4040)；湖南省教育廳科學(xué)研究項目(16C0769)；湖南省科技重點計劃(2016SK3002)

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鄭亞杰，高級工程師，研究方向：藥用植物中功能成分分析及發(fā)現(xiàn)；Tel：(0731)84618103，E-mail：zhengyj4@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.10.006

2017-02-20)